同位素标记相对和绝对定量技术研究进展

定量蛋白质组学是蛋白质研究的前沿学科。目前常用的定量蛋白质组学研究技术有荧光差异凝胶电泳（DIGE）、同位素亲和标记（ICAT）等。同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术。结合非凝胶串联质谱技术,该技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究,具有较好的定量效果、较高的重复性,并可对多达四种不同样本同时进行定量分析。本文对 iTRAQ 技术的原理、实验方法及应用进展进行了综述。     

同位素标记相对和绝对定量蛋白组技术研究进展

近年来定量蛋白组学技术迅速发展,目前常用的有双向荧光差异凝胶电泳、同位素亲和标记、15N同位素标记、同位素标记相对和绝对定量和细胞培养条件下稳定同位素标记技术等。同位素标记相对和绝对定量技术以其高通量、高灵敏度、高重复性、高动态检测限和能对各种复杂样品进行相对和绝对定量研究等优势而备受研究者青睐,目前已发展到在同一实验中分析8组样品,增加了实验设计的灵活性。我们就同位素标记相对和绝对定量技术在定量蛋白组史中的地位作用、研究策略,以及在病毒致病机制研究和医药临床相关问题中的应用做简要综述。     

相对定量和绝对定量-以CsSAMDC基因表达分析为例

以无芒隐子草干旱诱导的cDNA文库中获得的SAMDC序列为基础,应用实时荧光定量RT-PCR技术同时结合相对定量和绝对定量方法,以分析无芒隐子草SAMDC基因在不同组织、不同胁迫梯度下的表达为案例,详细介绍并比较相对定量和绝对定量在基因表达方面的应用.分别采集无芒隐子草幼苗自然干旱0,2,4,6,8,10d以及恢复浇水1,4d的叶片和根系材料,相对定量采用2-ΔΔCT.法;以相应基因的质粒扩增产物为标准品制作标准曲线,对定量PCR的引物浓度进行了优化,而后筛选最稳定的内参基因,以内参基因获得的标准化因子对绝对定量数据进行标准化.相对定量2-ΔΔCT法结果显示CsSAMDC基因在干旱胁迫8d后,叶片中的表达量为胁迫前的0.62±0.13倍,根中的表达量为胁迫前的5.93±0.71倍.绝对定量表明,CsSAMDC基因只在胁迫第8d和第10d的根组织中检测到表达量显著增大,胁迫第4～6d和恢复浇水后1～4d,CsSAMDC基因在叶和根组织中的表达较对照降低.相对定量和绝对定量在DsSAMDC基因表达研究中显示相对一致的趋势.     

高精度相对和绝对定量的等量异位标签在定量蛋白质组学研究中的新进展

蛋白质组学逐渐从定性研究转向定量研究。在定量蛋白质组学技术中,相对和绝对定量的等量异位标签(Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)是应用最广泛的技术之一,具有通量高、稳定性强及不受样品来源制约等优点,几乎可以对任意样品进行标记,而且可以同时对多达8个样品进行定量分析,有效地提高了通量。iTRAQ技术不断改进,其定量准确性显著提高,适用的平台越来越多,为微生物、动物、植物、生物医学领域蛋白质及其翻译后修饰组研究创造了条件。文中综述了高精度iTRAQ技术在定量蛋白质组学研究中的最新发展及其应用。     

饥饿状态大鼠胰腺高血糖素和胰岛素变化的定量分析

用免疫组织化学方法结合图象分析技术对饥饿状态大鼠胰岛Ａ、Ｂ细胞中胰因糖素和胰岛素的免疫反应强度进行定量分析。结果表明：与正常对照相比,饥饿大鼠胰岛细胞中的Ｇｌｕ含量明显下降,Ｂ细胞中Ｉｎｓ含量明显升高。提示饥饿可导致Ｇｌｕ释放增加,Ｉｎｓ和减少。与饥饿５天大鼠线要比较,饥饿５天后静脉注射葡萄糖组９０ｍｉｎ后胰岛内Ｇｌｕ含量明显升高,Ｉｎｓ含量无显著变化。提示：静脉注射葡萄糖要快速作用下胰岛Ａ细胞,     

饥饿状态大鼠胰腺胰高血糖素和胰岛素变化的定量分析

用免疫组织化学方法结合图象分析技术对饥饿状态大鼠胰岛Ａ、Ｂ细胞中胰高血糖素（Ｇｌｕｃａｇｏｎ,Ｇｌｕ）和胰岛素（Ｉｎｓｕｌｉｎ,Ｉｎｓ）的免疫反应强度进行定量分析。结果表明：与正常对照相比,饥饿大鼠胰岛Ａ细胞中的Ｇｌｕ含量明显下降,Ｂ细胞中Ｉｎｓ含量明显升高。提示饥饿可导致Ｇｌｕ释放增加,Ｉｎｓ释放减少。与饥饿５天大鼠组相比较,饥饿５天后静脉注射葡萄糖组９０ｍｉｎ后胰岛内Ｇｌｕ含量明显升高,Ｉｎｓ含量无显著变化。提示：静脉注射葡萄糖可快速作用于胰岛Ａ细胞,减少Ｇｌｕ释放,但其对Ｂ细胞作用缓慢。从而为进一步阐明葡萄糖对胰岛Ａ、Ｂ细胞的不同作用机制提供形态学依据。     

吗啡成瘾大鼠胰腺外分泌的变化

本实验采用急性吗啡成瘾法,观察了吗啡成瘾大鼠在整体胰导管引流和离体胰片灌流条件下,胰腺对ＣＣＫ８刺激的反应。结果如下：（１）吗啡成瘾大鼠对ＣＣＫ８诱导的淀粉酶分泌反应降低;（２）吗啡成瘾大鼠胰腺组织中淀粉酶含量降低。提示吗啡成瘾大鼠胰淀粉酶合成受到抑制。     

气候变化和人为活动在宁夏草地变化中的相对作用

气候变化和人为活动是草地生态系统退化或恢复过程中的两大驱动因素。选取植被净初级生产力（NPP）为衡量指标,利用改进的Carnegie-Ames-Stanford Approach （CASA）模型、Thornthwaite Memorial模型以及残差趋势法分别计算了宁夏草地实际净初级生产力（ANPP）、潜在净初级生产力（PNPP）和人为活动影响的生产力（HNPP）及其变化趋势,定量评估了2001-2019年气候变化和人为活动在宁夏4种类型草地（温性草甸、温性草原、温性荒漠草原和温性草原化荒漠）动态变化中的相对作用。结果表明,2001-2019年宁夏草地实际净初级生产力增加的面积占宁夏草地总面积的97.84%;全区草地潜在净初级生产力均表现为增加趋势,表明气候变化有利于植被恢复。草地恢复过程中,气候变化引起的草地恢复面积占草地恢复总面积的61.68%,气候变化和人为活动共同作用引起的草地恢复面积占38.32%;人为活动是导致草地退化的绝对主导因素。4种类型草地动态变化的驱动因素存在差异,气候变化是促进温性草甸（68.94%）和温性草原化荒漠（70.51%）恢复的主导因素,气候变化和人为活动共同作用是促进温性草原恢复的主导因素（62.30%）,温性荒漠草原的恢复是气候变化和人为活动共同作用的结果（97.93%）。水热条件好转,尤其是降水增加是宁夏草地恢复的主导气候因子,生态保护政策的实施是促进草地恢复的主要人为因素,对草地的不合理利用是导致草地退化的主要人为因素。     

胰泌素和Lundh度餐刺激狗胰腺变化的超声研究

本文用特制的Ｌｕｎｄｈ度餐作为胰腺分泌的刺激剂,并通过超声来观察胰腺分泌的情况,,与并胰泌素的作用相比较。结果发现,Ｌｕｎｄｈ试餐与胰泌不一样可使胰腺增大,胰管扩张,并可经超声定量记录此改变,提示此方法可胰腺的外分泌功能,将功能检查和形态检查结合起来。     

小鼠胰腺大部分切除后再生集中区来源的初步探索

目的：探讨胰腺在某些损伤或病理条件下,由于细胞活跃增殖产生再生集中区域的细胞来源。方法：将27只成年ICR系小鼠分为9组,每组3只,其中1组进行假手术,其余8组进行小鼠胰腺大部分切除,分别在切除后12h,24h、36h、48h、3d、5d、7d、10d取材及冰冻切片,采用H-E染色、免疫荧光染色方法检测损伤后各时间段胰腺组织的形态变化和细胞增殖率。结果：H-E染色发现,胰腺手术72h后,剩余胰腺中就出现由细胞角蛋白阳性导管样结构组成的再生集中区,此区域细胞随后分化为功能性细胞类型,10d后消失检测不到。对胰腺再生集中区的定位研究表明,它们仅出现于切除后的伤口边缘。BrdU标记表明,胰腺再生集中区为细胞快速增殖区域,其出现与总导管增殖率提高同时发生,主/大导管和小导管增殖率上升都晚于再生集中区的出现。结论：小鼠胰腺大部分切除后再生集中区可能来源于腺泡细胞的快速增殖,而不是经由总-主/大-小导管-快速增殖区这一途径引起的来源于导管上皮细胞。     

胰泌素和Lundh试餐刺激狗胰腺变化的超声研究

本文用特制的Lundh试餐作为胰腺分泌的刺激剂,并通过超声来观察胰腺分泌的情况,并与胰泌素的作用相比较。结果发现,Lundh试餐与胰泌素一样可使胰腺增大,胰管扩张,并可经超声定量记录此改变,提示此方法可判断胰腺的外分泌功能,将功能检查和形态检查结合起来。     

小鼠胰腺大部分切除后再生集中区来源的初步探索

目的:探讨胰腺在某些损伤或病理条件下,由于细胞活跃增殖产生再生集中区域的细胞来源。方法:将27只成年ICR系小鼠分为9组,每组3只,其中1组进行假手术,其余8组进行小鼠胰腺大部分切除,分别在切除后12h,24h、36h、48h、3d、5d、7d、10d取材及冰冻切片,采用H-E染色、免疫荧光染色方法检测损伤后各时间段胰腺组织的形态变化和细胞增殖率。结果:H-E染色发现,胰腺手术72h后,剩余胰腺中就出现由细胞角蛋白阳性导管样结构组成的再生集中区,此区域细胞随后分化为功能性细胞类型,10d后消失检测不到。对胰腺再生集中区的定位研究表明,它们仅出现于切除后的伤口边缘。BrdU标记表明,胰腺再生集中区为细胞快速增殖区域,其出现与总导管增殖率提高同时发生,主/大导管和小导管增殖率上升都晚于再生集中区的出现。结论:小鼠胰腺大部分切除后再生集中区可能来源于腺泡细胞的快速增殖,而不是经由总-主/大-小导管-快速增殖区这一途径引起的来源于导管上皮细胞。     

水热波动和土地覆盖变化对东北地区植被NPP的相对影响

研究水热波动和土地覆盖变化对植被净初级生产力(Net Primary Productivity, NPP)的影响对于估算陆地碳循环及其驱动机制具有重要意义。利用MODIS遥感影像获得的时间序列NPP和土地覆盖产品,结合气象观测数据(气温和降水),采用相关分析、回归分析和空间分析相结合的方法,研究2000—2015年东北地区植被NPP的时空变化特征,并定量评估水热波动和土地覆盖变化对该地区植被NPP的相对影响。研究结果表明,2000—2015年东北地区植被NPP呈波动上升趋势,从2000年的369.24 g C m^-2 a^-1增加到2015年的453.84 g C m^-2 a^-1,平均值是412.10 g C m^-2 a^-1,年际增加速率为4.54 g C m^-2 a^-1。近16年来东北地区年均植被NPP空间上呈现南高北低、东高西低的分布格局,整体变化趋势以增加为主,其中轻微增加面积占该地区总面积的45.9%。不同...     

量化气候和土地利用变化对生态资产变化的相对贡献——以房山区为例

生态资产与人类福祉密切相关,开展生态资产评估并定量区分气候和人类活动对生态资产变化的相对贡献,对于评估区域生态文明建设成效、生态补偿、干部离任的自然资产审计等均具有重要意义。在单位面积价值当量因子方法的基础上,重新定义了标准生态服务价值当量因子,并构建了一个能够定量区分气候变化和土地利用变化对生态资产变化相对贡献的方法,以北京市房山区为例,分析了2000年至2019年房山区生态资产的变化,以及气候变化和土地利用变化对生态资产变化的相对贡献,结果表明:(1)房山区2019年生态资产总价值177.14亿元。森林、草地、农田和湿地的生态资产分别占生态资产总价值的82.33%、11.76%、5.25%和0.095%。(2)房山在2000-2019年期间,生态资产总价值增加了2.275亿元,气候变化使得房山区的生态资产总价值增加了2.689亿元,而土地利用变化使得生态资产总价值减少了0.414亿元。(3)房山区生态资产西高东低,其中霞云岭乡生态资产总价值最高;琉璃河镇的生态资产增加最多,而拱辰街道下降最显著。过去20年是房山区社会经济快速发展的时期,由于气候变化和生态保护与修复使得生态资产增加,抵消了由于建设用地扩张所带来的生态资产损失。     

心梗大鼠离体心脏的动作电位和不应期电生理研究

目的对比观察正常大鼠和心梗大鼠离体心脏动作电位和有效不应期的特点。方法用离体灌流吸附电极记录单向动作电位,常规电生理方法测量最大动作电位幅度(APA)、复极90%(MAP90)、复极50%(MAP50)、复极20%(MAP20)、有效不应期(ERP)。结果(1)和正常大鼠相比,心梗大鼠离体心脏左心房电生理参数MAP90(56.3±2.7vs.64.5±8.7,P<0.05)显著延长,ERP MAP90(0.89±0.2vs.0.78±0.3,P<0.05)减小,基础周期为250ms;右心室的电生理参数MAP90(67.6±14.1vs.134.1±26.7,P<0.001),ERP(55.0±3.53vs.69.0±8.9,P<0.05)明显延长,ERP MAP90(0.79±0.1vs.0.60±0.1,P<0.05)减小,基础周期为250ms;左心室的电生理参数MAP90(87.2±15.7vs.168.8±31.2,P<0.001)也呈显著延长,ERP(59.0±4.2vs.90.0±17.7,P<0.001),ERP MAP90(0.65±0.081vs.0.54±0.090,P<0.05)呈显著减小基础周期为250ms;(2)与正常大鼠相比,心梗大鼠的MAP90离散度[(LVMAP90-RVMAP90)(17.0±6.5vs.51.4±28.7,P<0.001)]、ERP离散度[(LVERP-RVERP)(4.0±2.2vs.20.0±7.9)P<0.001]显著增加,基础周期为250ms。结论心梗大鼠心脏不同部位的MAP的复极时间都显著性延长,MAP90和ERP离散度增加,这些电生理特点是促进折返形成、造成心律失常的主要原因。     

基于窖泥微生物相对定量与绝对定量联用的窖泥老熟特征分析

[目的] 基于传统的相对定量法,在总DNA提取过程中加入内标菌,探索不同老熟程度下窖泥微生物菌群组成特征。[方法] 通过添加外源菌丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）作为内标菌,利用16S rRNA基因扩增子测序技术,基于相对丰度与绝对丰度解析不同老熟程度窖泥内的菌群结构和理化差异。[结果] 相对定量分析表明,随着窖泥老熟,窖泥微生物群落的多样性增加,己酸菌属（Caproiciproducens）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）、甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）和互营单胞菌属（Syntrophomonas）等菌的相对丰度显著增高。结合绝对丰度分析,老熟窖泥内的生物量分别是新窖泥与趋老熟窖泥的600倍与28倍。不同于相对定量分析,乳杆菌属（Lactobacillus）的绝对丰度在老熟窖泥内并未降低,为新窖泥的20倍。己酸菌属在老窖泥中的绝对丰度为新窖泥的25000倍;其他功能微生物包括甲烷杆菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）、互营单胞菌属的绝对丰度也随着窖龄的增加而显著增加。菌群结构的绝对定量动态分析表明,新窖泥转变为老熟窖泥的过程是一个菌群组成多样性不断提高、生物量也逐步增加的过程,老窖泥中己酸菌属、互营单胞菌属、多种甲烷菌等微生物绝对量的增加,推测对降低窖泥内的乳酸含量和形成窖泥稳态环境具有重要作用。[结论] 绝对定量方法的引入,可观测不同窖龄窖泥微生物生物量的差异,解析不同老熟阶段窖泥功能微生物绝对丰度的动态变化,为窖泥菌群结构和代谢功能的定量化和因果关系研究提供了新的策略。     

油松针叶萜烯组分相对含量的季节变化

利用气相色谱和气－质联用分析技术,对陕西省宁陕县旬阳坝林场８株成年油松的针叶挥发性萜烯化合物相对百分含量的季节变化行了测定。结果表明,１８种主要化合物的相对含量中有１１种存在着显著或极显著的季节性差异,这种差异主要发生在夏季和冬季之间。     

臭鼠种群相对数量季节变化的初步分析

１９８５年４月至１９９２年１２月,作者采用夹日法对萧山围垦农区臭种群动态进行了连续逐月定点定时的研究。结果表明：臭种群相对数量的季节消长呈后峰型双峰曲线,５月和１０月各出现一次高峰,怀孕率在２月和７月各出现一次高峰,平均胎仔数在５—６月和８—９月相对较多。室外种群相对数量高峰在４月和９—１０月;室内种群在５月和１０月,前峰不及室外种群明显。室内种群雌体怀孕率明显高于室外种群。种群相对数量的季节变化亦存在性别差异。     

胰腺发育相关maf基因在胰腺导管和胰岛的表达

为探讨胰岛功能和发育相关maf基因在胰腺导管上皮中的表达情况,对新鲜小鼠胰腺组织切片进行显微切割,分离纯化胰腺组织中的导管和胰岛,以及外分泌腺组织细胞作为对照,利用荧光实时定量PCR的方法完成对目的基因的相对定量.结果显示,mafa mRNA,mafb mRNA水平在胰岛及导管中非常接近,无统计学差异.而c-maf在导管的表达高于胰岛(P<0.05),外分泌腺则无上述基因的表达.胰腺导管中mafa,mafb,cmaf均有表达,肯定了导管上皮细胞向内分泌细胞分化的潜能,而c-maf在导管中的表达高于胰岛,提示导管上皮c-maf的下调可能有助于导管上皮细胞向内分泌细胞的分化成熟.     

皮层神经元动作电位不应期和阈电位与神经元动作电位编码的关系

目的：测量和比较感觉运动皮层Ⅱ/Ⅲ层锥体神经元和中间神经元的内在特性并研究其与动作电位编码频率和精确性的关系。方法：采用全细胞电流钳记录模式,获得的数据输入pClamp和Origin进行处理分析。结果：与锥体神经元相比,中间神经元群集动作电位具有较低的阈电位水平和较短的不应期,从而中间神经元具有较高的动作电位编码频率和精确性。结论：皮层神经元动作电位的阈电位水平和不应期调控动作电位的编码频率和精确性。