新发现的丙型肝炎病毒核心蛋白

近年来,有关新的丙型肝炎病毒核心基因及其编码产物的研究时有报道.与丙型肝炎病毒传统单一阅读框架翻译的病毒蛋白不同,新的核心C蛋白是由该病毒核心蛋白基因阅读框架序列+1移位后翻译产生的.新型C蛋白普遍存在于各个丙型肝炎病毒基因型中,约40%及 20%病毒感染者体内可检测到针对新型C蛋白的抗体和细胞免疫反应.在丙型肝炎病毒感染所致的肝癌患者中,新型C蛋白的表达量增高.新型C蛋白被认为可能与HCV感染慢性化和肝癌有关.     

拟南芥LFR原核重组蛋白纯化和多克隆抗体制备

拟南芥中有一类含ARM结构域的蛋白质,研究表明它们中的一些在植物的生长发育和激素应答等方面发挥着重要的作用.在拟南芥突变体筛选中,获得了一个推测编码蛋白含ARM重复序列的新基因突变体lfr(leaf and flower related mumnt),它在叶子和花的发育过程中表现出较明显的表型.为进一步研究该基因编码蛋白的生物学功能及其分子作用机制,构建了pGEX-2TGST:LFR融合蛋白重组表达载体,将重组质粒转化到工程菌中诱导表达菌体蛋白,经SDS.聚内烯酰胺凝胶电泳检测,结果表明,融合重组蛋白成功获得了高效表达,分子质量在77 ku左右.重组蛋白经谷胱甘肽S.转移酶(GST)标签蛋白亲和层析法纯化,SDS-PAGE制备胶割胶富集,电洗脱法纯化后得到纯度较高的抗原.经对新西兰兔进行5次免疫,获得了多克隆抗血清.采用免疫吸附方法对抗血清进行了纯化,结果得到只识别LFR重组蛋白的抗血清.进一步提取拟南芥野生型及突变体的核蛋白,经蛋白质印迹检测,结果显示,在分子质量50ku左右处出现特异的蛋白质条带,证明所制备的抗血清可以与拟南芥LFR蛋白特异性结合.     

丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：建立稳定表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的原核表达系统,获得高产量的纯化核心蛋白。方法：应用多聚酶链反应(PCR),以HCV—H株全长cDNA序列为模板,扩增获得核心区基因片段,克隆入原核表达载体pBVIL1,构建原核表达载体pBVIL1-C,转化HB101宿主菌,通过温度诱导表达核心蛋白。结果：扩增得到目的基因长度为573bp,构建pBVIL1-C表达载体,在HB101宿主菌中通过温度诱导获得稳定表达,表达蛋白占菌体总蛋白含量的21％,Western—Blot检测证实表达产物可与HCV患者阳性血清发生特异性结合反应。结论：HCV核心蛋白可在大肠杆菌中获得高表达并具有良好的反应原性。     

丙型肝炎病毒核心重组抗原C27的纯化

高效表达了ＨＣＶ核心区基因抗原之后,对表达蛋白Ｃ２７进行了纯化,经研究,重组蛋白是以包涵体形式存在于宿主菌内的。Ｃ２７重组蛋白分别经过包涵体洗涤、ＤＥＡＥ阴离子交换层析和Ｓ－２００分子筛两步柱层析纯化之后,纯度大于９５％,纯化得率为５３．２％,总回收率为１７．９％,纯化工艺流程简单、得率高,适合向规模化生产发展。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中表达的比较

为获得丙型肝炎病毒的核心蛋白（Core）,将克隆有Core基因的表达载体pBVIL1-Core转化大肠杆菌HB101,温度诱导表达Core蛋白。同时利用PCR方法以含有丙型肝炎病毒全基因的质粒PBR^TM／HCV为模板扩增Core基因,克隆进表达载体pPICZαA,构建表达载体pPICZαA-Core,转化毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115,在甲醇诱导下表达Core蛋白。Western-blot显示Core蛋白在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白量占菌体总蛋白的20％;在酵母培养上清中存在Core蛋白,证明Core蛋白在酵母系统中成功表达。     

丙型肝炎病毒核心蛋白结构及功能研究进展

大量研究结果表明丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白是多功能蛋白质,它可能与ＨＣＶ致病（癌）有密切关系。本文简述近年来关于核心蛋白结构与功能的最新进展。并初步探讨了ＨＣＶ核心蛋白可能的致病机制。     

绿色荧光蛋白的原核表达、纯化以及抗体制备

用PCR扩增出绿色荧光蛋白(GFP)基因,插入到pGEX-KG表达载体中,并将构建出的重组质粒命名为pKG- GFP。将重组载体导入大肠杆菌DH10β中,经IPTG诱导产生GST-GFP融合蛋白,同时以可溶蛋白和包涵体两种形式存在。 GST-GFP分子量大约为53kDa,与其理论值大小一致,用亲和层析以及凝血酶处理纯化GFP。纯化的产物经证实具有很好的 均一性。以GFP免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,Westernblotting测定抗血清效价。     

PTD融和蛋白的原核表达及其抗体制备

目的:为制备凋亡素重组蛋白抗体,首先获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,而且通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体,为进一步利用凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的检测奠定基础.方法:应用重叠延伸的基因融合技术将LHRH(黄体生成激素释放激素)基因、TAT(HIV-1反式转录激活因子)基因和凋亡素基因重组,构建成凋亡素重组蛋白原核表达载体pET-28a-LTA,随后将表达质粒转入BL21菌株,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,将已表达的重组蛋白通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化,并制备LTA凋亡素重组蛋白抗体.结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,LTA蛋白融合基因获得高效表达,凝胶薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白12.6%.LTA蛋白经Ni-NTA亲和色谱柱柱纯化,以纯化蛋白为抗原免疫獭兔制备凋亡素重组蛋白抗血清.结果表明抗体的效价为1: 12800.结论:应用重叠延伸的基因融合技术获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体.     

丙型肝炎病毒核心抗原高效表达及产物抗原性的研究

用含谷胱甘肽转硫酶（ＧＳＴ）基因的ｐＧｅｘ－２Ｔ为表达载体在大肠杆菌中高效表达了含ＨＣＶ核心区部分基因片段（约１２２个氢基酸）的融合蛋白,表达产物Ｃ２７经测定占菌体总蛋白的３０％,Ｃ２７纯化后,用我国ＨＣＶ诊断试剂第二代血清参考品为标准与Ｇ１１核心抗原进行比较,结果显示二者具有相同的总体检出率和近似的抗原活性。因此,推测表达的部分区段基因可能是核心区重要功能区域。另外融合蛋白对提高重组蛋白的抗原活性和分离纯化等均有一定作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白抑制乙型肝炎病毒转录的分子机理

为研究丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白抑制乙型肝炎病毒 (HBV)表达的分子机理 ,从HCV和HBV共感染中国病人血清中分离了 5个含HCV 5′非编码区 ( 5′NCR)和核心区 (CR)cDNA序列的克隆 .序列比较和系统发育分析显示 :从共感染病例中分离的HCV序列与其它已发表的从单独HCV感染病例中分离的序列没有显著差异 .共转染实验证实采用从其中 1例共感染病人中分离的核心蛋白cDNA基因所表达的核心蛋白 ,可抑制HBV表面抗原 (HBsAg)和HBVe抗原 (HBeAg)的表达 ,缺失突变分析说明HCV核心蛋白的C端疏水区对这种抑制作用是必需的 ,报道基因产物分析进一步说明了HBVC启动子和增强子Ⅱ是HCV核心蛋白的效应靶序列之一 ,而HCV核心蛋白在肝细胞和非肝细胞中均对HBV和其他细胞和病毒的基因的转录起负调节作用 .因此 ,认为HCV核心蛋白是一种多功能的负调节因子 ,与HCV和HBV以及HCV与细胞之间的相互作用密切相关     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的用RT-PCR技术扩增鸭坦布苏病毒(DTMUV)AH-F10株E基因,并克隆至pET32a(+)载体,构建重组表达质粒pET32a-E,表达E蛋白。方法重组表达质粒转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导后,获得含6个His标签的融合蛋白,大小约54kDa。表达的蛋白以包涵体形式存在。对目的蛋白进行纯化,用纯化的E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体血清。结果SDS-PAGE和Western blot试验结果表明E基因在大肠埃希菌中成功表达,并能与抗DTMUV多克隆抗体产生特异性反应,具有良好的反应原性。间接免疫荧光试验表明免疫小鼠后获得的多克隆抗体能与DTMUV反应。结论本研究为DTMUV新型疫苗和诊断试剂盒的进一步研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

提高对丙型肝炎患者实验室检测的灵敏度和特异性,对相关人群进行筛查和早期诊断,是控制丙型肝炎病毒(HCV)流行与传播的有效措施。为了建立更为可靠的HCV诊断方法,通过采用PCR方法从J6/JFH12a型病毒中克隆出HCV ns3基因片段,将其连接到p ET-28a载体上,重组载体p ET-28a-ns3转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,以10%SDS-PAGE进行鉴定,获得表达的NS3重组蛋白分子量为72 k Da。将纯化的NS3蛋白免疫BALB/c小鼠,第4次免疫后采集血液并分离血清进行抗体活性鉴定,小鼠抗体效价为1∶256 000。进一步的Western blotting和间接免疫荧光结果显示,以重组NS3蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体可以很好地识别HCV感染Huh7.5.1细胞中的NS3蛋白,为下一步开展单克隆抗体制备和检测试剂盒研制工作奠定了基础。     

莱茵衣藻纤毛内运输蛋白IFT46的原核表达纯化及其多克隆抗体的制备

IFT46是纤毛内运输蛋白IFT复合物B(IFT-B)的一个重要组分,对于纤毛的组装、运动和感知发挥着重要作用。为深入研究IFT46的作用机制,利用ift46基因全序列分别构建了带有GST和MBP标签的原核表达载体p GEX-2T-ift46和p MAL-C2X-ift46,并转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,以15%SDS-PAGE鉴定,分别获得了分子量为70、86 k Da的重组GST/MBP-IFT46融合蛋白。将亲和纯化的GST-IFT46融合蛋白(纯度95%以上)免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血清用ELISA测定效价为1∶256 000。抗血清依次经Protein A和固定在MBP-IFT46纯化后,用Western blotting和免疫荧光检测抗体特异性,结果表明制备的多克隆抗体能很好地识别莱茵衣藻中的IFT46,而且发现IFT46绝大部分定位在纤毛基体,极少部分沿纤毛呈点状分布,为继续开展IFT46在肥胖症、糖尿病、多囊肾病等纤毛相关疾病中作用机制的研究奠定了重要基础。     

Prokaryotic expression and purification of HIV-1 Vif and hAPOBEC3G,preparation of polyclonal antibodies

To prepare HIV-1 Vif and hAPOBEC3G and to produce their antibodies, the full length gene fragment of HIV-1 Vif was amplified by PCR from a plasmid of HIV-1 NL4.3 cDNA, and the APOBEC3G gene was obtained by RT-PCR from the total RNA of H9 cells. The resulting DNA construct was cloned into a prokaryotic expression vector (pET-32a). Recombinant pET-vif and pET-APOBEC3G were expressed respectively in Eserichia coli BL21 (DE3) as an insoluble protein. The vector also contained a six-histidine tag at the C-terminus for convenient purification and detection. To express and purify the HIV-1 Vif and hAPOBEC3G in E. coli cells, the accuracy of inserted gene and specificity of proteins were detected by the two enzyme digestion method, SDS-PAGE, and Western blotting. Rabbits were then immunized by Vif or APOBEC3G protein and serum samples were tested by indirect ELISA to determine the level of antibodies. Immunoenzyme and immunofluorescence assays were performed to identify the specificity of polyclonal antibodies. The titer of the anti-Vif antibodies was 1:204800, and that of the anti-APOBEC3G antibodies was 1:102400. Thus the antibodies could detect the antigen expression in the cells, demonstrating that fusion proteins with high purity and their corresponding polyclonal antibodies with high titer and specificity were achieved.     

尼罗罗非鱼ZAP-70蛋白的原核表达、纯化及其多抗制备

[目的]构建尼罗罗非鱼ZAP-70原核表达载体,纯化其重组蛋白并制备多克隆抗体。[方法]采用无缝克隆技术构建尼罗罗非鱼ZAP-70重组表达载体,并转入大肠杆菌B21中诱导表达,将表达的ZAP-70蛋白免疫日本大耳兔得到多克隆抗体,采用Western Blotting和ELISA技术鉴定抗体的特异性和效价。[结果]成功构建原核表达重组质粒p ET-B2m-ZAP-70,诱导表达的重组蛋白分子量约为39 k Da,主要以包涵体的形式表达;获得效价为1∶512 000的多克隆抗血清,WB检测显示该抗体能够特异性的识别所表达的ZAP-70重组蛋白。[结论]尼罗罗非鱼ZAP-70重组质粒在大肠杆菌B21中高效表达,分子量约为39 k Da,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步探索ZAP-70在尼罗罗非鱼免疫系统中的功能奠定了基础。     

西藏株小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

【背景】小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病,严重威胁我国养羊业的发展。【目的】原核表达PPRVH蛋白,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GenBank中PPRV西藏株h基因序列,对其进行密码子大肠杆菌偏爱性优化,采用两步PCR法全化学合成全长h基因。将测序验证正确的h基因克隆至原核表达载体pET-28a、pET-30a、pET-32a,转化E. coli BL21(DE3)并利用IPTG诱导H蛋白表达。以经SDS-PAGE割胶纯化的重组H蛋白免疫新西兰大白兔制备抗PPRV H蛋白多克隆抗体。【结果】重组E. coli [pET-28a(-30a,-32a)-H]表达的重组H蛋白相对分子质量分别约为70、68和86 kD;诱导7 h时PRRV H蛋白表达量最高,而且主要以包涵体形式表达;重组E.coli(pET-30a-H)表达的H蛋白经SDS-PAGE割胶纯化后免疫新西兰大白兔制备的多抗血清能与表达的重组H蛋白发生特异性反应;ELISA法检测抗体效价在1:6400-1:25600之间。【结论】原核表达了PPRVH蛋白,并制备了高效价的抗H蛋白多克隆抗体,为进一步研究PPRV H蛋白的功能及H蛋白的线性B细胞表位作图奠定了基础。     

人乳头瘤病毒6b型E7蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

进行人乳头瘤病毒6b型(Human papillomavirus type 6b,HPV6b)E7蛋白原核表达并制备其多克隆抗体。用已构建的pGEX-4T-2/HPV6bE7原核表达载体诱导表达大量可溶性融合蛋白GST-HPV6bE7,用Glutathione-Sepharose 4B亲和柱和凝血酶纯化获取HPV6b型E7蛋白。将纯化的E7蛋白免疫新西兰兔并纯化为多克隆抗体IgG。采用Western-Blot及免疫荧光法分析该抗体的效价及特异性。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导3～6h后pGEX-4T-2/HPV6bE7表达载体在大肠杆菌中高水平表达可溶性融合蛋白。纯化的E7蛋白免疫新西兰兔后可获得兔多克隆抗体IgG。经Western-Blot及免疫荧光鉴定,兔抗IgG具有高效价性和抗HPV6bE7蛋白特异性。获取纯化的HPV6b型E7蛋白具有较好的免疫原性,其免疫兔产生的多克隆抗体IgG效价高,特异性好,有望进一步用于HPV6b型的生物学功能研究和免疫学效应研究。     

Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of a novel Rab-like protein mRabL5

Rab GTPases, which belong to the Ras superfamily, represent a group of small molecular weight GTP binding proteins that are involved in various steps along the exocytic and endocytic pathways. We first identified mRabL5 (GenBank Accession No. NP_080349), a novel Mus musculus Rab-like protein, present as a Golgi-associated protein. Here we presented the results of the cloning, prokaryotic expression, purification, and polyclonal antibody production of the novel Rab-like protein. In order to obtain a specific antibody against mRabL5, we prepared two GST fusion proteins, full-length mRabL5 GST fusion protein and mRabL5 C terminus GST fusion protein, to immunize rabbits. Western blot analysis showed that both antibodies prepared against full length of mRabL5 and its C terminus, respectively, can recognize mRabL5 protein. Immunofluorescence of mRabL5 in NIH3T3 cells using the two antibodies showed its perinuclear clustering distribution pattern. The polyclonal antibodies preparation against mRabL5 provided a good tool for us to study the functional involvement of mRabL5.     

Mechanisms for inhibition of hepatitis B virus gene expression and replication by hepatitis C virus core protein

We have demonstrated previously that the core protein of hepatitis C virus (HCV) exhibits suppression activity on gene expression and replication of hepatitis B virus (HBV). Here we further elucidated the suppression mechanism of HCV core protein. We demonstrated that HCV core protein retained the inhibitory effect on HBV gene expression and replication when expressed as part of the full length of HCV polyprotein. Based on the substitution mutational analysis, our results suggested that mutation introduced into the bipartite nuclear localization signal of the HCV core protein resulted in the cytoplasmic localization of core protein but did not affect its suppression ability on HBV gene expression. Mutational studies also indicated that almost all dibasic residue mutations within the N-terminal 101-amino acid segment of the HCV core protein (except Arg(39)-Arg(40)) impaired the suppression activity on HBV replication but not HBV gene expression. The integrity of Arg residues at positions 101, 113, 114, and 115 was found to be essential for both suppressive effects, whereas the Arg residue at position 104 was important only in the suppression of HBV gene expression. Moreover, our results indicated that the suppression on HBV gene expression was mediated through the direct interaction of HCV core protein with the trans-activator HBx protein, whereas the suppression of HBV replication involved the complex formation between HBV polymerase (pol) and the HCV core protein, resulting in the structural incompetence for the HBV pol to bind the package signal and consequently abolished the formation of the HBV virion. Altogether, this study suggests that these two suppression effects on HBV elicited by the HCV core protein likely depend on different structural context but not on nuclear localization of the core protein, and the two effects can be decoupled as revealed by its differential targets (HBx or HBV pol) on these two processes of the HBV life cycle.     

拟态弧菌VMH蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的实现拟态弧菌热不稳定性溶血素(VMH)的原核表达,制备兔抗VMH蛋白的多克隆抗体。方法根据GenBank上已有的拟态弧菌vmh基因序列,设计并合成引物,通过PCR方法扩增vmh基因。PCR纯化产物酶切后,定向插入到PET-32a表达载体构建重组表达质粒PET-32a-vmh。重组表达质粒转化至E.coli Rosetta感受态细胞,在IPTG诱导下进行VMH蛋白表达。SDS-PAGE分析重组VMH蛋白(rVMH)的表达形式,并分别采用兔血平板扩散法和Western blot检测其溶血活性和免疫反应性。用纯化的rVMH蛋白免疫新西兰大白兔,3次免疫后采集免疫血清,采用饱和硫酸铵分级沉淀结合亲和层析法纯化多克隆抗体,并检测其纯度与效价。结果重组表达质粒PET-32a-vmh诱导表达后,经SDS-PAGE分析发现分子量约为77.8kDa的rVMH蛋白主要以包涵体形式表达,该蛋白经变性复性后具有溶血活性和免疫反应性。兔抗rVMH蛋白的多克隆抗体经纯化后,其纯度达95%,ELISA效价为1∶26843545600,琼扩效价为1∶32。结论成功制备了rVMH蛋白及其多克隆抗体,为进一步采用噬菌体肽库筛选技术鉴定VMH蛋白表位提供了物质基础。