单个活细胞中生物分子动态行为的FRET实时检测

分别采用两种不同绿色荧光蛋白(green fluorescent prote in,GFP)突变体作为荧光共振能量转移(fluo-rescence resonance energy transfer,FRET)对的供体和受体,并利用分子生物学技术将供体和受体分子分别与特定的生物分子融合,这种技术已经成为在单个活细胞中实时长时间检测蛋白质间的动态相互作用的主要技术。主要介绍了基于GFPs的FRET技术在单个活细胞中实时长时间研究生物分子动态行为的应用。     

荧光共振能量转移效率的实时定量测量

荧光共振能量转移（FRET）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用,与荧光显微镜结合,可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA和RNA的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展,FRET荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法,仅需使用一组滤光片和测量一个比值,利用供体和受体的发射谱肖除光谱间的串扰。该方法简单快速,可实时定量测量FRET的效率和供体与受体间的距离,尤其适用于基于GFP的供体－受体对。     

活细胞的分子探针——绿色荧光蛋白

来自水母的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）,在不加外源物质的情况下,紫外光激发后,能在原核和玩具核活细胞中发绿色荧光,荧光性质稳定,突变蛋白发光效率提高,激发和发射光谱明显改变。ＧＦＰ是一种十分有用的活细胞分子探针,在基因表达调控,转基因动物研究,蛋白在细胞中功能定位,迁移变化,病原菌侵入活细胞的分子过程等诸多方面均有广泛的用途。     

高功率微波辐照对视细胞脂质结构的影响

目的:研究高功率微波( HPM)照射后视网膜感光细胞中膜脂质的分子结构改变,探讨HPM的损伤机制.方法:通过显微FT-IR技术观察HPM照射前后大鼠视网膜冰冻切片中感光细胞外节的膜脂质分子特征吸收峰的位移与吸收值差异,分析脂质分子结构的改变情况.结果:HPM照后外节发生了膜脂质分子特征吸收峰的位移,并出现=C-H基团和...     

测量培养细胞鲜重和干重的新方法

要精确测定细胞的鲜重和干重,需要最大限度地了解悬浮培养的植物细胞生长的情况。这两种重量一般通过抽滤后干燥的方法测得。然而,抽滤并不总是能除去间隙中所有的水,并且用抽滤法测出的鲜重值常有较大的差异。华盛顿州立大学的科学家Ｄ．Ｒ．Ｍｉｌｌｓ和Ｊ．Ｍ．Ｌｅｅ描述了一种测量植物培养细胞鲜重和干重的更为精确的快速方法。这个方法包括（１）向一个已知重量的微量离心管中加入１ｍｌ悬浮培养液,并称重;（２）在管的尖端切一条约３ｍｍ深的裂缝;（３）把这个管插在另一个离心管中;（４）将整个装置放入一个５０ｍｌ的离心管…     

pH敏感的荧光探针及在活细胞中的应用

细胞内的pH是细胞内多种酶活性和生理活动的重要调节因素,准确、动态的监测细胞内pH变化对研究细胞内的活动至关重要。一些荧光小分子可以感应pH的变化,同时具有较高的灵敏度和特异性,对细胞损伤较小且标记操作简单,已逐渐发展成为一种监测细胞内pH变化的有效方法。本文主要介绍目前常用pH敏感的荧光探针及其在活细胞研究中的进展。     

细胞凋亡过程中Bid蛋白在活细胞内的动态分布

当细胞暴露于凋亡诱导因子如肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor-α,TNF-α）等的环境中,被激活的凋亡酶Caspase8将Bid蛋白切割成两个片断,随后其C-端片段转移到线粒体上诱发细胞色素c的释放,最终引起细胞凋亡。虽然关于Bid蛋白的研究已经取得了很大进展,但是Bid蛋白是如何转移到线粒体以及如何引起细胞色素c释放等许多问题尚未十分明了。为了进一步对Bid蛋白的生物学行为进行研究,特别是在无损伤、活细胞生理条件下,本实验采用了荧光蛋白标记和荧光成像技术对凋亡过程中Bid蛋白在活细胞内分布的动态过程进行了初步研究。     

基于活细胞量测量的利福霉素发酵过程氮源优化策略

在发酵生产利福霉素SV的过程中,其菌丝体的生长代谢情况及产物发酵合成都与有活力的菌丝量密切相关.介绍了在线活细胞传感仪测定活细胞量的方法,它利用细胞的介电特性,能够排除发酵液中固含物的干扰,测得的电容值与活细胞浓度呈线性相关,可以作为工艺优化过程中的关键参数.通过电容变化反映的前期生长出现的二次生长现象,进行了通过使用迟效氮源豆饼粉代替了原培养基中价格昂贵的速效氮源蛋白胨,成功消除了发酵前期由于氮源利用转换造成的生长停滞期,利用豆饼粉情况下培养前期的OUR和CER达到了14.8和15.3 mmol/L/h,明显高于利用速效氮源蛋白胨A组的8.6和11.3 mmol/L/h,保证了持续较高的比生长速率,对于促进菌体的氧消耗速率的增加和维持有着重要的作用,明显有利于利福霉素的合成与速率的维持,氮源替代组的发酵效价达到了5969±19 U/ml,与对照组(5030±17U/ml)相比显著提升发酵单位18.7%以上.     

细胞计数板在荧光显微镜观察B细胞吞噬现象的应用探讨

目的:基于细胞计数板建立一种简单、快速使用免疫荧光显微镜观察B淋巴细胞吞噬卡介苗(BCG)现象的新方法,对即将进行流式细胞检测的样品进行质控,提高流式细胞术检测吞噬率的稳定性,同时为流式细胞仪检测吞噬率提供镜下依据。方法:B细胞与FITC标记的BCG共培养24 h后,PE anti-human CD19抗体直接标记细胞膜,应用细胞计数板在荧光显微镜下观察B细胞吞噬现象,流式细胞仪检测吞噬率。结果:应用细胞计数板在荧光镜下可观察到B细胞与BCG的荧光标记及B细胞与BCG共标记现象,证实B细胞可吞噬BCG,流式细胞仪检测结果显示吞噬率为13.9%。结论:应用细胞计数板在荧光镜下可观察B细胞吞噬现象,且操作简便快速,能对流式细胞检测的样品进行质控,并提供镜下依据。     

适用于细胞荧光测量的多道显微荧光计

建立了由倒置荧光显微镜和光学多道分析仪(OMA)连接而组成的适用于细胞荧光测量的多道显微荧光计,编制了数据处理程序。利用这一装置测量了单个细胞,多细胞的荧光光谱和拓扑(topography)。和传统的显微荧光计相比,该装置具有测量灵敏度和精度高、速度快等特点,可用来进行活细胞动态过程的研究。     

不同固定条件下细胞与活细胞的原子力显微镜实时观察

用原子力显微镜（atom force microscope,AFM）观察固定细胞的最佳条件并在生理溶液中对活细胞实时观察.用不同固定剂和同一固定剂的不同浓度处理细胞;不加任何固定剂而直接在生理溶液中对细胞进行AFM成像.以戊二醛为固定剂并使用0.5%～1%的浓度固定细胞,后用缓冲溶液漂洗,再对细胞进行成像时可获得质量良好的图像.直接在生理溶液中进行观察,成像质量低于使用固定剂的细胞,但保持了细胞的生活原貌.在用原子力显微镜高分辨率观察生理条件下细胞的特点时,需要在制样与观测系统两方面进行改进.     

抗砷细胞荧光染色后的激光共聚焦显微镜检测

目的:应用激光共聚焦显微镜检测活细胞内荧光物质含量.方法:传代培养长期低剂量砷诱导的抗砷细胞,用荧光染料Rhodamine-123对细胞染色30min,实验组与维拉帕米(Verapamil)共同孵育,对照组为单加Rhodamine-123的抗砷细胞.应用激光共聚焦显微镜采集Rhodamine-123的荧光图像动态序列,并且记录不同时间段的细胞内荧光强度.结果:实验组细胞染色12h,24h,36h,48h,60h后,荧光强度依次为(51.567±0.7572)、(46.533±0.7095)、(39.557±0.601)、(38.6±0.6245)和(38.505±0.718),明显高于同时间段对照组的荧光强度,差异均有显著性(P＜0.01).结论:应用激光共聚焦显微成像技术能进行活细胞水平荧光物质实时定量检测.     

活细胞RNA动态成像技术进展

RNA是生命“中心法则”的主要成员,广泛参与细胞内各种生命活动. RNA在活细胞内的区室定位和动态过程与RNA功能息息相关.因此,需要开发活细胞内RNA成像技术,追踪RNA时空动态过程,原位阐明RNA活性和功能,进一步解析RNA相关生命过程和疾病的关系.本文系统阐述两大活细胞RNA成像体系:(i)RNA发夹:荧光蛋白体系;(ii)荧光响应RNA适配体:小分子探针体系.并介绍其他可用于动态示踪RNA的技术,概述不同技术在追踪活细胞RNA方面的特点和问题,讨论RNA动态成像技术未来的发展方向.     

用基于狂犬病病毒的疫苗感染和激活B细胞

<正>复制缺陷型狂犬病毒(RABV)可快速和有效激发在小鼠体内由T细胞依赖和非T细胞依赖机制产生的病毒中和抗体滴度,因此有望用于研制狂犬病毒暴露后疫苗。为了促进这种早期有效的B细胞激活,我们假设,活RABV研制的疫苗可直接感染B细胞,从而活化大量的抗原提呈细胞(APCs),APCs可在早期启动并且共同刺激CD4+T细胞。在本报道中,我们用活RABV研制的疫苗载体有效感染来自出生早期的小鼠和人类的B细胞。与感染模型或用灭活RABV疫苗处理细胞相比较,B细胞感染导致了B细胞激活和抗原呈递早期标志的明     

稀土元素灯辐照对CHO细胞集落形成率和DNA合成的影响

稀土元素具有独特的磁性、光子、化学和热力学等性能。利用其特性制成的稀土元素灯(以620—635nm波长为主),在临床上用以治疗顽固性慢性溃疡疾患,有效率达80％以上。一些动物实验表明,一定能量的红光区(630nm)光波辐照能促进伤口的愈合过程。由于使用的能量范围不足以引起细胞环境温度的明显改变,故可认为系非温度效应所引起。这种生物刺激作用(Biostimulation)发生在细胞内什么生物学过程上(如DNA合成、蛋白质合成、细胞内膜系统、细胞增殖或神经功能调节等),是一个值得探讨的有兴趣的课题。目前许多报告结果很不一致。本文从稀土元素灯辐照对CHO细胞集落形成率以及DNA合成的影响探讨了其作用机理。     

用FCM双参数测量膜抗原及核DNA的技术关键

利用流式细胞仪同时定量测定细胞核DNA及细胞膜表面抗原．对测量原理、条件、各种误差的消除方法及可行性进行了阐述.建立了一种简便易行的测量与分析方法．此方法已被应用于多项研究工作中.     

微生物活细胞快速检测的新技术研究

微生物活菌分为繁殖能力的活菌和有代谢活动但没有繁殖能力的活菌。传统的平板计数方法无法对有代谢活动但没有繁殖能力的活菌进行准确定量分析。本文综述了微生物活细胞检测新技术的研究进展,包括以PCR为基础的新技术和荧光活化细胞分选术与流式细胞术结合的新技术。     

基于单分子量子相干调制的细胞温度成像技术

目的 细胞温度成像可以帮助科学家研究和理解细胞内部的温度分布,揭示细胞代谢和生物化学过程的关键信息。目前,基于荧光温度探针的细胞温度成像技术存在低温度分辨率和有限测量范围等限制。本文旨在利用单分子量子相干过程依赖温度的特性,开发一种单细胞温度成像和实时检测技术。方法 基于飞秒脉冲激光制备延时和相位可调的飞秒脉冲对,调制的脉冲对通过显微系统激发细胞内标记的荧光单分子,之后收集并记录每个荧光光子的到达时间。利用单分子相干过程与周围环境温度的关系,定义单分子量子相干可视度（V）,建立V与环境温度的对应关系。通过调制解调荧光光子的到达时间,获取单分子周围环境温度,结合扫描成像,实现细胞的温度成像和实时检测。结果 该方法可以实现高精度（温度分辨率<0.1℃）和大范围温度（10～50℃）的温度成像和测量,并观测到了单个细胞代谢相关的温度变化。结论 该研究有助于深入了解细胞代谢、蛋白质功能和疾病机制,为生物医学研究提供重要工具。     

基于C6流式细胞仪平台应用FRET技术在活细胞中研究蛋白质相互作用

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)显微镜技术被广泛应用于在活细胞中研究蛋白质相互作用。随着流式细胞术(fluorescence activated cell sorting,FACS)的发展与应用,FACS-FRET技术不但可以检测活细胞中蛋白质相互作用,还可以进行定量统计分析。由于流式细胞仪价格昂贵、FRET技术对荧光基团发光光谱的特殊要求等原因,目前为止FACS-FRET技术仅仅被应用到一些特殊的科学研究。为了解决这些问题,构建了一对新的FRET荧光基团EGFP-m Cherry,并且在小型流式细胞仪C6上检测了EGFP-m Cherry融合蛋白的FRET信号,最后使用已明确有相互作用关系的p53蛋白和MDM2蛋白做验证,证明了所构建的EGFPm Cherry可以作为检测FRET信号的荧光基团。不仅促进了FACS-FRET技术的发展,还为人类疾病治疗的药物作用靶点研究提供了有利的研究手段。