基因体外诱变的一种新方法--脱氧核苷三磷酸替代法

在PCR的过程中,采用5-溴脱氧尿苷三磷酸(BrdUTP)部分取代脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的方法,对克隆的野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因进行了体外诱变.结果表明,BrdUTP浓度越高,诱变越强;浓度越低,诱变越弱.当BrdUTP浓度为dTTP的0.1%时,可以得到最多的正诱变结果.用LBSP鉴别培养基初筛,然后用Yoo改良法测定酶活,仅一轮诱变就获得了其表达产物α-淀粉酶的酶活分别降低了5倍和提高了20倍的两个突变基因.再以后者为PCR模板进行第二轮诱变,从而筛选到了α-淀粉酶的酶活提高40倍的突变体.此诱变方法克服了用碱基类似物在体内诱变由于核酸复制酶等的校正作用而造成诱变无效的难题,并为基因的体外诱变找到了一条新途径.     

一种降低dATP用量的简单易错PCR方法

易错PCR是基因体外诱变的主要方法之一,是通过在PCR体系中添加Mn2+、提高Mg2+浓度和dCTP/dTTP浓度等措施达到基因诱变的目的。【目的和方法】本研究在不添加Mn2+、不调整其它任何PCR成分的情况下,通过降低dATP浓度的底物不平衡作用,对洋葱抗菌蛋白基因Ace-AMP1和苏云金芽胞杆菌毒蛋白(Bt)基因cry1A(c)进行了PCR诱变。【结果】结果表明:随着dATP浓度的降低,序列变异率和碱基突变率均呈升高趋势。当dTTP/dCTP/dGTP∶dATP在20∶1-40∶1时,碱基突变率介于1.4%-1.8%之间,序列变异率介于77.8%-100%之间。【讨论和结论】该方法简化了常规易错PCR诱变中的条件优化过程,简单实用。降低dATP浓度的诱变方法主要引起AT→GC的变异,适用于提高靶基因GC含量的体外诱变。本研究降低单一底物浓度的诱变方法可以提高诱变基因的AT或GC含量,是对易错PCR诱变方法的拓展。     

α-淀粉酶在短短芽孢杆菌中的分泌表达

应用PCR技术从枯草杆菌168中分离出α－淀粉酶基因。将其引入分泌表达载体pBKE50后,用Tris-PEG法转入短短芽孢杆菌50中,发现α－淀粉酶以活性形式被分泌表达。酶测活分析表明α－淀粉酶活性约为出发菌枯草杆菌168的1.7倍。     

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶异源表达研究

目的：以地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶基因（amyL）为报告基因,构建含不同启动子的枯草杆菌表达载体,转化枯草杆菌,并对重组菌的酶活进行分析,比较不同启动子对amyL基因在枯草杆菌中表达的影响。方法：以高温α-淀粉酶高产菌株B.licheniformis0204染色体DNA为模板,PCR扩增得到amyL并分别与PQ启动子和P43启动子进行连接构建表达载体pUB-PQ-amyL和pUB-P43-amyL,化学法转化枯草杆菌1A717,筛选得到重组转化子后对重组菌的表达产物进行SDS-PAGE和酶活检测。结果：重组菌摇瓶发酵105h后测定高温α-淀粉酶酶活,B.subtilis1A717（pUB-PQ-amyL）的最高酶活为280.1U/mL,B.subtilis1A717（pUB-P43-amyL）的最高酶活为190.5U/mL。结论：PQ启动子调控的高温α-淀粉酶最高表达水平是P43启动子调控的最高表达水平的1.47倍,说明PQ启动子能使amyL基因在枯草杆菌中更高效地表达。     

筛选具有高α-淀粉酶酶活的丙酮丁醇梭菌及C源对其酶活的影响

利用淀粉平板筛选到1株α-淀粉酶比酶活为94.67 U/mL的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)菌株D3 1 1,比酶活比原菌株提高了58.21%,丁醇产量达11.88 g/L,比原菌株提高了25.45%。考察不同C源对丙酮丁醇梭菌D3 1 1α-淀粉酶活的影响,其中葡萄糖要比其他C源对α淀粉酶的抑制作用更强,且随着葡萄糖浓度的加大,抑制作用也越强。     

利用甲硝唑及外加氧方法筛选耐氧产氢Klebsiella oxytoca HP1突变菌株

摘氢酶是生物制氢的关键酶,大多数氢酶因对氧极敏感而易失活,因此提高氢酶的氧耐受性对生物制氢有重要意义。本研究利用1％甲基磺酸乙酯对Klebsiella oxytoca HPl进行了两轮诱变,经40mmol／L甲硝唑和21％氧联合处理1h（第一轮诱变）或2h（第二轮诱变）进行筛选。所得突变菌株经产氢测试,结果在15％氧浓度条件下,第一代突变菌株HPl-A15产氢活性为出发菌株Klebsiella oxytoca HPl的3.70倍,在21％氧浓度条件下第二代突变菌株HPAl5-37产氢活性为HPl-A15菌株的2.75倍,是出发菌株的11倍。突变菌株HPl-A15和HPAl5-37具有较好的遗传稳定性。本试验结果说明利用MNZ和外加氧的方法适用于兼性厌氧菌耐氧产氢突变菌株的筛选。     

西方许旺酵母α-淀粉酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的分泌表达

目的:将带有完整自身信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因克隆到大肠杆菌中,验证西方许旺酵母α-淀粉酶基因能否在大肠杆菌中有效表达。方法:利用PCR扩增带有完整自身信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因,并将其接入Zeocin启动子片段,构建了重组表达载体GapZA,转化大肠杆菌,验证得到的阳性克隆菌株是否表达α-淀粉酶活性。结果:阳性克隆菌株均有α-淀粉酶活性。结论:证明了许旺酵母α-淀粉酶能在自身信号肽引导下分泌到大肠杆菌细胞外,并且表现出明显酶活。     

解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因的克隆、表达与酶学性质分析

以中温α-淀粉酶生产菌株Bacillus amyloliquefaciens M23基因组DNA为模板。PCR扩增得到了2．0kb α-淀粉酶基因全长序列。该基因由上游启动子220bp,结构基因1544bp和终止序列320bp构成。将无信号肽的α-淀粉酶结构基因amyQ,克隆入表达载体pET28a,转化E．coli BL21（DE3）,经诱导,测定α-淀粉酶活性。结果表明：α-淀粉酶基因amyQ获得了活性表达,酶活力为2．297U／mL,SDS-PAGE电泳结果显示出分子量约为58kDa特异性蛋白质条带。酶学性质分析表明,重组α-淀粉酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6．5,在60℃保温15min保持85％以上活性,超过15min,酶迅速失活,在pH5．5～10．0环境下稳定。水解产物分析表明：淀粉水解终产物主要为麦芽寡糖和糊精和少量葡萄糖。     

淀粉结合域与α-淀粉酶的融合表达及其酶学性质

利用RT-PCR从Rhizopus oryzaeGX-08总RNA中克隆到糖化酶的淀粉结合域(SBD)基因(sbd),将该基因片段插入α-淀粉酶(CN7A)基因cn7a的5′端构建融合表达质粒pSE-sbdcn7a。嵌合酶SBD-CN7A在Escherichia coliJM109表达,并经Ni-NTA、Sephacryl S300纯化。酶学性质研究表明:嵌合酶在最适作用条件方面与原始酶并无明显差别;在以生玉米粉为底物时,其比酶活提高了8.7倍,而以可溶性淀粉为底物时其比酶活是原始酶的1.8倍,Km也从3.784 g/L降低为2.234 g/L;嵌合酶在65℃下的半衰期从10 min缩短为4 min。结果表明,淀粉结合域SBD的融合赋予了α-淀粉酶CN7A水解生淀粉的能力。     

芽胞杆菌属产α-淀粉酶的研究进展

α-淀粉酶是一种重要的淀粉水解酶,可以从动物、植物或微生物中获得。但应用于工业生产的α-淀粉酶绝大多数来自芽胞杆菌。自α-淀粉酶工业化生产以来,研究人员针对其生产菌株芽胞杆菌进行了一系列的诱变选育和基因工程等分子生物学育种,使得菌种的产酶能力不断得到提高。另外,优化芽胞杆菌发酵培养基及发酵参数也是提高α-淀粉酶工业化生产产量的重要方法。     

Sul folobus sol fataticus P2嗜热嗜酸α-淀粉酶在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达

通过PCR方法从Sulfolobus solfataticus P2中扩增到2．6kb的α-淀粉酶基因（SS01172）,将其分别克隆到表达载体pET32a（＋）和pPICZaA,并在E．coliRosetta和Pichia pastoris GS115中进行表达。结果表明α-淀粉酶基因在Rosetta中得到了高效表达,酶活为143．466U／mL;而在GS115中表达量稍低,发酵液酶活力为98．102U／mL。     

古菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达

用PCR方法从嗜热古菌Pyrocccus furiosus的基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶成熟肽结构基因,插入pUC19中构建成质粒pUC19-amy,将pUC19-amy外源片段接入酿酒酵母表达载体pXY212多克隆位点,构建成载体pYX212-amy,电转化酿酒酵母W303-1A,转化子成功表达出有活性的高嗜热α-淀粉酶,重组酶具有P.furiosus产生的胞外α-淀粉酶相似的酶学性质,最适pH为5.0,最适温度约为90℃,在121℃下热处理30min酶活仍能保持50%以上。     

地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆和及其启动子功能鉴定

根据已知α-淀粉酶编码基因保守区核苷酸序列,通过PCR和反向PCR技术克隆出Bacillus licheniformisCICIM B0204α-淀粉酶编码基因amyL全长序列及其上下游序列。B.licheniformisCICIM B0204amyL由1539bp组成,其上游180bp为启动子序列,下游160bp为终止子序列;成熟肽由512个氨基酸残基组成,氨基端的29个氨基酸残基为α-淀粉酶的信号肽。通过基因及其氨基酸序列比对发现,amyL及其编码产物与芽孢杆菌来源的α-淀粉酶具有高度相似性。将amyL的结构基因在PT7介导下于大肠杆菌中诱导表达,获得具有α-淀粉酶活性的表达产物。将amyL的启动子序列和信号肽序列与B.licheniformisCICIM B2004的β-甘露聚糖酶结构基因进行读框内重组,在大肠杆菌中获得了β-甘露聚糖酶的分泌表达,重组大肠杆菌表达295U/mL的β-甘露聚糖酶酶活。     

利用甲硝唑及外加氧方法筛选耐氧产氢Klebsiella oxytoca HP1突变菌株

氢酶是生物制氢的关键酶, 大多数氢酶因对氧极敏感而易失活, 因此提高氢酶的氧耐受性对生物制氢有重要意义。本研究利用1%甲基磺酸乙酯对Klebsiella oxytoca HP1进行了两轮诱变, 经40 mmol/L 甲硝唑和21%氧联合处理1 h(第一轮诱变)或2 h(第二轮诱变)进行筛选。所得突变菌株经产氢测试, 结果在15%氧浓度条件下, 第一代突变菌株HP1-A15产氢活性为出发菌株Klebsiella oxytoca HP1的3.70倍, 在21%氧浓度条件下第二代突变菌株 HPA15-37产氢活性为HP1-A15菌株的2.75倍, 是出发菌株的11倍。突变菌株HP1-A15和 HPA15-37具有较好的遗传稳定性。本试验结果说明利用MNZ和外加氧的方法适用于兼性厌氧菌耐氧产氢突变菌株的筛选。     

高温α-淀粉酶生产菌种选育的研究

以地衣芽孢杆菌B．198为出发株,经不同诱变剂反复诱变和自然选育,得到突变株A.404l,其产高温α-淀粉酶为出发株的100倍。在摇瓶培养条件下,酶活力达200u／ml．是一株无孢子并带有Rifr、Met-、Arg-标记的抗分解代谢阻遏突变株。初步纯化的A1041α-淀粉酶最适反应pH为5—7,晟适反应温度90—95℃,于90℃、60分钟处理不失活,表明突变株A．4041所产α-淀粉酶是高温淀粉酶,具有工业生产价值。     

扣囊复膜孢酵母α-淀粉酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达与重组酶性质

通过PCR方法从扣囊复膜孢酵母基因组DNA中克隆获得α-淀粉酶基因成熟肽编码区（SfA）,插入乳酸克鲁维酵母表达载体pKLACl的d因子信号肽下游,构建重组表达载体pKLACl-SfA。重组载体转化乳酸克鲁维酵母GG799,筛选获得表达α-淀粉酶SfA水平较高的重组茵。酶活检测和SDS．PAGE电泳检测均显示,重组茵分泌重组酶SfA到发酵液中。酶学性质研究表明：SfA最适温度为45℃,最适pH5．0,在pH4．5～5．5、50℃条件下保持稳定。Ca2＋等二价金属离子对SfA酶活有激活作用,EDTA强烈的抑制SfA活性。HPLC分析显示SfA水解糊精获得麦芽寡糖和少量葡萄糖,其中麦芽三糖是主要产物,占水解产物总量的52％。     

基因体外诱变*

综述了基因体外诱变的一般方法和技术,并将其分为不依赖于PCR体外诱变和依赖于PCR体外诱变两大类。着重介绍了基因体外诱变最新突破即DNA　Shuffling技术。     

高温α-淀粉酶生产菌种选育的研究

以地衣芽孢杆菌B．198为出发株,经不同诱变剂反复诱变和自然选育,得到突变株A.404l,其产高温α-淀粉酶为出发株的100倍。在摇瓶培养条件下,酶活力达200u／ml．是一株无孢子并带有Rifr、Met-、Arg-标记的抗分解代谢阻遏突变株。初步纯化的A1041α-淀粉酶最适反应pH为5—7,晟适反应温度90—95℃,于90℃、60分钟处理不失活,表明突变株A．4041所产α-淀粉酶是高温淀粉酶,具有工业生产价值。     

中温α-淀粉酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达

提高中温α-淀粉酶生产菌株的发酵温度,对减少冷却水消耗降低生产成本有重要意义。本文利用基因删除技术删除了地衣芽孢杆菌CBBD302菌株α-淀粉酶的编码基因(amy L)获得突变株D402。将表达解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因Ba A的重组质粒p HY-WZX-Ba A转化D402,获得表达中温α-淀粉酶的重组地衣芽孢杆菌D402/p HY-WZX-Ba A。摇瓶发酵实验显示,重组菌最适发酵温度为42℃,比原生产菌株提高8℃,最高产酶水平达到301 U/m L。30 L发酵罐发酵试验,78 h达到最高酶活531 U/m L。重组酶的最适作用温度为60℃,最适作用p H 6.5,在90℃保温20 min可以完全失活,保持了中温α-淀粉酶既能在淀粉糊化温度下保持稳定又便于灭酶的优良性能。     

海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E.coli中的高效表达

为解决密码子偏好性差异造成的表达水平低下问题,采取了3种手段提高海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。用PCR方法从海栖热袍菌（Thermotoga maritima）基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶A的完整基因amyA,插入表达载体pET-20（b）中构建成质粒pET—amyA;运用基因工程手段将amyA基因富含稀有密码子的信号肽进行切除,将不含信号肽的amyAⅠ基因插入pET-20（b）中构建成质粒pET—amyAⅠ;用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增出argU基因,插入pET—amyAⅠ中构建成质粒pET—amyAⅡ。将重组质粒分别转化到E．coli JM109（DE3）,并将重组质粒pET—amyAⅠ转化E．coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIL。通过IPTG诱导测酶活性：在E．coli JM109（DE3）中表达的重组酶（pET—amyA）、（pET—amyAⅠ）、（pET—amyAⅡ）的酶活分别是1658．0U／mL、6721．7U／mL、8904．5U／mL,在E．coil BL21-CodonPlus （DE3）-RIL中表达的重组酶（pET—amyAⅠ）的酶活是13867．7U／mL。表明通过这些手段能大幅提高T.maritima胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。