绿盲蝽八个普通气味受体基因的克隆及功能鉴定

【目的】本研究旨在克隆绿盲蝽Apolygus lucorum的气味受体基因,明确这些气味受体基因在绿盲蝽成虫不同组织中的表达水平及对主要寄主植物挥发物的电生理反应,为揭示绿盲蝽对寄主植物的识别机制提供理论基础。【方法】在绿盲蝽成虫触角转录组测序与分析的基础上,通过PCR技术克隆得到8个具有完整ORF的气味受体基因序列。用qPCR研究这8个基因在雌雄成虫不同组织(触角、无触角的头、胸、腹、足和翅)中的表达水平。然后通过爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳技术测试这些气味受体对56种气味化合物的电生理反应。【结果】克隆得到了绿盲蝽8个气味受体基因AlucOR9, AlucOR16,AlucOR38, AlucOR53, AlucOR55, AlucOR56, AlucOR57和AlucOR58的cDNA全长序列(GenBank登录号:MN905538-MN905545)。这些气味受体含有7个跨膜结构域,且N末端位于胞内,C末端位于胞外,符合昆虫气味受体的典型特征。qPCR结果表明,这8个气味受体基因均在绿盲蝽成虫触角中高表达,而在其他组织中低表达,其中除AlucOR38外的其他7个气味受体基因在雌雄成虫触角间存在显著的表达差异。双电极电压钳记录结果显示,AlucOR57对其中15种气味化合物(苯甲醛、氧化石竹烯、庚醛、反-2-己烯醛、乙酸苯甲酯、桃金娘烯醛、4-乙基苯甲醛、乙酸壬酯、四氢芳樟醇、十三烷、反-3-己烯醇、2-丙烯酸丁酯、丙酸丁酯、乙酸辛酯和乙酸戊酯)有反应,其余7个气味受体对测试的全部气味化合物均无反应。【结论】AlucOR57对测试的一些气味化合物有反应,推测其在绿盲蝽的寄主识别过程中发挥重要作用;其他7个气味受体对测试气味化合物均无反应,其功能有待进一步研究。     

绿盲蝽气味受体基因AlucOR40的克隆及功能研究

【目的】从绿盲蝽Apolygus lucorum触角中克隆气味受体基因Aluc OR40,研究该气味受体基因在绿盲蝽不同组织中的表达水平,然后对该基因的功能进行研究,为理解绿盲蝽的嗅觉识别机制提供理论基础。【方法】在绿盲蝽成虫触角转录组测序与分析的基础上,通过PCR技术克隆得到气味受体基因Aluc OR40的全长序列。用半定量RT-PCR研究该基因在雌雄虫不同组织中的表达水平。然后通过爪蟾卵母细胞体外表达该基因,并结合双电极电压钳检测了该气味受体对60种气味分子包括绿盲蝽性信息素组分和植物挥发物的反应。然后,利用触角电位技术测定羽化后3 d的绿盲蝽成虫对Aluc OR40的气味配体的触角电位反应。【结果】克隆了Aluc OR40(Gen Bank登录号:KU886190)。Aluc OR40编码398个氨基酸,蛋白具有7个跨膜结构域,N末端位于胞内,C端位于细胞外,符合昆虫气味受体的典型特征。半定量RT-PCR的结果显示,Aluc OR40在触角中特异表达,且在雄虫触角中的表达水平高于雌虫。双电极电压钳记录结果显示,Aluc OR40只对反-2-己烯醇一种气味分子具有特异反应。EAG实验结果表明,羽化后3 d的绿盲蝽雌雄虫都对反-2-己烯醇有反应,且雄虫触角的EAG反应显著高于雌虫。【结论】结果提示Aluc OR40参与了绿盲蝽对反-2-己烯醇的识别过程,推测其在绿盲蝽交配过程中雄虫对雌虫的识别中发挥作用。     

绿豆象气味受体基因的克隆和时空表达谱

【目的】本研究旨在克隆绿豆象Callosobruchus chinensis触角4个普通气味受体(odorant receptor, OR)基因,明确这些OR基因在绿豆象不同日龄雌雄成虫组织中的表达谱,为进一步研究基因功能奠定基础。【方法】基于绿豆象成虫触角转录组数据,预测绿豆象OR候选基因;利用RT-PCR克隆绿豆象4个OR基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用qPCR检测这4个OR基因在绿豆象雌雄成虫不同组织(触角、不含触角的头、腹、足和翅)中以及1, 3和5日龄雌雄成虫触角中的表达量。【结果】根据预测的基因序列,克隆得到4个绿豆象气味受体基因的cDNA全长序列,分别命名为CchiOR8,CchiOR10,CchiOR16和CchiOR39,GenBank登录号分别为MW732665, MN832705, MW732664和MN832706;编码的氨基酸数目分别为369, 352, 400和367。系统发育树分析表明,CchiOR8, CchiOR10和CchiOR16均与大猿叶甲Colaphellus bowringi的同源蛋白亲缘关系较近,而CchiOR39与果...     

绿盲蝽酯酶基因AlucEST1的克隆及表达谱分析

昆虫体内的气味降解酶(odorant degrading enzymes, ODEs)能够降解气味分子, 使嗅觉受体免受持续的刺激。酯酶作为气味降解酶类的一种, 在昆虫嗅觉行为过程中发挥重要作用。本研究利用RACE技术克隆了一个新的绿盲蝽Apolygus lucorum酯酶基因AlucEST1 (GenBank登录号: JQ715614)。序列分析结果表明, 该基因全长1 810 bp, 开放阅读框为1 713 bp, 编码571个氨基酸。N-末端疏水区包含由起始位置开始的一段17个氨基酸的信号肽。通过半定量RT-PCR和Real-time qPCR 技术解析该酯酶基因在不同组织的表达谱。结果发现, 该酯酶基因在绿盲蝽的触角、 头、 胸、 腹、 足、 翅等部位中均有表达。其中, AlucEST1在胸、腹部中表达量最高, 在触角中也大量表达。据此推测该基因在气味分子的降解中起重要作用, 同时也参与绿盲蝽体内的多种代谢调控。     

小菜蛾普通气味受体基因PxylOR9的鉴定及功能研究

【目的】克隆小菜蛾Plutella xylostella一普通气味受体基因,明确其在不同组织中的表达分布,并鉴定其功能,为了解小菜蛾对寄主植物的识别机制提供理论基础。【方法】在小菜蛾成虫触角转录组测序和分析的基础上,通过PCR技术克隆得到一气味受体基因的全长序列,利用半定量RT-PCR研究其在雌雄蛾不同组织中的表达,并通过爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳技术测试该受体对59种植物挥发物刺激的反应。【结果】在前期研究中,通过转录组测序和生物信息学分析,预测获得了多条小菜蛾气味受体基因序列。本研究中,我们克隆得到了其中一小菜蛾气味受体基因Pxyl OR9的c DNA全长序列(Gen Bank登录号:KP757898)。Pxyl OR9包括6个跨膜结构域,N末端位于胞内,符合昆虫气味受体的典型特征。与其他鳞翅目昆虫气味受体构建的进化树分析结果显示,Pxyl OR9与性信息素受体具有明显的分离,并与普通气味受体聚集在一起。半定量RT-PCR结果显示,Pxyl OR9仅在雌雄触角中表达且无雌雄差异。双电极电压钳记录结果显示,在测试的植物挥发物中Pxyl OR9只对植物挥发物!-紫罗兰酮的刺激具有反应。【结论】本研究从小菜蛾中克隆得到Pxyl OR9的全长序列,其编码产物具有气味受体的典型特征并且属于普通气味受体。该基因在仅在小菜蛾成虫触角中高表达。体外功能研究证明Pxyl OR9对植物挥发物!-紫罗兰酮具有特异反应,推测其参与了小菜蛾对植物的识别。     

绿盲蝽核受体基因AlE75D的克隆和性质分析

【目的】克隆绿盲蝽Apolygus lucorum核受体基因E75D全长,明确其表达谱,并获得该基因的重组蛋白及制备其单克隆抗体。【方法】利用RACE法克隆绿盲蝽核受体基因Al E75D全长;qRTPCR法分析绿盲蝽不同日龄成虫(1-16 d)及7日龄雌成虫6种组织(脂肪体、飞行肌、卵巢、马氏管、中肠和表皮)中该基因的mRNA相对表达水平;利用NdeⅠ和XbaⅠ双酶切含有目的基因的p MD18-T载体后进行亚克隆,再利用IPTG诱导的重组质粒进行特异性表达重组蛋白,通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析纯化靶蛋白;最后通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备重组蛋白的单克隆抗体,Western blot验证该抗体的特异性。【结果】从绿盲蝽中克隆获得蜕皮激素核受体基因Al E75D(Gen Bank登录号:KX912700),其开放阅读框长1 911 bp,编码636个氨基酸,预测分子量为75.68 k D;该基因编码蛋白具有E75D的典型特征,由A/B域(23 aa)、D域(85 aa)、E域(190aa)和F域(338 aa)组成,但缺失C域;绿盲蝽Al E75D的氨基酸序列与半翅目蝽科的豆荚草盲蝽Lygus hesperus的E75D序列一致性最高(为98%)。Al E75D在整个绿盲蝽成虫期均有表达,在7日龄雌成虫中达到峰值;此外,Al E75D在雌成虫6个供试组织中也均有表达,并在脂肪体及卵巢中高表达。双酶切后的重组克隆载体可成功亚克隆到p Czn1载体上,IPTG可成功诱导p Czn1-Al E75D重组质粒特异性表达一个约75 k D的蛋白。用Ni-NTA琼脂糖树脂凝胶纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原,获得了一株能稳定传代并分泌抗Al E75D蛋白单克隆抗体的细胞株,该单克隆抗体可与绿盲蝽总蛋白及Al E75D重组蛋白特异性结合。【结论】Al E75D在绿盲蝽体内的表达谱表现出发育阶段特异性和组织特异性;本研究获得的其重组蛋白的单克隆抗体具有高特异性。结果为进一步在蛋白水平上分析该基因的功能奠定基础。     

悬铃木方翅网蝽触角气味结合蛋白基因鉴定

【目的】悬铃木方翅网蝽Corythucha ciliata是专性危害悬铃木属Platanus植物的外来入侵害虫,本研究旨在获得该害虫触角中气味结合蛋白(OBPs)基因信息,以期寻求有效控制害虫的嗅觉分子靶标。【方法】利用Illumina HiSeq~(TM) 4000高通量测序技术对悬铃木方翅网蝽雌雄成虫触角进行转录组测序并对测序结果进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR(qPCR)方法,分析OBP基因在悬铃木方翅网蝽雌雄成虫触角中的表达模式。【结果】对悬铃木方翅网蝽雌雄成虫触角6个样品的转录组测序,共获得40.87 Gb clean reads,各样品的序列长度均达到6.31 Gb。转录组数据分析共鉴定出26个推测的悬铃木方翅网蝽OBP基因,其编码蛋白中24个(CcilOBP1-24)属于Classic OBPs,CcilOBP25/26属于Plus-C OBPs;与半翅目其他昆虫相关OBPs系统发育分析表明,大部分CcilOBPs形成独立一簇,少数与其他半翅目昆虫OBPs直系同源。qPCR分析显示,有11个OBP基因在雌雄成虫触角中表达量差异显著,其中有9个OBP基因(CcilOBP5/6/9/10/17/18/21/24/25)在雄成虫触角中显著高表达,有2个OBP基因(CcilOBP14/16)在雌成虫触角中显著高表达。【结论】本研究获得了悬铃木方翅网蝽成虫触角气味结合蛋白基因信息,研究结果为生物控制该害虫提供了重要基础数据和候选分子靶标。     

棉铃虫离子型受体基因HarmIR8a的克隆及表达定位

【目的】昆虫离子型受体(ionotropic receptors, IRs)是新发现的一类化学感觉受体,对昆虫感受环境中酸类和胺类等物质发挥着重要作用。基因克隆、序列比对以及表达定位的研究将有助于初步解析棉铃虫Helicoverpa armigera离子型受体的功能。【方法】本研究在棉铃虫触角转录组测序和分析的基础上,利用PCR技术克隆了一个离子型受体基因的全长序列,并进行序列结构预测等分析;利用荧光定量PCR技术对该基因在棉铃虫雌、雄成虫不同组织中的表达量进行了分析;同时利用原位杂交技术检测了该基因在棉铃虫雄虫触角中的表达定位。【结果】克隆获得棉铃虫HarmIR8a基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MH638313),开放阅读框为2 688 bp,编码895个氨基酸,预测有3个跨膜区域。HarmIR8a氨基酸序列包含了一个氨基末端区域(amino terminal domain, ATD),一个由S1和S2两部分构成的配体结合域(ligand binding domain, LBD),一个孔环(pore loop, P),3个跨膜区(M1, M2和M3)和一个胞内C末端(C terminus)。荧光定量PCR结果显示,HarmIR8a在棉铃虫雌、雄成虫头(除去附器)和触角等组织中均有表达,而且在触角中高表达。棉铃虫雄虫触角原位杂交结果表明,HarmIR8a主要在触角腔锥形感器下表达。【结论】本研究初步探析了HarmIR8a基因的转录水平和表达部位,为进一步研究棉铃虫离子型受体基因的功能和生理作用奠定了基础。     

苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因Alin-OBP1的克隆及表达谱分析

有证据表明昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)与其嗅觉识别密切相关,起着运输外界脂溶性气味分子通过嗅觉感器淋巴液到达嗅觉受体的关键作用.为了更好地了解OBPs在苜蓿盲蝽Adelphocoris lineolatus (Goeze)嗅觉识别中的作用,本研究首次克隆了苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因Alin-OBP1 (GenBank序列号GQ477022). 测序和序列分析结果表明,该基因开放阅读框长438 bp, 编码145个氨基酸,预测分子量为15.69 kDa,等电点为5.01,N-末端疏水区包含由18个氨基酸组成的信号肽.蛋白特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸残基.利用RT-PCR和Real-time PCR技术对Alin OBP1在苜蓿盲蝽成虫不同组织和各个发育阶段的表达水平进行了测定,结果显示Alin-OBP1几乎全部在触角中表达.不同发育阶段Alin-OBP1表达量不同,在5龄若虫和成虫阶段表达水平最高.结果提示Alin-OBP1可能在苜蓿盲蝽感受包括性信息素在内的外界化合物的过程中发挥着重要作用.     

棉铃虫普通气味受体基因HarmOR9和HarmOR29的克隆和组织表达分析

【目的】对棉铃虫Helicoverpa armigera 2个普通气味受体基因的cDNA全长进行分析,明确这两个普通气味受体基因在不同组织中的表达分布,为进一步的功能研究奠定基础。【方法】利用PCR结合RACE技术克隆棉铃虫两条普通气味受体基因的cDNA全长;利用不同的生物信息学软件对序列进行结构预测、序列比对和进化树分析;利用半定量RT-PCR检测其在棉铃虫成虫不同组织中的表达。【结果】获得两条棉铃虫气味受体基因的全长序列,并命名为HarmOR9和HarmOR29（GenBank登录号分别为KJ188252和KJ188253）。序列分析显示,HarmOR9全长1 206 bp,编码401个氨基酸;HarmOR29全长1 188 bp,编码395个氨基酸。选择已报道的鳞翅目昆虫烟青虫Heliothis assulta、家蚕Bombyx mori、烟芽夜蛾Heliothis virescens和棉铃虫的气味受体与本实验克隆得到的两个气味受体基因的编码产物进行序列比对和进化树分析,结果显示这两个气味受体与性信息素受体区别明显,并与其他普通气味受体聚类在一起。半定量RT-PCR的结果显示HarmOR9与HarmOR29都主要在触角中高表达且无雌雄间差异,HarmOR29在其他组织中均不表达;而HarmOR9在雄虫下唇须中有微量表达,在其他组织中均不表达。【结论】本研究从棉铃虫中克隆得到2个气味受体基因HarmOR9和HarmOR29的cDNA全长,其编码产物具有气味受体的典型特征并且属于普通气味受体。明确了这两个气味受体基因都在棉铃虫成虫的触角中高表达,且无雌雄差异,推测其可能参与了棉铃虫普通气味的识别过程。     

棉铃虫气味结合蛋白HarmOBP16的组织表达谱及配基结合特性分析

【目的】揭示棉铃虫Helicoverpa armigera气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因Harm OBP16的组织表达谱及其重组蛋白与气味化合物的结合特性。【方法】基于棉铃虫触角转录组数据,利用PCR技术从棉铃虫成虫触角中PCR克隆气味结合蛋白基因,并进行生物信息学和系统进化分析;采用qPCR对其进行组织[头部(去除触角和喙)、胸部、腹部、足、翅、触角和喙]表达谱分析;进一步采用原核表达系统表达和纯化重组蛋白;最后采用荧光竞争结合实验测定该重组蛋白与85种候选气味物质的结合能力。【结果】从棉铃虫成虫触角中克隆得到一个Atypical OBP家族基因Harm OBP16(Gen Bank登录号:JQ753074),其开放阅读框长441 bp,编码146个氨基酸,推断的编码蛋白等电点为6.87,具有10个保守的半胱氨酸。组织表达谱结果表明,Harm OBP16在雌成虫翅中高表达。纯化后的重组蛋白Harm OBP16对植物花的挥发物香叶基丙酮(Ki=14.2μmol/L)、β-紫罗兰酮(Ki=15.2μmol/L)、辛醛(Ki=15.3μmol/L)、芳樟醇(Ki=16.8μmol/L)、(R)-(+)-柠檬烯(Ki=14.9μmol/L)和β-蒎烯(Ki=17.3μmol/L)有较强的结合能力。【结论】Harm OBP16可能在棉铃虫识别寄主植物的过程中发挥一定的作用,可为基于气味物质的棉铃虫引诱剂或驱避剂的研发提供潜在的分子靶标。     

绿盲蝽表皮蛋白基因AlCP17的克隆、多克隆抗体制备及表达谱分析

【目的】本研究旨在通过克隆绿盲蝽Apolygus lucorum表皮蛋白(cuticular protein, CP)基因AlCP17、制备其多克隆抗体和分析其时空表达特性,为AlCP17蛋白功能的研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽表皮发育过程中的信号通路图谱提供依据。【方法】基于前期转录组数据克隆绿盲蝽AlCP17的cDNA全长序列并进行生物信息学分析;构建AlCP17原核表达载体pCZN1-AlCP17并转化大肠杆菌Escherichia coli进行体外表达,利用纯化后的重组蛋白制备AlCP17蛋白多克隆抗体;qRT-PCR检测AlCP17在绿盲蝽不同发育阶段(1-5龄若虫和成虫)和3龄初期若虫不同组织(头、胸、足、中肠、脂肪体和表皮)中的表达谱。【结果】克隆获得绿盲蝽AlCP17全长cDNA序列(GenBank登录号：OM302231),其开放阅读框长594 bp,编码197个氨基酸,预测蛋白分子量为21.69 kD,理论等电点为6.11。编码的蛋白质具有典型的表皮蛋白结构特征,含有节肢动物表皮蛋白几丁质保守结合域(non-cysCBD),即Chitin＿bind＿4结构域;氨...     

梨小食心虫Minus-C气味结合蛋白的分子克隆、表达谱及结合特性分析

【目的】通过克隆梨小食心虫Grapholita molesta的Minus-C气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,并测定其在成虫不同组织中的表达量及其重组蛋白对气味配体的结合能力,推测其嗅觉生理功能。【方法】基于梨小食心虫雌虫触角转录组测序数据,利用RT-PCR克隆MinusC OBP基因的完整编码区;qPCR测定该基因在成虫不同组织[触角、头(去除触角)、胸、腹、足、翅]中的表达量;构建原核表达系统表达重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达和纯度;运用荧光竞争结合实验测定重组蛋白与35种气味配体的结合能力。【结果】成功克隆了梨小食心虫的一个Minus-C OBP基因,命名为GmolOBP14(GenBank登录号:MF066361)。GmolOBP14开放阅读框长411 bp,编码136个氨基酸,成熟蛋白具有4个保守的半胱氨酸残基,属于Minus-C OBP亚家族。GmolOBP14在雌雄成虫的不同组织中均有表达,但在雄成虫翅和雌成虫触角中的表达量显著高于同性别的其他组织。重组蛋白GmolOBP14与气味配体的结合谱较窄,仅能与16种配体表现出不同程度的结合活性,其中与梨酯和十二醛的结合能力较强,解离常数Ki分别为6.92和12.74μmol/L;与癸醛、十四醛、顺-3-己烯-1-醇、苯甲醇和己酸丁酯有中等程度的结合活性,Ki分别为25.54,20.61,24.35,23.44和23.33μmol/L;GmolOBP14对性信息素组分没有结合活性,提示该蛋白不参与对性信息素的感受和识别。【结论】根据GmolOBP14基因的组织表达特点及其重组蛋白的结合特性,推测GmolOBP14除具有选择性结合和运输寄主植物挥发物的作用外,还参与与嗅觉无关的生理过程。     

花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的克隆、原核表达及组织表达谱分析

【目的】本研究克隆花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)基因AzanOBP3,并对其进行序列和表达分析,旨在更好地了解OBP基因在花椒窄吉丁成虫触角识别气味物质过程中的作用,为农林害虫的绿色防控提供理论依据。【方法】利用RT-PCR扩增花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的cDNA序列,采用生物信息学软件分析其核苷酸和氨基酸序列;构建重组表达载体pET-28a(+)/AzanOBP3,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中进行融合蛋白的IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定重组表达蛋白;基于qPCR技术分析AzanOBP3基因在花椒窄吉丁雌雄成虫不同组织(头、胸、腹、足和翅)中的表达情况。【结果】克隆获得了花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP3的cDNA全长序列(GenBank登录号:MT318832),预测到其开放阅读框长414 bp,共编码137个氨基酸,等电点为4.79,蛋白分子量为16.038 kD,N末端具有29个氨基...     

绿盲蝽丝氨酸蛋白酶基因AlSP4的克隆及取食不同寄主植物后的表达谱分析

胰蛋白酶类和胰凝乳蛋白酶类丝氨酸蛋白酶是盲蝽科昆虫消化系统内重要的消化酶。为了更好地了解丝氨酸类蛋白酶在绿盲蝽Apolygus lucorum消化系统中的作用, 本研究首次克隆了绿盲蝽丝氨酸蛋白酶基因AlSP4 (GenBank登录号为JQ609682)。序列分析结果表明, 该基因开放阅读框长999 bp, 编码332个氨基酸, 预测分子量为36.84 kDa, 理论等电点为5.35, N末端疏水区包含有16个氨基酸组成的信号肽。蛋白特征分析表明, 该基因翻译后的蛋白质具有丝氨酸蛋白酶的典型特征, 即氨基酸序列中具有组氨酸(His)、 天门冬氨酸(Asp)以及丝氨酸(Ser)残基组成的酶活性催化中心三元件; 该基因翻译后还具有明显的胰蛋白酶前体的特征, 即此基因具有信号肽、 激活肽以及胰蛋白酶N末端保守的起始氨基酸序列(IVGG)。利用荧光定量PCR技术对绿盲蝽雌、 雄成虫取食不同寄主植物后AlSP4的表达谱进行分析, 结果表明: 相对于其他寄主植物, 雌成虫取食Bt棉后AlSP4的表达量最高, 并显著高于取食常规棉后的表达量(P＜0.01)。雄成虫取食茼蒿后AlSP4的表达量最高; 雄成虫取食Bt棉后, AlSP4的表达水平仅次于取食茼蒿后的表达量, 也显著高于取食常规棉后的表达量(P＜0.01)。由此可见, AlSP4是绿盲蝽取食Bt棉后的重要消化酶基因, 对绿盲蝽适应Bt棉取食具有重要作用。     

棉铃虫齿唇姬蜂嗅觉受体基因 CchlOrco 的克隆及组织表达谱分析

【目的】昆虫的嗅觉受体（olfactory receptors, ORs）一般以气味分子特异的ORs与共受体（ co-Receptor, Orco）通过形成异质二聚体在嗅觉感受中发挥关键作用,其中Orco由于具有序列的保守性而受到广泛的重视。本研究旨在克隆棉铃虫齿唇姬蜂 Campoletis chlorideae 的Orco基因,并对其组织表达谱进行分析。【方法】利用RT-PCR技术和转录组分析技术克隆棉铃虫齿唇姬蜂的Orco基因,并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;利用Real-time PCR技术对该基因在该蜂成虫不同组织中的表达量进行分析。【结果】获得了棉铃虫齿唇姬蜂 Orco 的全长cDNA序列,命名为 CchlOrco（GenBank登录号：KP255444）。序列分析表明, 该基因开放阅读框全长1 437 bp,编码478个氨基酸,预测该氨基酸序列具有7个跨膜区。CchlOrco 主要在成虫触角中表达,且在雄蜂触角中的表达量最高,是雌蜂触角中表达量的8.0倍,而在其他组织中表达量极低。【结论】本研究克隆了棉铃虫齿唇姬蜂 CchlOrco 序列全长,明确了其在成虫不同组织中的表达水平,为进一步研究该基因及其他嗅觉受体基因功能奠定了基础。     

桃蛀螟成虫Orco嗅觉受体基因的克隆及组织表达谱分析

【目的】克隆桃蛀螟Conogethes punctiferalis (Guenée)的Orco嗅觉受体基因, 并研究其在不同组织的表达谱。【方法】利用PCR技术克隆桃蛀螟触角Orco基因, 对该基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 并利用荧光定量PCR技术分析该基因在的表达量。【结果】获得桃蛀螟成虫Orco的cDNA全长序列, 并命名为CpunOrco（GenBank登录号： JX101681）。该基因的开放阅读框全长1 425 bp, 编码475个氨基酸, 序列中有7个跨膜区。对桃蛀螟成虫不同组织中CpunOrco的荧光定量PCR结果表明, CpunOrco主要在触角和下颚须中表达, 雄虫触角中的表达量高于雌虫, 并且该基因在其他组织中也有一定的表达。【结论】本研究明确了该嗅觉受体基因在桃蛀螟成虫不同组织内的表达水平, 为进一步研究其功能提供了理论依据。     

光肩星天牛气味结合蛋白AglaOBP12的基因克隆、表达及配体结合特征

【目的】克隆和鉴定光肩星天牛Anoplophora glabripennis气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)基因,明确其表达特点及与寄主植物挥发物的结合特性,有助于阐明光肩星天牛嗅觉识别的分子机制。【方法】根据光肩星天牛雌成虫触角转录组数据,利用RT-PCR克隆OBP12基因,并进行生物信息学分析。通过实时定量PCR(qRT-PCR)测定OBP12在光肩星天牛成虫触角、头(移除触角)、胸、腹、足、翅中的转录水平。利用原核表达系统和Ni离子亲和层析技术表达和纯化OBP12重组蛋白,荧光竞争结合实验测定重组蛋白与39种气味配体的结合能力。【结果】获得光肩星天牛气味结合蛋白基因AglaOBP12(GenBank登录号:KX890109)的完整编码序列,其开放阅读框长414 bp,编码137个氨基酸,N末端具有18个氨基酸组成的信号肽序列,蛋白序列具有6个保守的半胱氨酸残基,Agla OPB12属于Classical OBPs亚家族基因。qRT-PCR测定结果表明,AglaOBP12主要在成虫触角中表达,在其他组织微量表达。在待测的39种寄主植物挥发物中,重组蛋白AglaOBP12仅与19种化合物具有结合活性,表明AglaOBP12对寄主植物挥发物具有明显的选择结合特性。重组蛋白AglaOBP12与十二烷醇、十四烷醇、法尼醇、十二醛、乙酸-顺-3-己烯酯和β-石竹烯的结合能力较强,结合常数分别为1.96,0.96,1.03,0.82,0.77和0.74μmol/L。【结论】明确了AglaOBP12的核苷酸和氨基酸序列组成,重组AglaOBP12蛋白与主链有12个碳原子的醇类、醛类和萜烯类挥发物有特异性的结合活性。根据AglaOBP12基因的表达特点和重组蛋白的结合特性,推测AglaOBP12在光肩星天牛成虫定位补充营养寄主植物中发挥重要作用。     

甘薯蚁象气味结合蛋白CforOBP8的基因表达谱及配体结合特性分析

【目的】明确甘薯蚁象Cylas formicarius气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP) OBP8的基因表达谱及与配体化合物的结合特性。【方法】基于甘薯蚁象成虫转录组数据,利用RT-PCR方法从甘薯蚁象成虫触角中克隆了气味结合蛋白OBP8基因,并进行生物信息学分析;采用qPCR方法测定该基因在甘薯蚁象成虫触角、口器、翅和跗节中的表达谱;构建原核表达载体,进行诱导表达及蛋白纯化。利用荧光竞争结合实验测定纯化的重组蛋白与16种配体化合物(1种性信息素和15种植物挥发物)的结合特性。【结果】获得甘薯蚁象气味结合蛋白基因CforOBP8(GenBank登录号:MH549528)的完整编码序列,其开放阅读框长414 bp,编码138个氨基酸,预测分子量为15.56 kD,等电点为4.71,N末端具有21个氨基酸组成的信号肽序列,蛋白序列具有4个保守的半胱氨酸,CforOBP8属于Minus-C OBPs亚家族。荧光定量PCR结果表明,CforOBP8在甘薯蚁象成虫触角中特异性表达,在其他组织中微量表达。SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。CforOBP8与配体化合物的结合力测试表明,CforOBP8与性信息素(E)-2-丁烯酸顺-(Z)-3十二烯基酯结合能力最强,解离常数K_i为4.13μmol/L;其次与5种植物挥发物也有一定的结合能力,依次为乙酸顺-3-己烯酯(K_i=7.54μmol/L)、柠檬烯(K_i=15.23μmol/L)、橙花醇(K_i=16.31μmol/L)、壬醛(K_i=28.71μmol/L)和苯乙醛(K_i=29.54μmol/L)。【结论】CforOBP8可能是甘薯蚁象性信息素结合蛋白,并且在感受性信息素和寄主植物挥发物的过程中都发挥作用。     

亚洲小车蝗触角转录组及化学感受蛋白基因表达谱分析(英文)

【目的】化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是一类小分子的可溶性蛋白,在昆虫中发挥多种作用。本研究旨在组装中国北方主要草原害虫之一——亚洲小车蝗Oedaleus asiaticus的触角转录组,鉴定出化学感受蛋白基因以及分析其在成虫不同组织中的表达水平。【方法】利用RNA-s eq 亚洲小车蝗成虫触角进行转录组测序和组装;通过筛选转录组数据库、克隆及测序,鉴定出化学感受蛋白基因;应用qPCR分析CSP基因在成虫不同组织(触角、去除触角和口器的头、上唇、去掉下唇须的下唇、下唇须、下颚须、胸部、跗节、翅和腹部)中的表达模式。【结果】成功构建了亚洲小车蝗成虫触角转录组,共获得61 629个unigenes,平均长度为733 nt,总长度和N50分别为45 175 449和1 130 nt。其中26 064个unigenes(42.29％)注释到6个数据库(NR, NT, Swiss-Prot, KEGG, COG和GO)。通过Blast验证、克隆和测序鉴定出17个CSP基因;BlastP和系统发育分析表明亚洲小车蝗CSPs(OasiCSPs)与东亚飞蝗Locusta migratoria CSPs(LmigCSPs)和沙漠蝗Schistocerca gregaria CSPs(SgreCSPs)关系最密切。qPCR分析表明,8个CSP基因在成虫不同组织中的表达水平存在显着差异,特别是,OasiCSP8在下唇须和下颚须中高表达,而OasiCSP11和OasiCSP13在触角中表达量最高。OasiCSP15在化学感受器官(触角、上唇、去掉下唇须的下唇、下唇须、下颚须和跗节)中的表达量远高于非化学感受器官(去掉触角和口器的头部、胸部、翅和腹部)中的表达量,而OasiCSP12在几乎所有测定的组织中具有相似的表达分布。【结论】OasiCSPs在亚洲小车蝗化学感受和发育过程中可能起着多种作用,这些结果为进一步研究这些化学感受蛋白在亚洲小车蝗中的功能奠定了基础。