基于CRISPR-Cas9的筛选文库类型及应用

文库筛选技术广泛应用于生命科学研究各领域,加速了生物医药基础科研和临床实践的进展。本文对基于CRISPR-Cas9的文库类型和应用进行综述。CRISPR-Cas9文库包括敲除、活化和抑制文库。敲除文库通过Cas9/sgRNA靶向切割DNA序列,产生移码突变进行基因敲除。活化文库包括两种：一种是dCas9/sgRNA与转录活化蛋白质融合,例如dCas9-SAM,dCas9-SunTag和dCas9-VPR系统;另一种是dCas9与表观遗传修饰酶融合,例如dCas9-Tet1和dCas9-p300系统。CRISPR-Cas9抑制文库通过dCas9与表观遗传修饰蛋白质融合,抑制转录,例如dCas9-KRAB和dCas9-Dnmt3a系统。目前,CRISPR-Cas9文库广泛用于功能基因筛选、药物靶点和耐药靶点筛选、病毒靶点筛选和揭示信号通路,并在基因互作筛选及揭示顺式调节元件功能等方面初步展现其优势。CRISPR-Cas9文库优势在于其设计灵活、操作便捷、筛选高效。伴随基因编辑系统的研发,新的筛选文库靶向性和突变将更加精准,应用将更加拓展和深化。基于CRISPR-Cas9筛选文库不仅可以筛选病理和生理过程中的关键基因和非编码DNA,还可以揭示其发挥功能的分子机制,是剖析生命复杂调控网络的手术刀。     

基于CRISPR-Cas9的筛选文库的类型与应用

文库筛选技术广泛应用于生命科学研究各领域,加速了生物医药基础科研和临床实践的进展。本文对基于CRISPR-Cas9的文库类型和应用进行综述。CRISPR-Cas9文库包括敲除、活化和抑制文库。敲除文库通过Cas9/sgRNA靶向切割DNA序列,产生移码突变进行基因敲除。活化文库包括两种:一种是dCas9/sgRNA与转录活化蛋白质融合,例如dCas9-SAM,dCas9-SunTag和dCas9-VPR系统;另一种是dCas9与表观遗传修饰酶融合,例如d Cas9-Tet1和d Cas9-p300系统。CRISPR-Cas9抑制文库通过dCas9与表观遗传修饰蛋白质融合,抑制转录,例如d Cas9-KRAB和d Cas9-Dnmt3a系统。目前,CRISPR-Cas9文库广泛用于功能基因筛选、药物靶点和耐药靶点筛选、病毒靶点筛选和揭示信号通路,并在基因互作筛选及揭示顺式调节元件功能等方面初步展现其优势。CRISPR-Cas9文库优势在于其设计灵活、操作便捷、筛选高效。伴随基因编辑系统的研发,新的筛选文库靶向性和突变将更加精准,应用将更加拓展和深化。基于CRISPR-Cas9筛选文库不仅可以筛选病理和生理过程中的关键基因和非编码DNA,还可以揭示其发挥功能的分子机制,是剖析生命复杂调控网络的手术刀。     

Nat Med:利用CRISPR-Cas9进行全基因组筛选找到胰腺肿瘤弱点

正在科学家们建立了CRISPR-Cas9基因编辑技术之后,该技术得到了广泛利用。一些研究利用CRISPR-Cas9基因编辑工具进行基因筛选,在癌细胞内找到了一些可以用于开发潜在治疗方法的基因弱点。最近,来自加拿大多伦多大学的研究人员在RNF43突变的胰腺导管腺癌(PDAC)细胞中进行了全基因组范围的CRISPR-Cas9筛选,并找到了可以用于治疗该类型癌症的潜在抗体药物。这种类型的PDAC依赖Wnt信号进行增殖。在这项研究中,研究人员通过筛选发现一个有FZD5参与的Wnt信号通路     

基于CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展

功能性基因的筛选是探索生物进程、研究疾病发生发展和诠释基因功能的重要方法,在生物、医药、新治疗靶点筛选及肿瘤耐药等方面有广泛的应用。CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)技术作为近期热门的基因编辑工具,能够高通量地对基因组进行精准修饰,为实现功能性基因的筛选提供了简便高效的技术支持。文中对CRISPR-cas9技术应用于功能性基因筛选的方法及研究进展进行了综述。     

国内外CRISPR-Cas基因编辑技术主要申请人专利布局分析

CRISPR-Cas系统作为全球应用范围最广的基因编辑工具,是全球顶尖研究机构与企业科技创新与技术布局的重点。本文基于CRISPR-Cas基因编辑领域相关专利数据,在分析全球与我国CRISPR-Cas基因编辑技术相关专利发展态势的基础上,筛选具有代表性的专利申请人进行重点研究,揭示了国内外基因编辑领域的发展态势与创新布局特点,并对进一步优化我国该领域技术布局策略提出启示与建议。     

CRISPR⁃Cas9技术在植物次生代谢物生产中的研究进展

基因编辑（gene editing）技术可以对目的基因进行定点插入、敲除和置换。基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术是继锌指核酸酶和转录激活样效应物核酸酶之后的第3代基因编辑技术。近年来,CRISPR-Cas9系统作为研究的热点被广泛应用于医学、药学、植物学、动物学和微生物学等领域,但其在植物次生代谢物领域的应用还处于探索时期。阐述了基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的发展历程、工作原理和几种常用的基因编辑方法及其应用实例,总结了CRISPR-Cas9技术在对植物次生代谢产物研究方面的应用。利用CRISPR-Cas9系统可对植物基因组进行定点敲除、突变和插入,以达到提高植物次生代谢物含量、改良作物品质和提高植物抗性等目的。该技术已在植物次生代谢物生物合成关键酶基因的编辑等方面显示出越来越重要的作用。     

CRISPR相关转座元件的研究及应用进展

CRISPR-Cas的基因编辑能力引发了人们对该系统的研究热潮。除了实现基因的敲除和插入,CRISPR-Cas系统还可以被应用于基因簇重组、单碱基编辑和基因转录调控,推动了生物工程领域的发展。然而,有限的同源重组效率使CRISPR-Cas系统的应用受到了一定的限制。与CRISPR-Cas系统相比,移动遗传元件(mobile genetic elements,MGE)在转座酶的调控下,不需要依赖同源重组即可将指定DNA片段定向插入到细胞染色体中。近几年,人们发现了具有转座机制的CRISPR相关的转座元件,它可以介导DNA靶向整合,同时其出色的重编程能力为该领域的研究带来了新的发展。本文主要介绍近年来CRISPR-Cas系统相关转座元件的研究方向和应用进展,以及人工融合的dCas9-transposase系统的应用策略。文中还提出了CRISPR相关转座元件未来的应用前景和潜在挑战,为基因编辑工具的发展方向提供了参考意见。     

CRISPR-dCas9转录调控系统及其在遗传病治疗研究中的应用

CRISPR-Cas9是一种强大的基因组编辑系统,随着研究的深入,科学家建立了调控基因组转录的CRISPR-dCas9系统。该系统的建立基于dCas9的发现,dCas9丧失核酸酶活性,虽不具有DNA切割活性,但仍然具有DNA结合活性,其可在sgRNA的引导下靶向目的基因,将特定的转录激活因子(或抑制因子)携带至目的基因上游,实现对目的基因的转录激活(CRISPRa)或转录抑制(CRISPRi)。目前该系统已用于遗传病治疗的实验研究,取得了可喜的进展,具有潜在的临床应用价值。该文从CRISPR-dCas9系统建立、发展以及在几种遗传病治疗领域的研究进行了综述。     

CRISPR-Cas9基因编辑技术在构建实验动物肿瘤模型中的应用进展

CRISPR-Cas9是一种以细菌和古细菌抵御外源核酸入侵的免疫机制为基础开发出来的新型基因编辑技术。与传统的锌指核酸酶(ZFN)、胚胎干细胞(ES细胞)打靶和转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)技术相比,该基因编辑技术具有操作简单、更加高效、更容易获得纯合子突变体、细胞毒性小、无物种限制等优势,但也存在脱靶效应等缺点。目前,CRISPR-Cas9技术已被广泛用于肿瘤相关研究中,尤其在构建实验动物肿瘤模型中取得许多重要成果。我们主要对CRISPR-Cas9基因编辑技术在构建实验动物肝癌模型、结直肠癌模型、肺癌模型、宫颈癌模型、白血病模型、脑瘤模型中的研究现状及应用进展做简要综述。     

CRISPR-Cas9基因编辑技术在肿瘤治疗中的研究进展

CRISPR-Cas9基因编辑技术具有简单、高效、针对性强的特点,可通过编辑DNA序列治疗一些难治的具有遗传基础的疾病,特别是癌症。近年来,此技术主要用于遗传修饰动物模型的制备与药物开发,现已进入癌症临床试验阶段,并获得喜人的成效,极具临床价值。本文对CRISPR-Cas9系统在肿瘤治疗中的研究进展,包括功能基因筛选、递送系统和免疫疗法等方面进行概述,探讨了其在临床转化中所面临的问题,并展望了发展前景,旨在为今后应用该技术进行肿瘤精准治疗提供参考。     

基于GEO数据库的肝癌相关基因的筛选及验证

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是中国高发的恶性肿瘤之一,识别肝细胞癌发生发展相关基因,对于深入研究肝癌发病机制和开发诊疗靶点均具有重要意义.本研究利用GEO2R工具从基因表达汇编数据库(Gene Expression Omnibus Database,GEO)筛选5个数据集中共有的差异表达基因作为潜在的肝癌相关基因.利用Metascape网站,对差异表达基因进行功能富集及信号通路分析.结合GEPIA(Gene Expres-sion Profiling Interaction Analysis)网站筛选具有临床意义的基因.利用荧光定量PCR技术验证与肝癌预后相关的差异表达基因,候选肝癌相关基因,为后续的深入研究奠定扎实的基础.结果显示,从5个数据集中共发现94个共有的差异表达基因.文献检索后发现24个基因与肝癌发生发展的关系少见文献报道,属于肝癌中未知功能基因.利用GEPIA分析癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)中数据后发现,GINS1在肝癌组织中高表达,与肝癌患者生存期呈负相关;CFHR4和DNASE1L3在肝癌组织中显著低表达,与肝癌患者生存期呈正相关.荧光定量PCR技术证实GINS1在81.3％的肝癌组织中呈现高表达,CFHR4和DNAS-E1L3分别在71.9％和93.8％肝癌组织中低表达.因此,本研究发现GINS1、CFHR4和DNASE 1L3在肝癌组织中显著差异表达,与肝癌患者的预后密切相关,可能作为潜在的判断肝癌患者预后的分子标志物和研发肝癌治疗的潜在靶标.     

基于CRISPR/Cas9系统在全基因组范围内筛选功能基因及调控元件研究进展

CRISPR/Cas9系统是一种近年来被广泛应用于基因组编辑的强大工具。通过将CRISPR/Cas9系统中的Cas9蛋白突变后,使其失去剪切活性而成为dCas9 (nuclease-dead Cas9),再结合基因功能丧失(loss-of-function,LOF)、基因功能激活(gain-of-function, GOF)以及非编码功能基因鉴定技术即可实现全基因组高通量的功能基因及调控元件靶向鉴定和筛选。目前,该技术已被广泛应用于疾病免疫机理、药物靶点筛选和动物遗传育种等研究,为生命医学和基础科学带来了全新高效的技术方法和研究思路。本文综述了基于CRISPR/Cas9技术在全基因组中高通量筛选功能基因及调控元件的方法及研究进展,重点阐述了CRISPR/Cas9系统在动物细胞中筛选功能性基因的方法,以期为基因编辑及相关研究领域提供参考。     

Nature系列期刊导读

<正>科学家通过增加靶点范围来扩大CRISPR-Cas9技术的可用性近日,研究者们发现一种用来改善基因编辑工具CRISPR-Cas9 RNA引导核酸酶可用性和精确性的方法或许可以应用于其他细菌的Cas9酶中,他们发现了一种金黄色葡萄球菌Cas9酶类-Sa Cas9酶类突变体,该突变体可以识别更广范围的核苷酸序列,这或许可以帮助CRISPR-Cas9技术对此前无法靶向     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及其在RNA编辑中的潜在应用

化脓链球菌里的CRISPR-Cas9系统作为基因编辑工具已经得到广泛的应用。现有研究表明这个系统具有作为通用核酸识别技术的潜在价值,即Cas9系统也能靶向识别活细胞中的RNA。将RCas9与不同的蛋白因子融合,可能会实现基因表达调控、控制RNA的定位、改变RNA的组成和使RNA可视化等。在介绍CRISPR-Cas9系统介导的免疫机制的基础上,重点比较了RCas9和先前的RNA研究方法,从转录动力学、再生医学以及合成生物学等方面,综述了其潜在的应用价值,并对该系统在未来生命科学研究的应用进行了展望,以期为CRISPR-Cas9系统在RNA编辑方面的研究提供参考。     

CRISPR-Cas9基因编辑技术在秀丽线虫中的应用

基于细菌基因组规律成蔟的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)发展而来的新型基因编辑方法(CRISPR-Cas9)对生物医学研究是一场划时代的革命。它几乎可用于大多数生物体的基因编辑。秀丽线虫是一种非常经典的遗传学模式生物,CRISPR-Cas9基因编辑技术进一步加速了对其基因功能及各种生物学问题的研究。文中主要总结CRISPR-Cas9基因编辑系统在遗传学模式生物秀丽线虫中的发展和应用。     

微小RNAs在肝癌中的作用机制及相关应用研究进展

微小RNAs(miRNAs)是一类内源性小型非编码RNA,可通过调控靶基因表达参与大多数生物学过程。近年来,miRNAs在肝癌发生发展进程中相关作用机制的研究逐渐深入,miRNAs作为其中关键调控因子和主要参与者,已成为肝癌早期诊断、靶向治疗和预后评估中的一个关键靶标。本文着重强调miRNAs在肝癌发生发展、多重耐药性中的作用以及作为肝癌潜在治疗靶点的价值,并就miRNAs在肝癌中的功能、分子作用通路以及应用三方面的相关研究进展进行综述。     

增殖相关信号通路在肝癌中的研究进展

肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一.随着分子生物学技术的迅速发展,阐明肝癌的分子机制以及发现新的治疗靶点,是当今肝癌领域的研究热点之一.目前,已发现肝癌的发病与细胞内增殖信号通路有关,比如Wnt/β-Catenin、PI3K/AKT、JAK/STAT、Hedgehog、Hippo等.本文介绍了细胞增殖与肝癌的关系、肝...     

伴HBV感染性肝癌调控枢纽基因筛选与初步鉴定

慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染引起的原发性肝癌涉及多种基因、转录本和蛋白质的相互作用及调控。从单个基因的角度来看,某个基因的表达量的改变只能对肝癌发生发展的局部作出解释而无法从整体行为进行深入和全面的探索,无法满足高度复杂性的调控研究需要。筛选乙肝相关性肝癌的基因芯片数据获取差异表达基因后,应用加权基因共表达网络分析算法构建基因共表达网络,识别与肝癌发生相关的模块,利用可视化筛选枢纽基因,并针对枢纽基因进行基因本体富集分析和初步验证。富集分析和文献挖掘一致发现,某些枢纽基因确实与多种癌症的发生与发展存在显著的关联。权重基因共表达网络分析方法被证明是一个高效的系统生物学方法,应用该方法发现了新的HBV相关性肝癌枢纽基因。经实验验证,发现枢纽基因SHARPIN促进细胞迁移。该研究对肝癌发生的调控机制以及发现HBV慢性感染导致肝癌的新型诊断标志物和(或)药物作用靶点提供了新的视野。     

来自细菌的魔剪：2020年诺贝尔化学奖

CRISPR-Cas系统是在原核微生物中广泛存在的抵抗病毒(或质粒)入侵的防御系统。基于CRISPR-Cas9系统发展的基因组编辑工具可以方便快捷地实现对生物体内基因组的精确编辑,如突变基因的修复、有益基因的强化和有害基因的删除等,已在生命科学基础研究、经济物种遗传改良和人类医药健康等领域获得广泛应用,其主要发明人Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna教授于2020年荣获诺贝尔化学奖。CRISPR-Cas9基因组编辑技术在深刻改变生命科学与医学领域研究范式的同时,也提示丰富多彩的微生物资源依然是颠覆性生物技术创新的源泉,微生物前沿基础研究具有极其重要的战略意义。