Tau蛋白高度磷酸化致阿尔茨海默病动物模型研究进展

阿尔茨海默病（Alzheimer＇sdisease,AD）是老年人中最常见的神经退行性疾病,以过度磷酸化tau蛋白为核心形成的神经原纤维缠结为AD的主要病理特征之一。近年来对tau蛋白磷酸化的研究备受关注。在AD的实验研究中,探索理想的AD动物模型对于明确AD的病因、发病机制及药物的研发等方面起关键作用。本文对Tau蛋白磷酸化致AD主要动物模型的研究进展进行了综述,包括Tau转基因动物模型、激酶和磷酸化酶系统失衡致Tau蛋白过度磷酸化损伤模型、降低Tau蛋白糖基化致Tau过度磷酸化模型等。     

综述:环境因素与Tau蛋白的异常磷酸化

神经纤维缠结是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的重要病理特征之一,其发生发展因素一直是相关研究领域的热点问题．神经纤维缠结由异常磷酸化的Tau蛋白错误折叠、聚集所形成,因此对诱发Tau蛋白异常磷酸化的因素进行探究显得尤为重要．Tau蛋白异常磷酸化逐渐形成神经缠结是AD早期发生的病理过程之一,本文就Tau蛋白异常磷酸化发生的环境影响因素进行了讨论．     

甲醛诱导的磷酸化减弱Tau蛋白与DNA相互作用

异常磷酸化Tau蛋白是神经纤维缠结的主要成分,也是老年痴呆的典型病理特征之一.本实验室前期报道了Tau蛋白具有保护DNA的作用,但磷酸化对Tau与DNA相互作用的影响需要进行探索,这对于揭示Tau蛋白异常磷酸化与神经细胞死亡之间的关系具有一定的参考价值.本文采用甲醛孵育N2a细胞,引起了细胞内Tau蛋白的过度磷酸化.实验结果进一步显示,甲醛孵育组的细胞核内磷酸化Tau蛋白与DNA非共定位存在,而对照组细胞核内Tau蛋白与DNA存在一定程度的共定位现象.电泳迁移率实验检测GSK-3β催化的磷酸化Tau蛋白与DNA的结合情况,可以观察到磷酸化减弱了Tau蛋白与DNA的相互结合.这些结果表明,异常磷酸化可以使Tau蛋白丧失对DNA的保护作用,这可能是Tau蛋白异常磷酸化引起DNA损伤甚至细胞死亡的原因之一.     

Tau蛋白——Alzheimer病研究的新热点

Ｔａｕ蛋白——Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病研究的新热点顾琪贺林（上海生命科学研究中心,上海２０００３１）关键词Ｔａｕ蛋白Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病Ｔａｕ蛋白是一种神经原微管相关蛋白。处于异常磷酸化状态的Ｔａｕ蛋白集合成双股螺旋纤丝（ｐａｉｒｅｄｈｅｌｉｃａｌｆｉｌ...     

甲醛诱导Tau蛋白形成“孔道样”聚集结构

尽管Lin等(University of California, Santa Barbara)就蛋白构象病中细胞死亡的机制提出了“非特异性淀粉样离子通道”(aspecific amyloid ion channels)学说,但到目前为止,尚未发现神经Tau蛋白能形成“孔道样”聚集结构,也未寻找到可以导致蛋白质形成“孔道样”聚集结构的诱导剂．依据本实验室提出的“散发性老年痴呆发生发展中的内源性甲醛慢性损伤”假说,采用一定浓度的甲醛与Tau蛋白进行温育,观察到甲醛可以明显诱导Tau蛋白分子聚集并形成淀粉样沉积物,同时也观察到了Tau蛋白“孔道样”聚集结构．上述结果为探索甲醛诱导Tau蛋白错误折叠形成的产物导致细胞代谢障碍和死亡的机制提供了新的研究思路．     

阿纳其根总黄酮提取工艺及其对Tau蛋白过度磷酸化的研究

目的:优选阿纳其根总黄酮提取工艺条件及探讨其对Tau蛋白过度磷酸化的影响.方法:以单因素试验考察乙醇浓度、提取温度、提取次数、提取时间和液料比5个因素对阿纳其根总黄酮得率的影响,采用响应面法优化乙醇提取阿纳其根总黄酮的工艺条件.以冈田酸损伤PC12细胞作为研究模型,考察阿纳其根总黄酮对细胞存活率和Tau蛋白磷酸化位点的...     

Tau蛋白基因突变与神经退行性疾病

Ｔａｕ蛋白是神经细胞中含量最高的微管相关蛋白,其正常功能是促进微管蛋白（ｔｕｂｕｌｉｎ）组装成微管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）,并维持已形成微管的稳定性。Ｔａｕ蛋白的翻译后异常修饰与阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｄｉｓｅａｓｅ,ＡＤ）的神经原纤维退化有关［１］。本文综述最近有关Ｔａｕ蛋白基因突变,ＴａｕｍＲＮＡ剪接改变导致Ｔａｕ蛋白组成、结构和功能异常的机制,及其与几种神经退行性疾病的关系的研究。１．Ｔａｕ蛋白基因结构及其表达产物Ｔａｕ蛋白基因位于１７号染色体（１７ｐ２１．１１）,由１７个外显子…     

糖尿病大鼠脑细胞周期依赖性蛋白激酶5和蛋白激酶A参与调节Tau蛋白磷酸化

细胞周期依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase5,Cdk-5)及蛋白激酶A(protein kinaseA,PKA)是调节Tau蛋白磷酸化的重要激酶,其对糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠脑内Tau蛋白磷酸化的作用如何,目前尚不明确.为探讨胰岛素缺乏的DM大鼠海马Cdk-5及PKA对Tau蛋白磷酸化的作用,用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立DM大鼠模型,Fura-2负载及荧光测定细胞内游离Ca2 浓度,免疫沉淀法测定Cdk-5活性,放射性配体结合实验检测PKA的活性,蛋白质印迹检测Tau蛋白磷酸化的水平.结果提示:在DM大鼠海马神经元,Ca2 浓度升高,Cdk-5及PKA活性升高,Tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202和Ser396/Ser404位点的磷酸化增强.Cdk-5的特异性抑制剂roscovitine可降低DM大鼠Cdk-5活性,但不能降低PKA活性,使Tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202位点磷酸化水平降低,但不降低Ser396/Ser404位点的磷酸化,roscovitine处理正常大鼠后,上述酶的活性及Tau蛋白的磷酸化无明显变化.首次从整体水平上证实DM大鼠海马Cdk-5及PKA活性升高,协同促进Tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202位点和Ser396/Ser404位点的磷酸化,神经元内游离Ca2 浓度升高可能起重要作用.     

Cdk-5过度表达对Tau蛋白磷酸化的影响

目的 实验旨在细胞水平研究cdk-5过度表达对微管相关蛋白tau的磷酸化的影响。方法 利用基因转染技术建立过度表达cdk-5的鼠成神经瘤细胞株(N2a细胞株),免疫沉淀及酶活性检测法检测cdk-5的酶活性,免疫荧光技术和免疫印迹技术检测细胞内tau蛋白的磷酸化状况。结果 在N2a细胞株转染组中,cdk-5表达增加,并使得抗体tau-1显色减弱,PHF-1显色增强,提示tau蛋白在Ser199/202,Ser396／404位点过度磷酸化。与此同时,cdk-5酶活性较未转染组提高3.5倍。结论 这些结果提示细胞水平的cdk-5的过度表达会导致cdk-5酶活性增加和tau蛋白过度磷酸化,而过度磷酸化的tau蛋白可能参与了AD的病理过程。     

人参皂甙Rb1减轻冈田酸诱导的大鼠海马神经元Tau蛋白过度磷酸化

为研究人参皂甙Rb1(ginsenoside Rb1)对冈田酸(okadaic acid,OA)诱导的大鼠海马神经元Tau蛋白过度磷酸化的影响及其可能机制,实验随机分为正常组、溶媒对照组、OA模型组和Rb1预处理组。正常组不作任何处理;Rb1预处理组大鼠分别用5、10、20 mg/kg的Rb1预处理,每天一次,共14 d,于第13天向海马背侧注射1.5μl OA[0.483 μl,溶于10% 二甲基亚砜(dimethysulphoxide,DMSO)];OA模型组大鼠于第13天时海马背侧注射OA,溶媒对照组则注射等体积的生理盐水。各组均于第15天收取标本。通过Biescbowski’s染色、免疫组化和Western blot,分别观察大鼠海马神经元胞体和突起内神经原纤维的改变和磷酸化Tau蛋白的表达水平,同时检测蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase-2A,PP2A)活性以探讨其作用机制。结果显示:(1)OA模型组与溶媒对照组及正常组比较,海马神经元胞体和突起着色较深,染色不均匀;神经元中Thr231和Sei396位点磷酸化的Tau蛋白和总Tau含量增多;PP2A活性则明显下降(P<0.01):(2)Rb1预处理组大鼠海马神经元胞体和突起染色均匀,神经原纤维走行规则;海马神经元中Thr231和Ser396位点磷酸化的Tau蛋白和总Tau 含量较OA模型组减少,而PP2A活性明显增高(P<0.01)。以上观察结果表明,人参皂甙Rb1可以减轻OA诱导的大鼠海马神经元Tau蛋白过度磷酸化,其机制可能与提高PP2A活性有关。     

Tau蛋白核心片段306~378的异源表达、纯化及聚集特性验证*

Tau是一种微管相关蛋白,其生理功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管并维持微管的稳定。由于Tau蛋白异常聚集沉淀而导致的疾病被称为Tau蛋白病,其中阿尔茨海默病是最常见的一种类型。全序列Tau含有441个氨基酸残基,其中306~378肽段(Tau_306-378)为驱动其聚集的核心区域。Tau_306-378包含R3和R4微管结合序列以及从R4序列C端向后延伸的10个氨基酸残基。首先利用pET22b载体在大肠杆菌中表达获得了Tau_306-378,然后用镍亲和层析进行纯化,终产量约为10.35mg/L。利用SDS-PAGE、Western blot和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱依次对Tau_306-378进行了鉴定。其中SDS-PAGE和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的研究结果表明,表达的Tau_306-378主要以单体形式存在,但同时含有部分二聚体。最后,硫黄素T荧光染色实验显示该重组蛋白具有良好的聚集特性,可用于体外Tau蛋白的聚集特性、毒性及相关抑制剂开发的研究。     

人源Tau蛋白截短片段转基因果蝇模型的建立

人Tau蛋白是一种主要的细胞骨架蛋白,由Tau蛋白组成的神经纤维缠结是阿尔茨海默病的两大病理特征之一,C末端缺失的Tau已经证实是神经纤维缠结的组份之一,体内体外实验已经证实,Tau蛋白可以是多种蛋白酶的水解底物。但是,Tau蛋白水解产生的截短片段在阿尔茨海默病中的作用目前还不清楚。为了能够在在体水平研究Tau蛋白截短片段的毒性机制,将Tau蛋白截短成不同的截短片段:Tau1-44、Tau45-441、Tau45-230、Tau231-441。利用显微注射的方法构建Tau基因截短片段的转基因果蝇,并利用果蝇中的UAS/GAL4系统驱动截短的Tau蛋白片段在果蝇的眼睛中异位表达,该实验结果发现在果蝇眼睛中过表达Tau蛋白截短片段并没有对果蝇眼睛的发育造成明显的毒性,从而推断Tau蛋白水解是机体的一种自我保护机制。     

抑制褪黑素生物合成对大鼠Tau蛋白磷酸化的影响

目的 研究抑制褪黑素的生物合成对大鼠海马Tau蛋白磷酸化的影响。方法 侧脑室注射氟哌啶醇并腹腔注射加强,利用免疫组化检测大鼠海马区域Tau蛋白磷酸化情况;HPLC检测血清中褪黑素水平。结果 模型组大鼠海马Tau蛋白在Ser199/Ser202和Ser396/Ser404位点均发生异常过度磷酸化,褪黑素治疗组较模型组的磷酸化程度轻。结论 褪黑素水平的降低可能与AD样Tau蛋白异常过度磷酸化相关,外源性补充褪黑素可以减轻Tau蛋白的异常过度磷酸化。     

骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中Tau蛋白的表达

目的：观察骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为神经细胞过程中,神经元微管相关蛋白Tau及其磷酸化位点pSer202的表达和含量的差异,探讨Tau蛋白在此过程中的作用。方法：使用EGF和bFGF联合诱导第4、第8和第12代的MSCs向神经细胞分化;14d后,免疫细胞化学法检测Tau蛋白和pSer202的表达;ELISA法分析各代细胞Tau蛋白含量。结果：第4、第8和第12代未诱导组Tau蛋白阳性细胞均〈6％;诱导14d后,各代MSCs在形态上均分化为类似神经元样细胞,Tau蛋白阳性细胞率较未诱导组显著升高（P〈0．05）,但各代之间无显著性,而pSer202在各代MSCs未诱导组和诱导组中均未见表达。ELISA法检测发现Tau蛋白含量在诱导过程中呈上升趋势,14d时各代细胞分化后的Tau蛋白升高程度无显著性差异。结论：MSCs向神经细胞分化过程中Tau蛋白表达量增加且可能尚未发生磷酸化,将有助于神经细胞的正常分化和突触形成。     

Tau 蛋白磷酸化在阿尔茨海默病中所处的地位

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种老年人常见的神经系统退行性疾病,是痴呆最常见的病因。AD患者越来越多,给家属及社会带来严重负担造成了巨大的家庭和社会负担,这就迫使我们进一步探讨AD发病机制。在AD的众多发病机制中,tau蛋白假说倍受青睐。在蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)、糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、细胞周期依赖性蛋白激酶-5(cyclin-dependent kinase 5,CDK-5)和Bcl-2等蛋白酶及调节蛋白作用下,微管相关蛋白tau蛋白以其异常磷酸化结构或是形成二聚体、寡聚体和神经原纤维缠结等形式,参与到AD的病理过程。Tau蛋白及其相关结构,可能启动或促进了AD的凋亡,亦可能抑制了急性凋亡却促进了慢性的神经细胞变性。揭开这一谜底,可能揭开AD病理改变的神秘面纱。     

大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中Tau蛋白表达的研究

目的探讨Tau蛋白在新生大鼠大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中的表达及意义.方法采用细胞培养、免疫细胞化学方法(SABC法)观察及计算机图像分析技术测定Tau蛋白在神经干细胞定向分化为神经元过程中不同时段的表达情况.结果在神经干细胞定向分化为神经元的过程中,Tau蛋白由核周淡染分布渐至在胞体与突起中密集均匀分布,随着突起伸展而不断地延伸,并且Tau蛋白的表达量逐渐增加.结论新生大鼠大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中,Tau蛋白的时空表达与神经干细胞定向分化的神经元形态变化有一定的相关性并在此过程中发挥着重要的作用.     

肥胖及2型糖尿病大鼠Alzheimer病样Tau蛋白过度磷酸化修饰及机制探讨

Tau蛋白异常过度磷酸化修饰在阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)发病机理中起非常重要的作用,而2型糖尿病是AD的风险因素之一.采用蛋白质印迹研究2型糖尿病及单纯肥胖大鼠脑中海马回tau蛋白磷酸化程度,发现在这两种大鼠模型中海马tau蛋白在多个位点上都呈现过度磷酸化状态.同时,胰岛素信号传导系统中的关键酶糖原合成激酶-3β(glycogensynthasekinase-3β,GSK-3β)活性在这两种大鼠模型的海马回中明显增高,经脑立体定位法向大鼠海马回注射GSK-3β抑制剂氯化锂(LiCl),可阻止2型糖尿病及肥胖大鼠模型中的GSK-3β激活,但仅阻止单纯肥胖大鼠海马回tau蛋白过度磷酸化.另外,海马神经细胞膜上胰岛素受体β亚基水平在两种实验模型中显著下降.研究结果表明,2型糖尿病及肥胖可能通过增高胰岛素抵抗,从而导致GSK-3β激活和tau蛋白的过度磷酸化来提高AD的发病风险.2型糖尿病脑中低下的葡萄糖代谢也可能在tau蛋白的过度磷酸化起一定作用.     

运动与阿尔茨海默病：基于Tau蛋白翻译后修饰视角的研究述评

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种与年龄有关的神经退行性疾病,严重危害老年人的身心健康,给社会带来巨大的经济压力。但目前其发病机制尚不完全明确,临床仍无根治的有效方法。Tau蛋白是一种微管相关蛋白质,能够参与维持微管相关结构稳定,具有可溶性且不会聚集。在AD病理状态下,病人脑内Tau蛋白结构和功能异常。异常的Tau蛋白聚集成不可溶的神经纤维缠结,损害微管运输能力,导致病人认知功能障碍。Tau蛋白结构和功能的改变是由多种翻译后修饰过程来调控的,即将特定的化学修饰基团与Tau蛋白N-端或C-端结合,直接改变蛋白质的性质和功能。AD病人脑内Tau蛋白的磷酸化、糖基化、乙酰化及SUMO化等多种翻译后修饰异常,与Tau蛋白的降解和毒性物质的聚集密切相关。本文综述近年来的研究后发现,运动可以通过改善Tau蛋白翻译后的某些异常修饰来预防和改善AD,主要作用方式如下：(1）运动可通过抑制GSK 3β和MAPK等蛋白激酶活性来抑制Tau蛋白的过度磷酸化,可能通过上调PP2A活性来促进Tau蛋白去磷酸化;(2）运动可通过提高GLUT1和GLUT3蛋白质水平,可能通过调节OGA和OGT活性平衡,提高蛋白质O-GlcNAc糖基化水平;(3）运动可能通过AMPK/mTORC1途径抑制p300以及激活SIRT1,降低Tau蛋白乙酰化水平;同时运动还可能通过抑制HDAC6,改善Tau蛋白KXGS基序异常乙酰化程度;(4）运动可能通过调节磷酸化与SUMO化共定位点,改善Tau蛋白异常SUMO化水平。     

α-Synuclein蛋白聚集状态与帕金森病形成

帕金森病是一种常见的老年神经退行性疾病,其致病机理复杂.其中α-synuclein基因是较早发现的与帕金森病相关的基因,其编码的α-synuclein蛋白是帕金森病神经元内出现的一种蛋白包涵体结构——路易体的主要组成成分.最近的研究结果显示,α-synuclein蛋白存在不同聚集状态间的转换,其中聚集过程中形成的寡聚体中间构象具有较强的细胞毒性,可能对帕金森病的发病过程有着重要作用;而且这种聚集状态的转换过程受到多种遗传学与细胞学因素的影响,从而在某种程度上反映了帕金森病发生形成的遗传学与细胞学机制.本文将对α-synuclein蛋白聚集状态转换特性及其在帕金森病发病过程中作用机制方面的研究进展作一综述．