过表达白鳍鲨硒结合蛋白1对HL-7702细胞镉胁迫的解毒作用

硒结合蛋白1（Selenium—binding protein 1,SBP1）与肿瘤相关,并可以与重金属镉直接结合。该研究构建了白鳍鲨SBP1重组质粒Myc-SBP1并转染人HL-702细胞,利用CCK-8和CFDASE检测Cd胁迫下的细胞增殖情况,利用流式细胞仪检测细胞内ROS的水平。结果显示,过表达白鳍鲨sBP1可拮抗cd对HL-7702细胞的毒害作用。在100μmol／L的CdCl2应激下,表达SBP1组存活率为76．4％。约为对照组存活率的2倍,实验组的细胞增殖指教和分裂能力也略高于对照组。一级结构分析表明,白鳍鲨SBP1具有两个CXXC区域,为抗氧化位点,具有2个HxD和3个HXXH保守区域,它们为推测的Cd结合位点,为在HL-7702细胞中表达白鳍鲨SBP1蛋白能拮抗Cd的结构基础。此外,ROS检测实验表明白鳍鲨SBP1蛋白能显著降低胞内ROS水平,提示硒结合蛋白除通过直接与Cd结合降低毒性外,降低重金属引起的氧化胁迫也可能发挥一定解毒作用。     

水稻硒结合蛋白基因OsSBP的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究水稻硒结合蛋白(selenium-binding protein, SBP)基因的功能,以水稻品种日本晴(Oryza sativa Japonica)为材料,采用同源克隆法获得Os SBP,并对其进行组织特异表达及生物信息学分析。结果表明,Os SBP基因cDNA序列为1 623 bp,包括长度为1 449 bp的CDS,碱基组成为A 23.3%、T 25.1%、G 28.9%、C 22.6%,编码482个氨基酸残基组成的蛋白质。Os SBP蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水;二级结构中以无规则卷曲和延伸链结构为主,三级结构同源建模成功,主要是螺旋和转角;亚细胞定位Os SBP主要分布在细胞质中,推测可能在运载结合、辅助因子中发挥重要作用,无跨膜结构域,无信号肽;该蛋白序列中存在24个丝氨酸磷酸化,11个苏氨酸磷酸化位点和10个酪氨酸磷酸化位点以及6个糖基化位点。启动子元件分析表明,其含有与热胁迫、干旱胁迫、光反应、细胞防御、赤霉素(GA)和茉莉酸甲酯(MeJA)信号传导相关元件。进化分析结果表明,克隆的Os SBP氨基酸序列与短柄草、高粱的同源关系较近,具有较高的保守性,与莱茵衣藻的同源关系较远。RT-PCR分析结果表明,Os SBP基因在各组织中均有表达,水稻孕穗期中茎的表达最高,其次分别为叶和根,穗中表达量最低,且该基因的表达受Cd,盐和热的诱导,以及PEG和Cold的抑制。该基因的成功克隆及分析为进一步研究Os SBP在水稻抗逆中的作用奠定了重要的基础。     

人脑红蛋白(NGB)全长cDNA序列的克隆

人脑红蛋白(neuroglobin, NGB)是新发现的神经系统特异的携氧蛋白, 然而其全长cDNA序列一直未见报道. 采用电子序列延伸技术和cDNA序列末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)研究发现, 人NGB全长cDNA序列为1 909 bp, 5′非编码区为375 bp, 编码区(456 bp)可编码151个氨基酸, 3′非编码区为1 078 bp, 其中含27 bp的poly(A)(GenBank接受号: AF422797). 综合采用电子序列延伸技术与RACE技术是获得全长cDNA序列的有效方法, 为后续的功能研究提供了重要基础.     

草鱼cadm2b基因的克隆及在成体组织中的表达分析

为研究CADMs（Cell adhesion molecules）在草鱼构建抵御病害感染的第一道防线中发挥的作用,用RT-PCR和RACE方法结合测序分析,在草鱼脑组织中检测到了该基因家族成员cadm2b基因的4条不同的cDNA全长序列。序列比对结果表明这4条全长cDNA在5'端的序列完全相同,在3'端的3个局部区域有不同片段的缺失。因此,可以确定这4条不同的mRNA是cadm2b的不同剪接体。这4条不同的剪接体被分别命名为cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6。cadm2b的cDNA序列全长1669 bp,开放阅读框（ORF）1203 bp,编码400个氨基酸。cadm2bX2的cDNA序列全长2783 bp,开放阅读框长1323 bp,编码440个氨基酸;cadm2bX3的cDNA序列全长2755 bp,开放阅读框1296 bp,编码431个氨基酸;cadm2bX6基因的cDNA序列全长2649 bp,开放阅读框1161 bp,编码386个氨基酸。根据碱基序列所进行的氨基酸序列和蛋白结构预测显示这4个CADM2b蛋白亚型都具有CADM家族保守的4个功能区,但其C端的蛋白结合位点存在差异。CADM2b具有近膜4.1蛋白结合位点和Ⅱ型PDZ蛋白结合位点,CADM2bX2、X3缺失了PDZ蛋白结合位点,而CADM2bX6则同时缺失4.1蛋白和PDZ蛋白的结合位点。实时定量RT-PCR检测结果显示cadm2b剪接突变体是该基因mRNA的主要形式。半定量RT-PCR和套式PCR实验检测结果表明cadm2b基因在草鱼成体脑中高水平表达,在肝、肾、心脏和肌肉组织中有微量表达。这种表达模式提示草鱼中CADM2b主要是由非免疫细胞,而不是由免疫肥大细胞合成分泌的细胞黏附因子,可能通过介导免疫肥大细胞与病原靶细胞的黏附而起非特异性抵御病害感染的作用。     

鲢鱼解偶联蛋白2全长cDNA序列的克隆及其组织表达

从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)肝脏,通过简并引物克隆解偶联蛋白2(un-couplingprotein2,UCP2)cDNA核心序列,应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏UCP2cDNA全序列。序列分析结果表明,鲢鱼肝脏UCP2cDNA全长1452bp,其中5′-UTR长337bp,3′-UTR长182bp,编码区933bp,编码310个氨基酸,推测的氨基酸序列包含线粒体内膜载体蛋白3个特征结构及解偶联蛋白(UCPs)的特征序列。对鲢鱼不同组织UCP2的表达调控研究发现,鲢鱼组织UCP2基因在肠道、肝脏、肌肉、脂肪组织均大量表达,而在脑组织表达量较低,这与鲢鱼体内微囊藻毒素在这几个组织的分布完全一致,表明UCP2的功能可能与抑制微囊藻毒素引发过量活性氧(ROS)生成有关。     

血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)漆酶基因的克隆与序列分析

为克隆血红密孔菌 (Pycnoporussanguineus)漆酶基因 ,根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计了 1对简并引物 .以血红密孔菌基因组DNA为模板 ,PCR扩增出长 12 2 7bp的漆酶基因片段 .以此序列为基础 ,通过 5′及 3′RACE技术克隆出漆酶全长cDNA序列 ,序列长为 190 2bp ,其 5′端和 3′端非编码区长分别为 5 1bp和 2 97bp ,开放阅读框长 15 5 4bp ,编码 5 18个氨基酸的蛋白 .该蛋白具有 4个铜离子结合区域 ,预测其相对分子量为 5 6 313 2 ,等电点为 5 5 9,其氨基酸序列与Pycnoporuscinnabarinus漆酶 (lcc3 2 )的同源性最高 ,为 96 % .以该cDNA编码区的两端序列为引物 ,PCR扩增得到漆酶的长度为 2 15 4bp的全长DNA序列 ,序列中包括 10个内含子序列 ,长为 5 2～ 70bp     

鲢鱼解偶联蛋白2全长cDNA序列的克隆及其组织表达

从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)肝脏，通过简并引物克隆解偶联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2) cDNA核心序列，应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列，最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏UCP2 cDNA全序列。序列分析结果表明，鲢鱼肝脏UCP2 cDNA全长1 452 bp，其中5′-UTR长337 bp，3′-UTR长182 bp，编码区933 bp，编码310个氨基酸，推测的氨基酸序列包含线粒体内膜载体蛋白3个特征结构及解偶联蛋白(UCPs)的特征序列。对鲢鱼不同组织UCP2的表达调控研究发现，鲢鱼组织UCP2基因在肠道、肝脏、肌肉、脂肪组织均大量表达，而在脑组织表达量较低，这与鲢鱼体内微囊藻毒素在这几个组织的分布完全一致，表明UCP2的功能可能与抑制微囊藻毒素引发过量活性氧(ROS)生成有关。     

北京鸭卵磷脂胆固醇酰基转移酶的cDNA和蛋白质的结构分析

为获得不易感动脉粥样硬化动物北京鸭卵磷脂胆固醇酰基转移酶 (LCAT)的cDNA和蛋白质序列 ,分析其结构特点 .以从北京鸭肝脏mRNA反转录获得的cDNA一链为模板 ,应用SMART RACE技术 ,获得了北京鸭LCAT的cDNA序列 ,推导出其蛋白质氨基酸序列 ,应用分子生物学软件对该蛋白的一级、二级结构进行分析和比较 .北京鸭LCATcDNA (在GenBank中的注册号为AF32 4 887)全长 195 3bp ,其中开放阅读框架 135 6bp ,编码 4 5 1个氨基酸 ,包括一个由 2 3个氨基酸构成的疏水性信号肽和一个由 4 2 8个氨基酸组成的成熟蛋白 .该成熟蛋白比人LCAT在C端多 12个氨基酸 ,其与鸡、人、家兔的同源性依次为 98%、83%和 82 % .与其它种属LCAT蛋白序列的比较结果表明 ,北京鸭LCAT蛋白质序列虽然在长度上和结构上与其它种属有一定的差异 ,但序列中与酶催化活性相关的序列均非常保守     

番石榴实蝇性别决定基因 Bcotra 和 Bcotra-2 的克隆、序列特征及表达分析

【目的】对番石榴实蝇 Bactrocera correcta (Bezzi)性别决定基因 transformer 和 transformer 2 的cDNA和基因组DNA序列进行克隆和分析,明确这2个基因的结构特征及其在不同发育阶段和雌、雄成虫不同组织中的表达模式,为进一步的功能研究和番石榴实蝇遗传性别品系(genetic sexing strain, GSS)的建立奠定基础。【方法】利用PCR结合RACE技术克隆番石榴实蝇2个性别决定基因的cDNA全长和内含子序列,利用不同的生物信息学软件对序列进行结构预测、序列比对和进化树分析;利用半定量RT-PCR检测这2个基因在番石榴实蝇的不同发育阶段及雌、雄成虫不同组织(精巢、卵巢、中肠和脂肪体)中的表达分布。【结果】克隆得到番石榴实蝇 transformer 和 transformer 2 的cDNA全长序列,分别命名为 Bcotra 和 Bcotra-2 。 Bcotra 存在性别特异剪接,雌虫 Bcotra 的cDNA全长1 673 bp,其开放读码框(ORF)为1 242 bp,编码413个氨基酸(GenBank登录号为KP712876);雄虫Bcotra cDNA全长2 025 bp,比雌虫多2个外显子,但由于外显子上有多个终止密码子,因此,不能编码完整的有功能的Tra蛋白(GenBank登录号为KP712877)。 Bcotra-2 不存在性别特异剪接,cDNA全长1 458 bp,其开放读码框(ORF)为756 bp,编码251个氨基酸,具有RNA结合蛋白的典型特征(GenBank登录号为KM658207)。Bcotra-2有8个外显子,7个内含子。氨基酸序列比对和系统进化关系表明,两个基因的系统发育关系一致,Tra-2与目前已报道的双翅目Tra-2具有很高的同源性,而Tra的保守性较Tra-2要低。半定量RT-PCR结果显示, Bcotra 和 Bcotra-2 在番石榴实蝇的不同发育阶段及雌、雄成虫不同组织中都有表达。【结论】本研究明确了Bcotra 和 Bcotra-2 的基因组DNA和cDNA结构特征,Bcotra 和 Bcotra-2 在番石榴实蝇的不同发育阶段和成虫不同组织中均有表达,序列分析发现这两个性别决定基因均具有Tra/Tra-2结合位点、内含子剪接抑制序列位点,其中 Bcotra 具有RNA结合蛋白的结合位点,暗示了这2个基因可能通过翻译后相互作用调控雌、雄体性发育。Bcotra 存在性别特异剪接,雌虫特有的一段963 bp的内含子序列可以用于番石榴实蝇遗传定性品系的载体构建。     

鳜两种生长抑素受体cDNA全长克隆与组织表达

利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了鳜(Siniperca chuatsi)脑中2种生长抑素受体(somatostatin receptor,SSTR2和SSTR3)cDNA全长序列。结果显示,鳜SSTR2 cDNA全长1 820 bp,含开放阅读框1 146 bp,编码382个氨基酸;SSTR3 cDNA全长1 874 bp,含开放阅读框1 458 bp,编码486个氨基酸。SSTR均由5个结构区域组成:N端、7个转膜区(TMD)、3个细胞外袢(ECLs)、4个细胞内袢(ICLs)和C末端。NJ系统进化树分析显示,鳜SSTR2和SSTR3分别形成相对独立的分支,两者间的氨基酸序列相似度为51.2%,表明它们是由不同基因编码而成。利用实时荧光定量RT-PCR技术检测了鳜SSTR2和SSTR3 mRNA的组织表达特征,它们均在多种组织中广泛表达,SSTR2 mRNA在肝中表达量最高,SSTR3 mRNA在胃中表达量最高。SSTR2、SSTR3表达差异反映它们可能参与不同生理调控作用。     

草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1基因的克隆和表达分析

成纤维细胞生长因子受体同源类似物1(fgfrhl-1)基因是目前仅在鱼类基因组中检测到的fgfr基因家族成员, 该序列在鱼类进化过程中高度保守。为研究fgfrhl-1基因的表达情况和具体的功能, 在亲缘关系较远的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和翘嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)中克隆了fgfrhl-1的cDNA序列, 并通过半定量RT-PCR和冰冻切片原位杂交分析了该基因在成体不同组织中的表达情况。克隆结果的序列分析表明: 草鱼fgfrhl-1 cDNA序列全长为1472 bp, 5′-UTR长213 bp, 3′-UTR长56 bp, 开放阅读框长1203 bp; 翘嘴鲌fgfrhl-1 cDNA序列全长为1886 bp, 5′-UTR长298 bp, 3′-UTR长385 bp, 开放阅读框长1203 bp。在两种鱼类中该基因都编码400个氨基酸, 其预测的氨基酸序列同源性高达95.5%。蛋白二级结构预测表明Fgfrhl-1具有FGFRs家族蛋白的胞内酪氨酸激酶区, 跨膜的螺旋区和胞外配体识别结合区, 但其胞外区比FGFRs缺少了3个免疫球蛋白样结构域。通过RT-PCR方法在两种鱼类的心脏、鳃、肝、脾、尾鳍以及肌肉组织的肌间隔中均检测到了fgfrhl-1表达, 但在肌纤维中均没有检测到其表达。对这两种鱼类的肌肉组织、肝脏和脾脏进行的组织切片原位杂交表明fgfrhl-1只在这些组织和器官的结缔组织及导管中表达, 不在间质细胞结构中表达。这些结果说明: fgfrhl-1的成体组织特异性表达模式在不同鱼类中基本一致, fgfrhl-1在鱼类各组织和器官的结缔组织和导管的细胞中表达, 不在间质细胞中表达。因此, fgfrhl-1可能在鱼类结缔组织及导管分化调控或功能维持中有独特作用。     

中缅树鼩UCP2 cDNA核心片段的序列分析

解偶联蛋白2(UCP2)是近年新发现的一种解偶联蛋白,具有多种生物学活性,相关研究表明,UCP2可以抑制某些细胞(如免疫细胞等)线粒体活性氧的过量生成.本研究通过设计简并引物进行RT-PCR从中缅树鼩(Tupaia belangeri肝中获得UCP2基因cDNA核心序列.该片段长745 bp,推测氨基酸序列为248个氨基酸.结构功能分析发现,此段氨基酸序列具有2个线粒体内膜载体蛋白特征结构、5个跨膜α-螺旋结构域、1个嘌呤结合区域(PNBD)以及3个解耦联蛋白质的特征序列.中缅树鼩UCP2氨基酸序列与普氏野马(Equus caballus)、小家鼠(Mus musculus)、家犬(Canis lupus familiaris)、人(Homo sapiens)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、豚鼠(Cavia porcellus)、苏门达腊猩猩(Pongo abelii)、加卡利 安鼠(Phodopus sungorus)和马铁菊头蝠(Rhinolophus ferrumequinum)UCP2进行比较,氨基酸同源性均在90％以上.同时,本研究通过MEGA5构建系统树,对UCP2分子进化特征进行了一定的探讨.     

棉花143-3L基因的分子鉴定及其在纤维发育中优势表达分析

14-3-3蛋白以二聚体形式存在于所有真核生物中,是一种高度保守的调节蛋白,在细胞生长、增殖、凋亡、信号转导等生命活动中发挥着重要调控作用。我们在棉纤维cDNA文库中分离克隆到1个基因(cDNA),编码14-3-3蛋白类似物,命名为Gh14-3-3L(Gossypiumhirsutum14-3-3-like)。该cDNA长度为1,029bp,包含762bp开放阅读框,其编码蛋白由253个氨基酸组成。Gh14-3-3L与其他真核生物的14-3-3蛋白具有较高的同源性,并具有14-3-3蛋白的基本结构:二聚体结构域、磷酸化丝氨酸富集识别序列、4个CC结构和1个EFHand结构。Northern杂交分析显示Gh14-3-3L在棉纤维发育早期优势表达,且在10DPA棉纤维细胞中表达量最高,这表明Gh14-3-3L基因可能涉及棉纤维细胞伸长过程的调节。研究还表明,该基因在胚珠和花瓣组织中也有较强的表达,但在其他组织中表达较弱或不表达。     

一个新的家蚕转录相关锌带蛋白基因的克隆及序列分析

锌带蛋白(zinc ribbon protein )是锌指类蛋白的一种,它的Cys4 Zn(2+)结合位点由3个β₂片层折叠而成,而不是α螺旋结构。锌带结构与锌指结构同为转录因子结合核酸的结构域,锌带蛋白作为转录相关因子在调节基因表达活性等方面具有重要作用。在对家蚕 Bombyx mori蛹cDNA文库测序中,发现一个新的编码家蚕锌带蛋白基因的EST序列（GenBank 登录号DY230964）,以此序列为信息探针检索家蚕EST数据库,通过同源筛选,获得一个新的家蚕锌带蛋白基因cDNA全序列并经RT-PCR检测和克隆、测序验证,结果表明与电子克隆序列完全一致。我们将其命名为 BmZNRD1 (Zinc Ribbon Domain Containing 1)（GenBank登录号DQ432055）。该基因全长为675 bp,由363 bp的开放阅读框序列(ORF)、10 bp的5′端非翻译区序列(5′UTR)和302 bp 的3′端非编码区序列(3′ UTR)组成,其编码的120个氨基酸序列与其他真核生物间具有较高的同源性（达60%左右）,预测分子量为13.54 kD, 等电点为6.8。BmZNRD1编码的氨基酸序列是一种锌带蛋白,推测有2个功能结构域,分别是位于N-端的Cx₂Cx₁₄Cx₂C和C-端的Cx₂Cx₂₄Cx₂C,其中C-端保守氨基酸序列Cx₂Cx₆Yx₃QxRSADEx₂TxFx₂Cx₂C在生物进化中保守性很高,从酵母、果蝇、线虫到两栖类、哺乳类都有发现该结构域的存在,与酵母RNA聚合酶A亚单位9和转录相关蛋白有很高的相似性,推测其具有相同的功能。将BmZNRD1基因cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有3个外显子,2个内含子,外显子/内含子边界符合经典的GT-AG规则。 关键词： 家蚕; 锌带蛋白基因; 电子克隆; 基因克隆; 序列分析     

西伯利亚蓼甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA克隆与序列分析

根据NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼茎部消减库中甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)表达序列标签序列设计引物,采用cDNA末端快速扩增技术,从西伯利亚蓼茎中扩增出GAPDH的全长cDNA序列。该cDNA序列全长1331bp,完整阅读框1014bp,编码337个氨基酸。属于稳定蛋白,具有GAPDH保守功能域。氨基酸组成与其他已知高等植物来自细胞质中的GAPDH基因cDNA序列具有很高的同源性,最高可以达到96%。通过转酿酒酵母INVSC1的NaHCO3和NaCl胁迫试验表明,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)有明显的抗盐胁迫特性。在10%NaHCO3和4mol·L-1 NaCl胁迫下,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)菌株存活率明显比INVSC1(pYES2)高,可以推测GAPDH基因赋予INVSC1(pYES2-GAPDH)抗NaHCO3和NaCl的能力。该基因的cDNA序列在GenBank中登录号为DQ922680。     

人ob基因克隆及其亚细胞定位的研究

目的:旨在克隆人肥胖(obese,ob)基因的全长cDNA序列,与EGFP重组构建融合蛋白表达载体,并分析其亚细胞水平的定位.方法:提取人脂肪细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出人ob基因cDNA,并克隆至真核表达载体pEGFP-CI,重组质粒转染NIH-3T3细胞,荧光显微镜分析EGFP-ob融合蛋白的亚细胞定位.结果:克隆的ob基因cDNA为501bp,共编码167个氨基酸,与GenBank公布的人ob基因序列一致,荧光显微镜分析表明,重组的EGFP-ob融合蛋白主要分布于NIT-3T3的细胞质中.结论:成功克隆了人OB基因的cDNA序列,构建人OB基因的真核表达载体pEGFP-CI-ob,融合蛋白EGFP-ob定位于NIH-3T3细胞质中.     

脑红蛋白与Na^＋，K^＋-ATP酶β2亚基的相互作用及作用位点的鉴定

为研究神经系统特异性携氧蛋白———脑红蛋白 (NGB)保护神经元耐受缺氧损伤的分子机制 ,利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与其有相互作用的蛋白质。序列分析表明 ,其中一个克隆的编码产物与Na ,K ATP酶 β2亚基 (NKA1b2 )序列一致。随后采用PCR方法从人胎脑cDNA文库中扩增获得NKA1b2全长cDNA。蛋白质结合实验表明 ,原核表达的NGB与体外转录翻译得到的NKA1b2在细胞外有结合作用。免疫共沉淀实验证明二者在生理条件下能够以复合物的形式存在。利用NGB系列短截体研究相互作用的位点发现 ,NGB蛋白N末端 1～ 75位氨基酸可与NKA1b2结合 ,但结合力很弱 ,而其C末端 75个氨基酸则与NKA1b2无结合作用 ,由此推测NGB蛋白整体的三维结构是结合所必需的。     

人蛋白C cDNA基因的克隆及序列分析

为实现人蛋白C cDNA在哺乳动物细胞中的表达以及研究其生物学特性,针对人蛋白C cDNA序列设计引物,运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胎肝总RNA中钓取人蛋白C cDNA,将其克隆入pIRES neo载体中,通过酶切和PCR鉴定出重组体并进行测序分析。结果表明,获得大小为1386bp的人蛋白C cDNA基因,成功构建人蛋白C cDNA载体pIRES/hPC,为进一步进行人蛋白C cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。     

天麻中一种抗真菌蛋白基因的克隆

依据天麻(GastrodiaelataBl.f.flavidaS.Chow)抗真菌蛋白GAFP_1的N端部分氨基酸序列设计简并引物,通过RACE(快速分离cDNA末端)的方法扩增得到GAFP_1全长cDNA。该cDNA包含一个编码171个氨基酸的ORF,推导的多肽序列与测得的蛋白质部分序列相同;在5′端有一个长为55bp的5′非编码区;终止密码子下游有一个141bp长的3′非编码区,其中含有两个加poly(A)信号及长度为26个腺苷酸的poly(A)。经检索发现该推导蛋白序列与火烧兰(Epipactishelloborine)和二叶兰(Listeraovata)的甘露糖结合蛋白以及雪花莲(Galanthusnivalis)中的甘露糖结合凝集素具有很高同源性。     

鸡二价金属转运蛋白1 cDNA的克隆与序列分析

鸡二价金属转运蛋白1（divalent metal transporter 1, DMT1）在动物胃肠道锰吸收过程中起重要作用.根据哺乳动物Dmt1同源蛋白氨基酸序列的保守性设计引物,应用3′RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,扩增并克隆获得鸡小肠Dmt1 cDNA 3′端1 289bp和1 092bp的2种片段,发现其3′端翻译区和非翻译区存在差异. 根据鸡Dmt1 cDNA 3′端片段的测序结果设计引物,扩增获得1个与3′端片段部分重叠的鸡Dmt1 cDNA 5′端907 bp片段,并对其进行了克隆测序. 根据鸡小肠Dmt1 3′RACE片段和5′RACE片段序列信息进行拼接,从而获得鸡小肠Dmt1 cDNA全序列信息.结果表明,鸡小肠Dmt1 cDNA有2种形式,1种全长为1 972个核苷酸,其中5′非翻译区为104个核苷酸,编码区1 695个核苷酸,3′非翻译区为173个核苷酸,编码1个含564个氨基酸残基的蛋白质;另1种形式为1 775个核苷酸,其中5′非翻译区为104个核苷酸,编码区1 593个核苷酸,3′非翻译区为78个核苷酸,编码1个含530个氨基酸残基的蛋白质.据鸡Dmt1 cDNA推测出的2种形式蛋白质的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠的Dmt1蛋白具有高度同源性,它们的同源性分别为82%、82%、80%,和 84%、84%、83%. 对推测氨基酸序列进行疏水性和跨膜区分析表明,Dmt1蛋白为1种跨膜整合蛋白,具有膜转运蛋白糖基化位点和底物结合位点的保守序列.