结构域B在鼠冠状病毒S蛋白的抗原性及膜融合中的作用

棘突(spike, S)蛋白是冠状病毒表面必不可少的跨膜糖蛋白,在病毒进入宿主细胞时具有结合受体和诱导膜融合的双重作用。大部分冠状病毒S蛋白的受体结合域位于S1-CTD(即相对应的结构域B),而经典的乙型冠状病毒模型鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus, MHV)的受体mCEACAM1a与S1-NTD(即相对应的结构域A)结合,其结构域B的作用仍未完全清楚。本研究通过构建结构域B和S2膜融合元件的缺失突变体,并使其在鼠神经母细胞瘤细胞系Neuro-2a内成功表达,证实了结构域B对病毒S蛋白导致的细胞-细胞间膜融合是必需的。用不同方法处理的病毒颗粒作为抗原免疫小鼠,所获得的多克隆抗体进一步显示,结构域B不但是S蛋白的主要抗原决定簇,而且能诱导中和抗体明显抑制病毒感染和S蛋白介导的膜融合作用。此结果为阐述不同冠状病毒的致病性与感染性差异提供了新思路。     

冠状病毒S蛋白及其受体的结构和功能

冠状病毒是有包膜的单股正链RNA病毒。作为人和动物的重要致病原,冠状病毒感染主要导致宿主呼吸系统、肝脏、胃肠道以及神经系统出现急性或慢性症状。2000年以来,传染性非典型肺炎和中东呼吸综合征的暴发,以及猪流行性腹泻病毒在全球猪群中的暴发流行,引起大家对动物冠状病毒的极大重视。S蛋白具有受体结合活性和膜融合活性,是冠状病毒感染细胞的关键蛋白;S蛋白在病毒的组织或宿主嗜性和毒力等方面发挥重要作用。本文重点对近年来冠状病毒S蛋白的结构、功能以及S蛋白与受体相互作用的研究进行综述,以期为冠状病毒的入侵机制和反向遗传学研究以及受体阻断药物的开发提供参考。     

猪肠道冠状病毒与入侵受体氨基肽酶N的相互作用

猪肠道冠状病毒是目前危害养猪产业的重要病原。目前已发现能够感染猪肠道的致病性冠状病毒有4种：猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒和猪肠道甲型冠状病毒。冠状病毒感染宿主的第一步是识别宿主细胞膜受体分子并与之结合,随后启动入侵及膜融合进而使病毒基因组进入宿主细胞内部。因此,冠状病毒受体是决定其宿主范围及组织嗜性的关键因素。确定冠状病毒受体及病毒与受体的结合机制对预防新发病毒及开发冠状病毒治疗性药物具有重要意义。猪传染性胃肠炎病毒利用猪氨基肽酶N（aminopeptidase N,APN）作为感染宿主的功能性受体,并利用唾液酸作为辅助结合因子。猪APN最初也被鉴定为猪流行性腹泻病毒的功能性受体,但近年的研究结果与前面的报道存在较大的差异,产生了较大的争议。最近的研究认为,猪丁型冠状病毒的功能性受体也是APN,并且猪丁型冠状病毒能够利用多个物种的APN作为功能性受体,这与其跨物种传播具有密切关系。最新发现的猪肠道甲型冠状病毒则不使用APN作为其入侵受体。本文综述了前面3种猪肠道病毒感染宿主细胞的受体及结合机制的研究进展,并比较分析了猪APN及唾液酸在不同猪肠道冠状病毒入侵宿主过程中结合方式的异同,为进一步研究新发猪肠道冠状病毒受体提供参考。     

SARS-CoV-2入侵细胞的研究进展

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引发的肺炎疫情已蔓延全球,尽快认清病毒感染规律和致病机制是做好疫情防控的基础。SARS-CoV-2表面的刺突蛋白(Spike,S)识别靶细胞受体并与之结合,诱导病毒与细胞的膜融合,是病毒侵入宿主细胞的第一步,也是预防和治疗病毒感染的关键靶点。大量研究揭示了病毒进入细胞的分子机制,本文将主要对SARS-CoV-2入侵细胞的研究成果进行总结,并简要叙述以该环节为靶点的药物和疫苗研发现状。     

细胞质内模式识别受体及其抗病毒免疫研究

先天性免疫监视机制的核心是通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别病毒分子诱导抗病毒防御,使宿主免受感染。PRRs表达在不同类型细胞的不同细胞区室,包括细胞膜、内体膜、溶酶体膜和胞质。病毒进入细胞区室后将被一个或多个模式识别受体所识别并激活机体的免疫反应。主要对细胞质内模式识别受体视黄酸诱导基因I样受体(retinoic acid-inducible gene I(RIG-I)-like receptors,RLRs)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptors,NLRs)、DEXDc螺旋酶受体(DLRs)及最近发现的DNA模式识别分子——DAI(DNA-dependent activator of interferonregulatory factors)识别病毒核酸并诱导I型干扰素产生的分子机制作一综述。     

鼠冠状病毒核衣壳蛋白的抗体制备与抗原决定簇分析

核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白有稳定病毒基因组、调控病毒复制及细胞状态的特殊作用。鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus,MHV)为乙型冠状病毒属的原型病毒,是研究冠状病毒N蛋白功能的经典模型。本研究用去污剂处理鼠冠状病毒粒子暴露N蛋白,另用原核表达纯化的重组N蛋白分别免疫小鼠,制备多克隆及单克隆抗体。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和蛋白免疫印迹分析结果显示两类抗体均具有高灵敏度和特异度,与甲型冠状病毒猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的N蛋白无交叉反应。原核表达缺失突变的N蛋白分析结果显示,多克隆抗体与单克隆抗体2E6识别的鼠冠状病毒N蛋白抗原决定簇完全一致,位于N端结构域(N-terminal domain,NTD)C端与SR之间的58个氨基酸残基内。此外,基于单克隆抗体2E6的ELISA及免疫荧光法能检测到感染细胞中和培养上清液中的N蛋白组分,且其含量与病毒复制的滴度一致。这些结果表明,鼠冠状病毒复制过程中粒子与细胞中的N蛋白可能维持相似的结构,使NTD与SR之间的部分氨基酸残基一直暴露在表面,从而形成了优势抗原决定簇。     

蝙蝠SARS样冠状病毒WIV1利用小鼠ACE2受体研究

严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)是一种感染人类的高致病性病毒,由蝙蝠SARS样冠状病毒(SL-CoV)演化而来。血管紧张素转换酶2(ACE2)是SARS-CoV受体,影响病毒宿主范围、致病性和种间传播。先前研究表明,SARS-CoV和一些SL-CoV株(如WIV1)可以有效利用人、果子狸、蝙蝠ACE2入侵细胞,而SARS-CoV可以低效利用小鼠ACE2。啮齿动物种类多,分布广,包括多种重要的试验动物模型,不过SL-CoV利用啮齿动物ACE2的研究较少。本研究通过假病毒感染试验,比较了SARS-CoV BJ01株和SL-CoV WIV1株利用人类、果子狸、蝙蝠、小鼠ACE2及其突变体进入细胞的效率,并利用蛋白结合试验比较了BJ01和WIV1受体结合结构域(RBD)结合不同ACE2及其突变体的能力。结果显示,SL-CoV WIV1可以有效利用小鼠ACE2进入细胞,且WIV1 RBD与小鼠ACE2结合效率与人和果子狸ACE2相同,强于蝙蝠ACE2;而不同物种ACE2的L440P突变能显著降低其与BJ01及WIV1的RBD结合的能力,抑制假病毒入侵。研究结果表明,小鼠ACE2是SL-CoV WIV1的功能受体,且ACE2的L440是影响病毒入侵的关键氨基酸位点。本研究有助于进一步了解SL-CoV的受体识别、跨种传播机制,对今后类似冠状病毒的防控具有重要意义。     

SARS冠状病毒S蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化

导致严重急性呼吸综合征(sevcre acute rcspiratory syndrome,SARS)的元凶是一种新型的冠状病毒(SARS coronavirus,SARS-CoV)。SARS-CoV感染入侵宿主细胞关键的一环是病毒自身的棘突蛋白(spike protein,S-protein)与细胞受体的相互作用,故而S蛋白己成为SARS研究的主要热点。     

新冠病毒刺突糖蛋白结构与功能的生物信息学分析及原核表达

SARS-CoV-2是一种高致病性且传播迅速的病原体,通过刺突糖蛋白(Spike glycoprotein,S蛋白)识别宿主细胞表面的受体来实现入侵和感染。对S蛋白进行系统的生物信息学分析和原核表达,有助于深入理解S蛋白的功能和阐明该蛋白介导病毒感染的分子机制。本文采用Protparam、Pfam、TMHMM、ExPASy-ProtScale、PSORTⅡ、SignalP、UniProt、NetPhos 3.1、NetNGlyc 1.0、NetOGlyc 4.0和BLAST等生物信息学软件和数据库对S蛋白的理化性质、亚细胞定位、翻译后修饰及相互作用网络等生物学特性进行了系统分析。利用Clustal X2和MEGA7.0软件对该蛋白进行了基于氨基酸序列的同源性分析和系统进化分析。最后,通过分子克隆技术构建重组表达载体pET-22b-S并进行原核表达。结果显示,S蛋白由1273个氨基酸组成,分子量141.2 kD,等电点6.24,有两个卷曲螺旋结构,一个跨膜螺旋区,疏水性较强。S蛋白包含刺突受体结合结构域和S2糖蛋白结构域,主要分布于宿主细胞的内质网膜和细胞膜,含有136个潜在的磷酸化位点和20个可能的糖基化位点。与SARS-CoV-2 S蛋白序列一致性最高的是SARS冠状病毒、SARS冠状病毒WH20和蝙蝠冠状病毒HKU3,均为76%。SARS-CoV-2与SARS冠状病毒和蝙蝠冠状病毒聚为一大支,提示它们可能具有共同的祖先。S蛋白主要在细菌裂解液离心之后的沉淀中表达,这为后续的结构分析和疫苗研发奠定了基础。S蛋白在SARS冠状病毒和蝙蝠冠状病毒之间保守性较高,提示其在病毒入侵过程中具有重要功能。SARS-CoV-2与SARS冠状病毒和蝙蝠冠状病毒可能具有共同的祖先。本研究为SARS-CoV-2 S蛋白的表达纯化、结构与功能研究提供了重要的数据基础,有助于全面揭示S蛋白的生物学功能,同时为设计和筛选靶向S蛋白的新型抗病毒药物提供了科学依据。     

SARS 冠状病毒 S 蛋白受体结合结构域的表达及其表位作图

严重急性呼吸综合征 (SARS) 是一种新出现的人类传染病,该病的病原是 SARS 冠状病毒 (SARS-CoV). S 蛋白是 SARS 冠状病毒的一种主要结构蛋白,它在病毒与宿主细胞受体结合以及诱导机体产生中和抗体中起重要作用 . 研究表明 S 蛋白与受体结合的核心区域为第 318 ~ 510 氨基酸残基的片段 . 首先克隆并用 pGEX-6p-1 载体融合表达了该受体结合结构域,并且通过蛋白质印迹分析表明,该受体结合结构域融合蛋白能被 SARS 康复患者血清和 S 蛋白特异的单克隆抗体所识别 . 为了对这一区域进行抗原表位作图,进一步设计了一套 23 个覆盖受体结合结构域的长 16 个氨基酸残基的部分重叠短肽,并进行了 GST 融合表达 . 用免疫动物血清和单克隆抗体 D3D1 对 23 个融合蛋白进行蛋白质印迹和 ELISA 免疫反应性分析,结果鉴定出两个抗原表位 SRBD3(F334PSVYAWERKKISNCV349) 和表位 D3D1 (K447LRPFERDI455). 其结果对进一步分析 S 蛋白结构与功能以及诊断试剂和基因工程疫苗的研究有一定意义 .     

病毒受体的研究方法

1概况病毒受体可以定义为位于宿主细胞表面能够被病毒吸附蛋白识别并与之结合,从而引起病毒感染的分子复合物,其化学本质是糖蛋白、蛋白聚糖、脂类或糖脂,大多数属于蛋白质。病毒受体可以是单体也可以是多分子复合物,具有特异性、高亲和性、饱和性、结合位点及靶细胞部位的有限性以及独特的生物学活性等[1]。病毒受体是公认的引发病毒感染宿主细胞的主要决定因素,也是影响病毒宿主特异性和组织亲嗜性的决定因素之一。研究病毒受体的特性及其功能对于从分子水平阐明病毒感染与免疫的机制,深刻理解病毒与宿主细胞的相互关系,研制更有效的病毒…     

多功能的胞内衔接蛋白syntenin

Syntenin蛋白是在原核生物及真核生物中广泛存在的一类胞内衔接蛋白（adaptor proteins）. Syntenin由N端结构域（N-terminal domain,NTD）、两个串联的PDZ结构域(postsynaptic density protein, disc large and zonula occludens, PDZ)和C端结构域（C-terminal domain,CTD）组成,在生物进化过程中相对保守. Syntenin蛋白的PDZ结构域可与不同膜受体C端的PDZ结合基序（PDZ-binding motif,PBM）特异性结合, PDZ结构域结合受体的多样性导致了syntenin功能的多样性. 本文综述了syntenin蛋白的发现与分布及其结构特征,对syntenin在肿瘤转移、细胞质膜蛋白组装、参与动物免疫等领域的研究成果进行了较为详细的综述,同时介绍了syntenin在参与动物胚胎发育调控、血管生成和轴突生长等方面的研究进展.     

新型冠状病毒的糖基化、糖受体识别及糖链抑制剂的发现北大核心CSCD

新型冠状病毒疫情(COVID-19)是21世纪截至目前人类面对的最为严重的公共卫生事件。疫苗、中和抗体以及小分子化合药物的出现有效预防和阻止了COVID-19的快速传播,而不断出现的病毒突变体却使这些疫苗及药物的效价降低,这对COVID-19的预防及治疗提出了新的挑战。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)通常会先黏附于呼吸道表面的大分子糖链——硫酸乙酰肝素,进而与特异性受体人血管紧张素转化酶2(human angiotensin-converting enzyme 2,hACE2)结合,从而实现对人体的侵入。SARS-CoV-2的刺突(spike,S)蛋白是高度糖基化的,而糖基化对于hACE2与S蛋白的结合也有着重要影响,S蛋白在宿主体内还会被一系列凝集素受体所结合,这意味着糖链在SARS-CoV-2的入侵及感染过程中有着重要的作用。基于SARS-CoV-2的糖基化及糖受体识别机制开发糖链抑制剂可能是预防或治疗新型冠状病毒感染的有效手段,相关研究发现海洋来源的硫酸化多糖、肝素分子及其他的一些糖类具有抗SARS-CoV-2的活性。本文系统阐述了新型冠状病毒的糖基化及其糖链在入侵、感染中的作用,并对抗SARS-CoV-2糖链抑制剂的发现和机制研究现状进行了总结,在此基础上还对糖类抗病毒药物的机遇与挑战进行了展望。     

棘突蛋白在冠状病毒跨宿主感染中的作用

冠状病毒感染有相对严格的宿主和组织特异性,其中部分病毒演化中会发生细胞嗜性改变。冠状病毒的跨宿主感染能力主要取决于病毒表面棘突蛋白的变异及其与受体相互作用的特异性改变。棘突蛋白的变异主要集中在受体结合域（RBD）,其他区域也与病毒感染的宿主细胞特异性有关。另外,较大的RNA基因组、独特的套氏亚基因组转录、复制过程中模板转换引起的高频率基因重组等使冠状病毒不断出现毒力或宿主变异,而共感染和持续性感染则为病毒重组及跨宿主感染提供了机会。     

以色列急性麻痹病毒(IAPV)的特性及入侵受体的研究进展

以色列急性麻痹病毒（Israeli acute paralysis virus, IAPV）是一种严重危害蜜蜂健康的病毒,其感染特性主要表现为较强的传染性和致病性。IAPV能感染多种宿主,不仅能感染蜜蜂,还能感染熊蜂、无刺蜂、胡蜂和蚂蚁等昆虫以及狄斯瓦螨Varroa destructor。受体是决定其宿主范围和嗜性组织的重要因素,病毒入侵过程中关键的一步就是与受体蛋白结合,但迄今为止,国内外针对蜜蜂病毒的受体研究较为匮乏,尚无该病毒受体报道。NPC（NPC intracellular cholesterol transporter）,一种细胞内转运胆固醇的蛋白,是多种昆虫病毒的胞内受体,在病毒感染中扮演着关键的角色。之前研究表明,该蛋白可能与蜜蜂病毒的感染过程有关。本文综述了IAPV的特性和可能的入侵受体,包括病毒分子结构特征、流行与传播、宿主范围以及感染机制,以期深入认识IAPV的发病机制。     

病毒受体的研究方法

1概况 病毒受体可以定义为位于宿主细胞表面能够被病毒吸附蛋白识别并与之结合,从而引起病毒感染的分子复合物,其化学本质是糖蛋白、蛋白聚糖、脂类或糖脂,大多数属于蛋白质.病毒受体可以是单体也可以是多分子复合物,具有特异性、高亲和性、饱和性、结合位点及靶细胞部位的有限性以及独特的生物学活性等[1].病毒受体是公认的引发病毒感染宿主细胞的主要决定因素,也是影响病毒宿主特异性和组织亲嗜性的决定因素之一.     

疱疹病毒膜融合的分子机制

囊膜病毒与宿主细胞的膜融合是病毒入侵宿主细胞的重要过程,这一过程涉及到病毒囊膜表面糖蛋白与宿主细胞表面受体之间的相互作用和构象变化．疱疹病毒有多个糖蛋白及不同类型的细胞作用受体,相应的受体-糖蛋白复合体构成方式也有多种,其引致的膜融合机制被认为是目前病毒融合机制研究中最复杂的,近年来被广泛研究并取得突破性进展．从病毒糖蛋白与相应受体的结构与功能、受体-糖蛋白复合体的形成与入侵途径,以及膜融合模式几个方面,全面综述疱疹病毒膜融合的分子机制,并展望了未来研究趋势．     

生物信息学分析包膜与非包膜病毒的受体蛋白差异

病毒与受体相互作用对于病毒感染宿主细胞至关重要.为了深入理解病毒对于受体蛋白的选择机制,本研究从结构、功能、宿主蛋白相互作用网络以及组织表达量等四个方面系统性地分析和比较了哺乳动物中包膜与非包膜病毒的受体蛋白差异.结果表明,包膜病毒和非包膜病毒的受体蛋白具有相似的结构域组成和功能,但是非包膜病毒的受体蛋白相对于包膜病毒具有更多的结构域数目、更高的N-糖基化水平、在宿主蛋白相互作用网络中有更高的连接度和节点介数、以及在宿主中有更高的表达.本研究有助于加深我们对于哺乳动物中包膜与非包膜病毒受体选择机制的理解,同时也对病毒受体的鉴定具有一定的参考价值.     

冠状病毒的基因组结构及特征

冠状病毒(Coronavirus)是具有包膜的正单链RNA病毒,基因组大小介于26 000与32 000 nt之间,编码刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核壳蛋白(N)等四种结构蛋白、复制酶(ORF1a/b)与若干辅助蛋白,部分病毒还具有血细胞凝集素酯酶(HE),这些蛋白除维持病毒结构,还有促进感染与抵抗宿主免疫反应等功能,其中刺突蛋白可与宿主细胞表面的受体结合,使病毒包膜和宿主细胞的膜融合以感染细胞.冠状病毒的感染会影响细胞的许多信号转导途径,引发免疫反应,是一类可感染哺乳动物与鸟类的病毒.     

口蹄疫病毒与宿主细胞的相互作用研究进展

口蹄疫病毒（FMDV）导致了偶蹄动物口蹄疫的发生,它是一类有着自身特点的RNA病毒。首先,FMDV衣壳蛋白VP1识别结合宿主细胞膜上的整联蛋白等受体,以内吞的方式进入细胞,利用宿主细胞成分完成病毒蛋白的合成。这些新合成的L^pro、2C和3C^pro等病毒致病因子进一步抑制宿主基因的转录和翻译,诱导细胞凋亡和白噬,并抑制干扰素介导的一系列先天性和获得性免疫反应。宿主则在病毒侵染细胞的初期,利用病毒识别受体等来识别病毒并诱导合成干扰素等细胞因子,介导多种免疫反应以清除病毒。病毒和宿主两者在持续的利用和较量中完成疾病的发生和痊愈等。其次,不断发现的病毒受体、结合基序、致病因子及宿主细胞的多种免疫调节因子将成为相关领域新的研究内容。综上,开发高效安全疫苗、增强自身免疫力及利用RNAi直接抑制病毒RNA等便成为现代FMDV防治的主要内容。