黑斑狗鱼部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选

采用磁珠富集与放射性杂交相结合的方法开发黑斑狗鱼(Esoxreieherti Dybowski)基因组微卫星资源。基因组DNA经Sau3AⅠ限制性内切酶消化后,选取400―900bp的片段进行PCR全基因组扩增,并利用生物素标记的(CA)12、(GA)12探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中,然后利用γ-32P标记的放射性同位素探针进行第二次杂交。结果,共获得微卫星基因组文库1600个菌,杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为90.91%;杂交后得到的阳性克隆为1300个,占87.25%。从中挑出196个进行测序,192(97.96%)个含有微卫星序列。在得到的微卫星序列中,重复单元除CA/GT、GA/CT外,还观察到单碱基、四碱基、五碱基重复单元。根据侧翼序列应用引物设计软件PrimerPremier5.0设计引物70对,选择合成32对,通过优化PCR反应条件,结果有28对引物可扩增出清晰可重复的目的条带。本研究旨在对黑斑狗鱼基因组资源的开发利用起到一定的促进作用,并为黑斑狗鱼养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等奠定基础。     

黑斑原(鱼兆)微卫星DNA富集文库构建与鉴定

采用磁珠富集法,利用生物素标记的(CA)12寡核苷酸探针从黑斑原(鱼兆)基因组DNA MboI酶切的400—1000 bp片段中筛选CA/GT微卫星位点,洗脱的杂交片段克隆到pMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出720个阳性克隆,占所有克隆的89.2%,从阳性克隆中随机选取139个进行测序,序列分析发现,124个克隆含有7个以上的重复序列,其中完全的为80个(64.5%),不完全的为40个(32.3%),复合的为15个(3.2%),重复次数范围为7—165次,平均为52次。在124条序列中共59条可以设计引物。     

四川梅花鹿(CAG)n微卫星文库构建

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针与四川梅花鹿基因组酶切片段杂交,捕获200～750 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接pMD18-T载体,再转化到感受态细胞JM109中以构建文库.通过PCR方法从(CAG)n文库中筛选阳性克隆,从576个转化子中获得了234个阳性克隆,对其全部进行序列测定,其中73个含有微卫星序列.除获得的目的微卫星序列(CAG)n外,还观察到(AG)n、(AT)n的重复序列.本研究表明,经过优化的磁珠富集法能够稳定、高效地获得四川梅花鹿微卫星标记.     

云南松基因组微卫星富集文库的构建

采用磁珠富集法构建云南松微卫星富集文库。云南松基因组DNA经RsaⅠ酶切,与特定接头连接,再用接头特异引物进行PCR扩增。连接扩增产物与用生物素标记的(AG)12、(AT)12、(CG)12、(GT)12、(ACG)12、(ACT)12和(CCA)8探针杂交,通过链霉亲和素偶联的磁珠捕捉含接头和微卫星序列的片段并扩增,将获得的片段连接到pMD-19T载体上,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,成功构建了云南松微卫星富集文库。通过PCR检测从文库中筛选阳性克隆,在383富集阳性菌落中获得阳性克隆257个,经测序分析,在获得的159条序列中,有143条含有SSR,其中完美型占65.73%,非完美型占23.78%,混合型占10.49%。结果表明,磁珠富集法构建云南松基因组微卫星文库高效、可行的,文库的构建为微卫星位点的分离、遗传多样性的分析等奠定基础。     

乌苏里拟鲿微卫星文库的构建及分析

<正>乌苏里拟鲿(Pseudobagras ussuriensis)又名乌苏里逘(Leiocassis ussuriensis),隶属于鲶形目,鲿科,拟鲿属,主要分布于我国东北地区,但在我国其他各大水系也有分布[1]。乌苏里拟鲿肉质细嫩、味道鲜美、风味独特、适口性好、市场价值高,深受广大消费者和养殖户青睐。在20世纪80年代,乌苏里拟鲿的天然捕捞量曾仅次于同科的黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidsco),然而由于捕捞强度的持续增长、环境污染及生境破坏等因素的影响,     

藏鸡微卫星文库的构建与微卫星标记筛选

通过磁珠富集法构建了藏鸡基因组微卫星富集文库,分离微卫星序列并对其进行分析.将藏鸡基因组DNA经Sau3AI酶切后纯化回收,连接特定接头.用生物素标记的(CA)12探针与藏鸡基因组酶切回收片段杂交,捕获200～900 bp片段,随后将获得的片段连接到pMD 18-T载体上,转化至JM109中,成功构建藏鸡微卫星富集文库.从1200个转化子中获得了353个阳性克隆,随机挑选53个测序,根据测序结果成功设计了18对藏鸡微卫星引物,最终筛选出6个具有多态性的微卫星标记,其PIC值均大于0.5,同时可以用于研究藏鸡遗传多样性.实验结果表明磁珠富集法能够有效提高分离微卫星标记的效率.     

黑龙江黑斑狗鱼线粒体控制区的遗传变异

测定了黑龙江抚远江段和虎林江段黑斑狗鱼(Esoxreicherti)线粒体控制区5'端的560bp序列,在12尾黑斑狗鱼序列中未检测到任何变异位点,即所有个体的序列均完全一致,共享同一种单倍型,群体内和群体间的核苷酸多样性均为0.黑龙江黑斑狗鱼线粒体DNA如此贫乏的遗传多样性,一方面可能是黑龙江水系黑斑狗鱼在更新世冰期可能曾遭受过严重的瓶颈效应;另一方面则可能因目前是国内黑斑狗鱼种群数量锐减,种质资源急剧衰退,导致种群遗传多样性的丧失.建议广泛取样调查不同地理种群,并采用AFLP和微卫星等分子标记检测遗传多样性,以确定遗传变异丰富的黑斑狗鱼种群加以保护,促进黑龙江流域黑斑狗鱼资源的有效保护和可持续利用.     

牦牛基因组微卫星富集文库的构建与分析

根据生物素与链亲和素的强亲和性原理,用链亲和素磁珠亲和捕捉与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针(CA)12、(CCG)8、(CAG)8、(TTTC)8退火结合的含有接头和牦牛微卫星序列的单链限制性酶切片段,获得单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pMD18-T载体上,转化至DH5α中,首次成功构建牦牛基因组微卫星富集文库。测序结果发现,阳性克隆率为77％(37／48),说明构建的牦牛基因组微卫星富集文库是一个高质量的文库。牦牛富集微卫星文库的建立和牦牛微卫星的筛选将为下一步进行牦牛基因组结构的分析、牦牛遗传连锁图谱的构建、分子进化和系统发育研究、标记辅助选择以及经济性状的QTL定位提供大量的微卫星标记。     

藏酋猴微卫星富集文库的构建及微卫星分子标记的筛选

通过磁珠富集法构建了藏酋猴AC重复和AAAG重复的微卫星富集文库,分离微卫星序列并对其进行分析。将藏酋猴基因组DNA经Sau3AI酶切后纯化回收,连接特定接头。用生物素标记的探针与酶切片段杂交,捕获300～1000bp片段,随后将获得的片段连接到pMD-19T载体上,转化至JM109中,成功构建藏酋猴微卫星富集文库。(AC)n富集文库和(AAAG)n富集文库的阳性克隆率分别为50%和10%左右。根据测序得到的48个微卫星序列成功设计了24对引物,最终筛选出6个微卫星标记,这些标记将为藏酋猴的遗传多样性研究、圈养种群结构的分析和遗传图谱的构建等奠定一定的基础。     

中国地鼠基因组微卫星富集文库的构建与分析

目的筛选中国地鼠微卫星位点,为中国地鼠种质资源的分类、进化等遗传研究奠定基础。方法中国地鼠基因组DNA经超声打碎,用2%琼脂糖凝胶电泳回收500～1000 bp的DNA片段,与SNX连接头连接,连接产物与生物素标记的14种微卫星探针变性及退火,再通过链亲和素偶联磁珠亲和捕捉,经吸附、洗涤及洗脱,然后以洗脱产物为模板,通过PCR扩增,与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH10B,构建中国地鼠微卫星DNA富集文库。结果测序结果发现,微卫星DNA序列的阳性克隆占70.3%。结论中国地鼠微卫星文库的建立和微卫星的筛选将为下一步进行中国地鼠遗传连锁图谱的构建、分子进化和系统发育研究提供大量的微卫星标记。     

伊犁鲈微卫星位点的筛选及近缘物种通用性

为开发伊犁鲈(Perca schrenkii)分子标记用于鲈属鱼类种质资源保护,以伊犁鲈为材料,应用磁珠富集法进行了微卫星标记的筛选.从伊犁鲈尾鳍提取总DNA,进行酶切、接头连接、PCR扩增,再采用生物素标记(CA)15探针及生物素标记(TG)15探针对扩增产物进行杂交富集,经再次PCR扩增及T-A克隆,成功构建了伊犁鲈基因组微卫星富集文库.采用重复序列引物筛选获得阳性克隆,随机选取48个阳性克隆进行测序,测得序列46个,其中38个克隆含有微卫星序列,41个位点的微卫星重复数在8次以上.根据测得序列设计17对微卫星引物,均能在伊犁鲈群体中扩增获得目的条带.采用该17对引物对河鲈(P.fluviatilis)及黄金鲈(P.flavescens)群体样本进行扩增,10对引物具有通用性,其中6对在河鲈中具有高度多态性(PIC>0.5),5对在黄金鲈中具有高度多态性.     

背角无齿蚌基因组(GT)n微卫星DNA特征

利用磁珠富集法筛选背角无齿蚌(Anodonta woodiana)的微卫星分子标记,采用Sau3A1酶对完整DNA进行酶切,以生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从酶切片段中筛选微卫星序列.洗脱的杂交片段克隆到PGEM-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过菌液PCR筛选检测出阳性克隆进行测序.结果表明:在筛选的18...     

岩原鲤微卫星富集文库的构建及微卫星分子标记的筛选

用磁珠富集法构建了岩原鲤Procypris rabaudi AC重复和GATA重复的微卫星富集文库.采用PCR方法分别以人工合成的oligoA和探针(AC)12或(GATA)6为引物筛选含有微卫星的阳性克隆.(AC)n 富集库和(GATA)n富集库的阳性克隆率分别为30%和7%左右.对40个AC重复的阳性克隆和30个GATA重复的阳性克隆测序,共获得61个微卫星序列,其中包含了一个三碱基重复(TGA)的微卫星序列.选择设计了19对AC重复和16对GATA重复的微卫星引物以及1对TGA重复的微卫星引物,通过PCR优化,共有20对引物能够产生稳定、清晰的目的产物带.为了检测获得的岩原鲤微卫星座位是否能用于近缘物种的研究,我们将20对岩原鲤微卫星引物用于中华倒刺鲃Spinibarbus sinensis基因组DNA PCR扩增,有60%的引物对能产生特异性的目的条带.本研究获得的20个岩原鲤微卫星座位可以用于岩原鲤及近缘物种的遗传多样性、种群遗传结构等的进一步研究.     

磁珠富集法筛选实验豚鼠微卫星分子标记

目的直接从实验豚鼠基因组DNA中筛选获得微卫星分子标记。方法应用磁珠和生物素标记的微卫星探针与豚鼠基因组酶切片段杂交,捕获200～1000 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD-18V载体中,转化到感受态细胞E.coli DH5α中构建富集微卫星序列的小片段插入文库。然后用PCR法进行筛选。结果从约2000个转化子中获得240个阳性克隆。对其中98个进行了测序,并成功设计豚鼠微卫星引物17对。结论经过优化的磁珠富集法能够稳定、高效地获得豚鼠微卫星标记。本研究获得的微卫星位点将成为豚鼠遗传学研究的有力工具。     

微卫星位点筛选方法综述

微卫星标记因其丰富的多态性和共显性等特点,已得到了广泛的应用.应用微卫星标记首先需要获得微卫星位点的序列信息,用来设计引物.获得微卫星位点的方法有多种,本文综述了获得和富集微卫星位点的常用方法.最简便、最省时的方法是从公共数据库(如EMBL、Genbank、EST数据库等)或已发表的文献中查找到微卫星位点,但只限于已经有序列数据发布的物种.第二种方法是种间转移扩增,即从相近物种的数据库中查找微卫星位点,或使用已有数据发表的遗传距离相近物种的微卫星标记.第三种方法是从基因组DNA中筛选微卫星位点,其中用于富集微卫星的方法有引物法、磁珠杂交法、尼龙膜杂交法以及RAPD技术法.     

文蛤微卫星DNA的筛选及其特性分析

采用磁珠富集分离法从文蛤(Meretrix meretrix)的基因组中筛选得到49条微卫星DNA序列,其中两碱基重复有3种类型36个序列,四碱基重复有14种类型26个序列.重复次数在5～30之间的序列占75.6%,30次以上重复的序列占24.4%,最高重复次数为100.根据重复单元的排列特点,完美型、非完美型及混合型序列所占比例分别为61.2%、14.5%和24.5%.本研究中构建的文蛤微卫星文库将在文蛤种质资源评价及分子遗传学研究中发挥作用.     

卤虫(AC)_n和(AG)_n微卫星文库构建

卤虫Artemia作为重要的基础实验材料和经济动物资源,其微卫星位点具有重要的研究和应用价值。本研究使用磁珠富集法,成功构建了卤虫的(AC)_n和(AG)_n微卫星富集文库。通过对文库进行PCR方法鉴定和测序确认,所构建的(AC)_n和(AG)_n文库阳性克隆率分别为55.8%和34.5%。依据得到的微卫星序列,设计并合成了63对微卫星引物,随机以2个地理单元(青海、西藏)共18个卤虫基因组DNA为扩增模板,筛选出6对具有多态性的卤虫微卫星引物。本研究筛选出的微卫星多态位点可用于卤虫种群的遗传多样性评估、遗传图谱的构建和数量性状定位等后续工作。     

藏羚羊(AC)_n,(AG)_n微卫星文库构建

藏羚羊Pantholops hodgsonii是我国珍稀的动物资源,开发其微卫星标记具有重要的科研与应用价值。本研究采用FIASCO法(Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats)构建了藏羚羊的(AC)n和(AG)n微卫星富集文库。各文库随机挑取150个白色菌落,分别筛选到76个(AC)n和61个(AG)n阳性克隆;经测序得到含AC重复的微卫星序列37条和含AG重复的序列29条。研究共设计、合成微卫星引物47对,以扩增、电泳等方法进行筛选,最终获得15个可稳定扩增且具有多态的微卫星标记。筛选出的引物可用于评估藏羚羊的核DNA遗传多样性、遗传结构、种群动态以及构建藏羚羊遗传图谱等。     

曼氏无针乌贼GT微卫星位点的筛选

采用链霉亲和素包被的磁珠富集法筛选曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)微卫星位点。试验样品来自舟山六横岛,提取4个样品的DNA混合成DNA pool,用限制性内切酶Sau 3A I酶切。接上接头后构建基因组PCR文库,用生物素标记的(GT)15探针筛选。将筛选获得目的片段进行PCR扩增,连接pMD18-T载体,转入DH5α感受态大肠杆菌里,扩大培养后PCR筛选阳性克隆。总共选取278个克隆,对120个经过检测含有插入片段的克隆进行测序,发现102个克隆含有微卫星序列,阳性克隆比率为85%。除去重复测序和侧翼链不足的序列,可以设计引物的微卫星序列有64条。     

鲮微卫星DNA分子标记的筛选与遗传多样性分析

采用磁珠富集法对已建立的生长较快的西江段野生浅色鲮群体的极大、极小群体各31尾基因组DNA进行了微卫星序列的筛选,128个阳性克隆成功测序93个,其中80个为的微卫星序列,微卫星序列完美型占85%,非完美型占6.25%,混合型占8.75%。利用微卫星序列合成了23对微卫星引物,扩增结果表明,等位基因数为1～10个,扩增片段大小为92～283bp,其中14对引物扩增条带清晰,为中度或高度多态位点,极大、极小群体的平均有效等位基因数和平均多态信息含量分别为3.0784、3.2079和0.5675、0.5974,反映出2个群体遗传多样性均较丰富;高度多态性引物4的位点b,片段大小为119bp,在极大群体中出现频率为61.3%,在极小群体占22.6%,出现频率极大群体高于极小群体近3倍,初步可作为候选差异性分子标记。