恒河猴细菌感染性子宫出血模型内膜组织基质金属蛋白酶1、9及其抑制剂的表达

目的　探讨基质金属蛋白酶 1、9在炎性子宫出血中的作用。方法　运用免疫组化链霉素抗生物素蛋白 过氧化物酶染色法 (SP)检测细菌感染性子宫出血恒河猴模型组子宫内膜组织中基质金属蛋白酶 1、9(MMP 1、MMP 9)及其抑制剂 (TIMP 1)的表达 ,用正常恒河猴子宫内膜作对照。结果　模型组子宫内膜组织间质、腺上皮中MMP 1、9的表达明显高于正常对照组 ,而TIMP 1的表达与正常组水平相似。结论　基质金属蛋白酶 1、9的高度表达可能与炎症导致的异常子宫出血有关。     

金属蛋白酶组织抑制剂在心血管疾病发病中的作用

金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)由4个成员组成:TIMP1、TIMP2、TIMP3和TIMP4,它们是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的生理性抑制剂.同时它们也具有MMP非依赖的功能.T I ...     

四周尾部悬吊大鼠颈总动脉MMP9和TIMP1的表达及活性改变

目的:探讨四周尾部悬吊模拟失重大鼠颈总动脉基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein9,MMP9)和金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase1,TIMP1)的基因、蛋白表达及酶活性变化。方法:采用4周(week,wk)尾部悬吊大鼠模拟失重影响,通过透射电镜检测颈总动脉壁基质含量,实时定量聚合酶链式反应检测MMP9和TIMP1的mRNA表达,Western blot和免疫组织化学染色检测其蛋白表达和分布,明胶酶谱法测定MMP9活性水平。结果:与对照组相比,悬吊组大鼠细胞外基质面积较对照组显著增加(P0.05),胶原蛋白含量显著增加(P0.05);悬吊组大鼠颈总动脉MMP9的m RNA表达量无明显改变,而其蛋白表达量和酶活性均显著降低(P0.05);TIMP1 mRNA和蛋白表达量则显著升高(P0.05)。结论:模拟失重使大鼠颈总动脉MMP9水平降低,TIMP1水平升高,可能与其管壁基质增生和胶原蛋白含量增加有关。     

人组织型基质金属蛋白酶抑制剂-1在Pichia pastoris酵母中重组表达研究

 为研究组织型基质金属蛋白酶抑制剂 (TIMPs)的分子作用机制 ,探讨了在 Pichia pastoris酵母中高效表达分泌型人组织型基质金属蛋白酶抑制剂 - 1 (TIMP- 1 )的技术路线 ,并对产物性质进行初步研究 .通过 PCR从含有 TIMP- 1基因的 p BS质粒获得了该基因的全长序列 ,构建了 p PIC9/T1表达载体 ,电击法转化酵母 ,通过表型筛选和 PCR鉴定证实了目的基因已稳定整合入 Pichiapastoris酵母基因组中 .SDS- PAGE表明表达量高达 40 mg/L培养上清 .用免疫印迹法确定了产物的正确性 ;同时 ,反向明胶酶谱法证明了重组蛋白具有抑制基质金属蛋白酶的活性 .     

组织基质金属蛋白酶抑制剂-2的表达纯化及活性鉴定

组织基质金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)抑制肿瘤迁移及侵袭。文中以人TIMP-2为研究对象,探索人TIMP-2蛋白的原核表达特征,并进行纯化及活性鉴定。以人肺癌A549细胞的总RNA反转录得到的cDNA为模板,克隆人TIMP-2基因,构建pET28a重组表达载体;经酶切检测和测序分析的重组表达载体pET28a-TIMP-2转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并对表达条件进行优化。经镍亲和柱纯化后,用Westernblotting法鉴定融合蛋白His-TIMP-2,并用明胶酶谱法检测融合蛋白的活性。研究发现融合蛋白His-TIMP-2在E.coliBL21(DE3)中以包涵体的形式存在;在一定范围内,IPTG浓度对His-TIMP-2的表达量没有显著影响;而在该表达系统中,诱导温度和时间是关键参数,His-TIMP-2的表达量随诱导温度升高而增加;纯化并复性后的融合蛋白His-TIMP-2能有效抑制人肺癌A549细胞表达的基质金属蛋白酶的活性。具有活性的融合蛋白的获得为后续深入研究人TIMP-2的功...     

人基质金属蛋白酶-2的表达、纯化和性质鉴定

PCR方法扩增人基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )不含信号肽的表达序列 ,酶切和测序鉴定正确后 ,构建酵母重组表达质粒pPIC9 MMP 2 ,电击法转化毕赤酵母 (Pichiapastoris)细胞得到阳性克隆 ,甲醇诱导获得含大量基质金属蛋白酶 2的培养上清 ,经SephacrylS 2 0 0纯化后 ,纯度达到电泳纯。明胶酶谱和SDS PAGE分析说明重组MMP 2能够降解明胶和IV型胶原 ,表明重组蛋白具有与天然MMP 2相似的底物特异性。糖基化分析和SDS PAGE表明 ,表达产物的分子量约为 5 0kD ,重组MMP 2的C 末段可能发生了降解。     

HCV丝氨酸蛋白酶小分子底物构建及GST融合表达

丝氨酸蛋白酶是丙型肝炎病毒重要的功能蛋白和药物作用靶点,其通过分子内（cis）和分子间（trans）方式催化水解前体蛋白,释放病毒功能蛋白。目的：为深入研究病毒蛋白酶活性和抑制剂鉴定需要,实验研究参照丙型肝炎病毒1a亚型菌株蛋白酶天然底物的氨基酸序列特点,设计了一段包含两个天然底物酶切位点的小分子多肽2S,并进行了原核表达。方法：利用PCR方法,合成2S小分子多肽基因,目的基因两端引入BamH I和EcoR I两个限制性酶切位点,双酶切后将基因与表达载体pGEX-4T-2重组,转化大肠杆菌DH5α,经化学诱导进行GST融合蛋白表达,通过亲和层析柱纯化目的蛋白。纯化的GST 2S融合蛋白在体外反应系统进行酶切鉴定,SDS-PAGE和ELISA鉴定酶切结果。结果：PCR合成的小分子底物多肽2S基因,经与表达载体重组后测序,证实基因序列正确。采用0.5mmol/L浓度的IPTG诱导工程菌过夜,获得表达的目的蛋白,经分离纯化得到融合蛋白GST-2S。GST-2S在体外磷酸盐缓冲系统中与丝氨酸蛋白酶反应,15%SDS-PAGE鉴定酶切产物,证实融合蛋白底物条带明显消失,ELISA结果同样说明融合蛋白的底物活性。结论：含有两个天然底物酶切位点的小分子多肽可以替代病毒天然底物,实验结果为丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶活性研究和酶抑制剂研究奠定了方法学基础。     

PTK重组质粒的构建与表达

目的构建并表达出PTK重组蛋白,以鉴定酪氨酸蛋白激酶(PTK)的活性,筛选酪氨酸激酶的抑制剂。方法从PTK重组克隆载体上切下目的基因片段Abl-PTK使其连接到表达载体pGEX4T-2上,转化大肠杆菌DH5a,筛选鉴定出正确的转化子。转化菌株经IPTG诱导后进行表达并进行SDS-PAGE分析。结果经酶切和诱导表达鉴定,重组质粒pGEX4T-2-PTK构建成功,并高效表达了58KD的GST-PTK融合蛋白。结论PTK基因被成功地重组至融合蛋白表达载体中,并在大肠杆菌中获得高效表达。该研究为进一步纯化、鉴定PTK的活性,筛选PTK的抑制剂奠定了基础。     

糜酶转基因小鼠心脏组织中基质金属蛋白酶9的活化

为研究糜酶在心脏中的功能 ,用明胶酶谱法和放免法检测了糜酶转基因小鼠心脏组织中基质金属蛋白酶及糜酶的活力 .糜酶转基因小鼠心脏组织中糜酶样活力较转基因阴性小鼠升高了约80 % ;而其心脏匀浆液凝胶酶谱分析结果显示在 92 k D处明胶酶活力也升高约 30 % ;经 Western印迹鉴定为基质金属蛋白酶 9,而在蛋白水平上与转基因阴性小鼠无显著差异 .结果提示 ,糜酶转基因小鼠心脏组织中糜酶活力的升高可活化基质金属蛋白酶 9,从而影响心脏胶原代谢 .     

水蛭素抑制人脐静脉内皮细胞基质金属蛋白酶-2的生成及活化

研究凝血酶对人脐静脉内皮细胞表达基质金属蛋白酶的影响及重组水蛭素的作用。将原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的第2～5代分组后与凝血酶(4．0ku／L)共同温育,同时分别加入水蛭素(6．0ku/L)和肝素(6．0ku／L),在不同时间,用逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学分析的方法评价基质金属蛋白酶-2的表达情况。结果显示凝血酶促进血管内皮细胞产生和活化基质金属蛋白酶-2。重组水蛭素可以有效地阻断凝血酶的上述作用。     

Expression of cDNA sequences encoding mature and precursor forms of human dihydrolipoamide dehydrogenase in Escherichia coli. Differences in kinetic mechanisms

The cDNA sequences encoding mature and precursor forms of human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) were expressed in Escherichia coli using a lambda PL promoter-driven prokaryotic expression vector. The expressed proteins in total cell extracts were identified by Western blot analysis using anti-pig heart E3 antibody and also by measurement of E3 activity. Most of the expressed human E3 polypeptides (five bands) were found in the insoluble pellet while primarily full-length mature E3 was found in the soluble fraction. About 2% of the total soluble protein was mature human E3 when expressed in wild type E. coli AR120. Since wild type E. coli has its own endogenous E3 activity, the expression of human E3 was performed in a pyruvate dehydrogenase complex-deficient strain of E. coli, JRG1342. The expressed recombinant human E3s in JRG1342 were purified to near homogeneity. The amino-terminal amino acid sequence analysis revealed that the recombinant mature E3 had an expected sequence while the recombinant precursor E3 lost 19 amino acid residues of its 35-amino acid leader sequence presumably due to a proteolytic cleavage. The recombinant mature E3 displayed comparable kinetic properties to those reported for highly purified mammalian E3s. The truncated precursor E3 showed about half of the mature E3 activity. The double-reciprocal plot for the mature E3 in the direction of NAD+ reduction showed parallel lines (ping-pong mechanism) while that for the truncated precursor E3 displayed intersecting lines (sequential mechanism). In the direction of NADH oxidation, the kinetic mechanisms of both E3s were apparently a ping-pong mechanism. These kinetic results showed that the partial 16-amino acid extension in the leader sequence changed the kinetic mechanism of human E3 so that it resembled that of glutathione reductase.     

基质金属蛋白酶组织抑制剂-2基因的人工合成与克隆

根据GenBank报道的基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)氨基酸序列和毕赤酵母偏爱密码子设计,通过化学方法合成得到适合在毕赤酵母中表达的目的TIMP-2基因序列,并将其克隆到质粒pPIC9中,构建了pPIC9-T2表达载体,PCR鉴定及测序结果表明得到了正确的TIMP-2基因序列。     

Identification of soluble type of membrane-type matrix metalloproteinase-3 formed by alternatively spliced mRNA

Homology screening for human membrane-type MMP (MT–MMP) was carried out, and cDNA encoding a soluble type of MT3–MMP (SM3), which is considered to be an alternatively spliced variant of MT3–MMP, was obtained. SM3 had a novel sequence consisting of 50 amino acids after Lys407 instead of amino acids containing the transmembrane domain of MT3–MMP. When SM3 tagged with a FLAG epitope (SM3–flag) was expressed in COS-7 cells, SM3–flag was present in the conditioned medium in its activated form. The enzymatic activity of SM3 was studied using a recombinant enzyme expressed in E. coli (SM3-e). The fluorogenic peptide substrate hydrolyzing activity of SM3-e was inhibited by EDTA and by the tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2), whereas TIMP-1 had only relatively weak inhibitory ability. SM3-e was able to activate proMMP-2, and this activity was also inhibited by TIMP-2 but not by TIMP-1. SM3-e was able to cleave type III collagen, and also digested fibronectin. In view of the homology of the primary structures, MT3–MMP was considered to have the same catalytic activity as SM3. The results of studies of SM3's activity on extracellular matrix (ECM) protein suggests that MT3–MMP plays a role in ECM turnover not only by activating proMMP-2 but also by acting directly on ECM macromolecules.     

Design and functional expression in Escherichia coli of a synthetic gene encoding Clostridium pasteurianum 2[4Fe-4S] ferredoxin.

A gene encoding the exact sequence of Clostridium pasteurianum 2[4Fe-4S] ferredoxin and containing 11 unique restriction endonuclease cleavage sites has been synthesized and cloned in Escherichia coli. The synthetic gene is efficiently expressed in E. coli and its product has been purified and characterized. The N-terminal sequence is identical to that of the protein isolated from C. pasteurianum and the recombinant ferredoxin contains the exact amount of [4Fe-4S] clusters (2 per monomer) expected for homogeneous holoferredoxin. It displays reduction potential and kinetic parameters as electron donor to C. pasteurianum hydrogenase I identical to those determined for the native ferredoxin. All of these properties demonstrate that the 2[4Fe-4S] ferredoxin expressed in E. coli is identical to the parent clostridial protein.     

人脑源性神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中表达

人脑源性神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中表达何晓龙,路长林,王成海（第二军医大学神经生物学教研室,上海２００４３３）关键词神经营养因子;基因克隆脑源性神经营养因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｉｃ…ｉ。血。ｔｏｒ,ＢＤ贾助是Ｂａｄｅ等人...     

出生后小鼠睾丸不同发育期TIMP-4的表达

金属蛋白酶组织抑制因子-4(TIMP-4)是TIMP家族的最新成员。已有研究表明,TIMP-4mRNA大量表达于成年小鼠的睾丸中。为了证实TIMP-4基因在出生后小鼠睾丸中的表达是否具有发育依赖性,本实验利用RT-PCR、Western blotting和间接免疫荧光染色三种方法,分别检测了TIMP-4mRNA和蛋白在出生后小鼠睾丸不同发育期中的时空表达方式。RT-PCR和Western blotting结果分别显示,TIMP-4mRNA和蛋白均只在成年小鼠睾丸中表达,而在出生后的其它各阶段都不表达;间接免疫荧光染色进一步证实TIMP-4蛋白只定位在成年小鼠睾丸的Leydig细胞中。结果提示,TIMP-4在出生后小鼠睾丸中的表达具有显著的发育依赖性.     

猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性

用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变, 然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET-28a(+)中,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL21(DE3)plysS中,在IPTG的诱导下, 重组转化菌可高效表达目的基因, 表达量平均可达菌体蛋白总量的28%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。此重组蛋白免疫的家兔可抵抗猪瘟兔化弱毒的攻击。     

MMP-2结合肽-蜂毒素杂合基因的表达纯化及活性测定

为开发抗癌导向多肽药物,用从噬菌体十二肽库中筛选的与MMP-2具有高度亲和性的十二肽与蜂毒素连接,采用基因工程方法在大肠杆菌中进行了高效表达;并分别通过亲和层析、肠激酶酶切、凝胶层析获得高纯度的多肽(相对分子质量45000),经体外抑瘤作用测定该融合蛋白具有明显抑制肿瘤细胞的生长。该研究对肿瘤的导向治疗和临床应用提供了一定的帮助。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-3株成熟黏附蛋白的表达及其免疫原性检测

目的：在大肠杆菌原核表达系统中高效表达禽多杀性巴氏杆菌成熟黏附蛋白Cpm39,并检测其免疫原性。方法：通过BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组载体pMD18-cpm39获得cpm39基因片段,将该基因片段克隆至表达载体pMAL-p2X上,构建表达质粒pMAL-p2X-cpm39,转化至大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下表达融合蛋白,用禽多杀性巴氏杆菌C48-3株Cp39天然粘附蛋白的免疫血清经Western印迹检测其免疫原性。结果：SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白相对分子质量为78×103,与预期结果相符,而Western印迹结果表明诱导表达的融合蛋白MBP-Cpm39能与Cp39天然黏附蛋白抗体发生特异性反应。结论：构建了表达质粒pMAL-p2X-cpm39,获得了具有免疫原性的重组融合蛋白,为进一步研究禽多杀性巴氏杆菌成熟黏附蛋白的免疫保护功能奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的克隆和表达

目的:获得碱性蛋白酶基因。方法:用PCR的方法从枯草芽孢杆菌A-109中扩增碱性蛋白酶基因(apr),并进行测序分析,构建表达载体,最后转化大肠杆菌BL21,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测该基因的表达情况。结果:apr基因片段含1092个碱基对。该基因片段核苷酸序列与Bacillus amyloliquefaciens subtilisin DFE precursor有99%的同源性,对应的氨基酸序列与Bacillussp.DJ-4有99%的同源性。apr基因在大肠杆菌BL21中获得表达,并表现出蛋白酶活性。结论:获得了具有活性的新的碱性蛋白酶基因。