苹果多酚氧化酶双链RNA干扰(RNAi)研究

以成熟苹果果实的RNA为模板,经RT-PCR扩增并克隆苹果多酚氧化酶(APPO)长度为710bp的反义、正义基因片段.以副球菌中类胡罗卜素合成有关的(crtW+crtY)融合基因片段YYT为间隔区,将APPO反义基因片段、YYT和APPO正义基因片段串联,构成全长为2446bp的DNA并插入到植物双元载体pYPX145中,构成可表达苹果多酚氧化酶双链RNA的植物双元载体pYF7704.以根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化苹果栽培品种红富士,通过50mg/L卡那霉素筛选和GUS检测,获得了转基因苹果抗性芽.荧光定量RT-PCR检测结果显示,转基因苹果抗性芽内多酚氧化酶基因的干扰效果达91.69%以上,研究结果证实多酚氧化酶双链RNA干扰在转基因苹果上是可行的.     

链特异性RT-PCR方法检测口蹄疫病毒负链RNA

旨在建立一种快速、灵敏、特异的检测口蹄疫病毒在复制过程中产生的负链RNA的方法。根据口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)病毒5’-非编码区(5’-UTR)基因序列,设计了5条引物链特异性RT-PCR引物,建立检测口蹄疫病毒负链RNA的链特异性RT-PCR方法。提取FMD病毒RNA,应用设计的正向引物T1-H1做反转录引物,经反转录和RNA酶A消化后,再经两轮链特异性PCR扩增,可特异性地检测FMDV在复制过程中产生的负链RNA。所建立的检测口蹄疫病毒负链RNA的链特异性RT-PCR方法是一种可靠的方法,在确定细胞培养物和动物感染FMDV的病毒复制和了解病毒的致病性研究中具有应用前景。     

一步法RT-PCR和两步法RT-PCR对蜜蜂病毒诊断研究的比较

【目的】探讨适合蜜蜂病毒病诊断的RT-PCR技术。【方法】从感染蜜蜂以色列急性麻痹病毒、残翅病毒、囊状幼虫病毒、急性麻痹病毒、黑蜂王台病毒以及慢性麻痹病毒的阳性样品中,分别提取这6种病毒的RNA。然后,同时应用一步法RT-PCR和两步法RT-PCR的反应体系对6种病毒扩增,并对两种方法的灵敏性进行比较和分析。【结果】上述两种方法分别得到158(IAPV)、269(DWV)、342(SBV)、460(ABPV)、536(BQCV)和774 bp(CBPV)的扩增片段,测序结果证实扩增片段符合预期。两步法RT-PCR可检测到更低浓度的病毒颗粒。【结论】结果表明,该2种方法均可快速、有效地诊断蜜蜂病毒。但两步法RT-PCR灵敏性更高。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR测定肠道病毒71型（EV71）RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定实验动物等来源的EV71病毒RNA。方法运用EV71VP1保守区引物,优化real time RT-PCR条件,运用NASBA方法扩增EV71病毒RNA,计算拷贝数,经10倍系列稀释做出标准曲线,作为EV71病毒RNA定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100copies/μL,PCR扩增效率达到99.5%。结论 SYBRGreenⅠ荧光染料实时定量PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA载量的定量测定。     

葡萄病毒B的RT-PCR检测技术研究

旨在建立适合葡萄的葡萄病毒B的RT-PCR检测技术。从感染葡萄病毒B的葡萄皮层中提取总RNA,以其为模板合成cDNA第一链,并利用两对引物分别进行PCR扩增;回收PCR特异扩增产物,与pUCm-T载体连接,并进行转化、重组克隆的筛选、重组质粒的酶切鉴定和序列测定。结果显示,两对引物均能获得与预期片段大小一致长约460 bp和470 bp的扩增产物扩增片段序列与已报道GVB序列(序列号:X75448)的核苷酸同源性均为81%,经反复多次试验证实,利用总RNA为模板合成cDNA并进行PCR扩增检测GVB是准确、可靠的。     

非洲马瘟病毒群特异性RT-PCR检测方法的研究

非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)为双股RNA病毒,感染所有马科动物.设计2对位于AHSV基因组S7片段的引物,经RT-PCR扩增,证实2对引物对6种血清型的AHSV RNA均有特异性扩增,且能对同属的蓝舌病病毒(BTV)、鹿出血热病毒(EHDV)进行区别诊断.经序列测定及Blast,证实所扩增的条带确为AHSV S7相应位置核苷酸序列,表明已初步建立AHSV群特异性RT-PCR检测方法.     

RT-PCR一步法检测甲型肝炎活病毒方法的建立

建立灵敏、特异、快速检测甲型肝炎活病毒(HAV)的方法。提取HAV总RNA,选用HAV高保守区为目标区,设计合成一对引物,通过RT-PCR反应扩增其核酸,用琼脂糖凝胶电泳法检测其扩增产物,紫外灯下观察,约200bp处为目标片段,根据观察结果,计算HAV滴度。RT-PCR一步法快速、灵敏、重复性好、特异性强,可用于甲型肝炎活病毒检测。     

苹果α-法尼烯合成酶基因双链RNAi载体的构建

RNA干扰属于转录后后基因基因沉默机制(PTGS),是一种新型的基因沉默手段,用于基因表达和功能的研究。以成熟苹果的果皮RNA为模板,经RT-PCR扩增并克隆α-Farnesene合成酶基因(AFS),设计特异引物从AFS基因中扩增515bp和396bp的反义和正义基因片段,将正义和反义基因片段串联,把构成的长为911bp的DNA插到PBI121表达载体中,构建成可表达α-Farnesene合成酶双链RNA载体PBI-AFS。     

苹果多酚氧化酶双链RNA干扰（RNAi）研究

以成熟苹果果实的RNA为模板,经RT—PCR扩增并克隆苹果多酚氧化酶(APPO)长度为710bp的反义、正义基因片段。以副球菌中类胡罗卜素合成有关的(crtW crtY)融合基因片段YYT为间隔区。将APPO反义基因片段、YYT和APPO正义基因片段串联,构成全长为2446bp的DNA并插入到植物双元载体pYPX145中,构成可表达苹果多酚氧化酶双链RNA的植物双元载体pYF7704。以根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化苹果栽培品种红富士,通过50mg／L卡那霉素筛选和GUS检测,获得了转基因苹果抗性芽。荧光定量RT—PCR检测结果显示,转基因苹果抗性芽内多酚氧化酶基因的干扰效果达91．69％以上,研究结果证实多酚氧化酶双链RNA干扰在转基因苹果上是可行的。     

两种核酸提取方法对小鼠诺如病毒RNA提取效能的比较

目的比较两种核酸提取方法对小鼠诺如病毒RNA的提取效能。方法用Trizol提取法和QIAamp Vira lRNA Min iKit提取法分别提取感染小鼠诺如病毒（Murine Norovirus,MNV）的小鼠小肠组织样品RNA和细胞培养物RNA,测定RNA浓度;用MNV特异的引物对分离的核酸样品进行一步法RT—PCR扩增。结果Trizol提取法提取小肠组织的RNA浓度高于QIAamp Viral RNA Mini Kit提取法;QIAamp Viral RNA Mini Kit提取得到的细胞培养物RNA浓度高于Trizol提取法。经QIAamp Viral RNA Mini Kit提取的两种核酸样品均能扩增出特异条带,而Trizol提取的核酸样品未见特异条带。结论在MNV的检测中,QIAampViralRNAKit更适合组织样品中MNV病毒核酸的提取。