hFOXP3-△E251的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建和表达带HIV-TAT穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的人FOXP3突变体PTD-hFoxP3-△E251,为研究人FOXP3的功能奠定基础.方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcTiption-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)总RNA中扩增得到人FOXP3(hFOXP3)的cDNA,然后再利用重叠PCR技术扩增获得hFOxP3-△E251基因实变体片段.将该重组突变体插入表达载体pET28a-PTD中,构建表达质粒pET28a-PTD-hFOXP3-△E251,然后转化感受态细菌E.coli Rosetta(DE3),最终采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达.结果:SDS-PAGE电泳分析发现,经0.5mM IPTG诱导8h后,可高效表达重组的融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在.结论:成功制备了带穿膜序列的人FOXP3△E251突变体融合蛋白.为更好地研究人FOXP3的功能与特性奠定了实验基础.     

猪源戊型肝炎病毒基因IV型ORF3编码蛋白的表达及鉴定

通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF3全基因,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a（+）,构建pET28a-ORF3表达载体,转入E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达。Ni-NTA层析柱纯化表达蛋白,用SDS-PAGE、免疫印迹、ELISA等方法分析鉴定表达产物。结果成功扩增到345 bp的目的基因;构建了重组表达载体pET28a-ORF3;转化宿主菌E.coli BL21 (DE3)后表达产物的相对分子质量在6.50~16.5 kDa之间,与预期表达的目的蛋白相对分子质量相符;表达的目的蛋白能与阳性猪源和人源血清发生特异性反应,证实其具有较好的反应原性。     

人早胚发育相关蛋白ZNF268的抗体制备

目的:获得纯化抗原用于制备ZNF268的多克隆抗体。方法:PCR扩增目的基因片Spacer区序列,亚克隆入融合蛋白表达载体pET28a+,构建了重组质粒pET28a+/SPA。然后将该重组质粒转化E.coliDE3(Rosseta),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分离,获纯化融合蛋白6His-SPA。用6His-SPA免疫家兔,颈动脉取血,分离血清,从血清中获得ZNF268特异的多克隆抗体。结论:通过构建融合蛋白重组表达质粒pET28a+/SPA,用获得的初步纯化融合蛋白6His-SPA,制备了特异的ZNF268的多克隆抗体6His-SPA Ab。     

穿膜肽KGF-2的构建及其对HaCaT增殖作用的影响

目的:构建穿膜肽KGF-2(TAT-KGF-2),研究其对人角质形成细胞HaCaT的增殖作用。方法:采用普通PCR技术和特殊引物从人胚胎肺成纤维细胞cDNA中扩增出目的基因TAT-KGF-2,并将其插入pET-28a(+)载体中构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒;将该质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白TAT-KGF-2;通过Ni-NTA柱纯化获得目标重组蛋白并利用Western blot进行鉴定;MTT法研究TAT-KGF-2对HaCa的增殖作用。结果:成功构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的人KGF-2基因序列同源性达到100%;获得穿膜肽KGF-2蛋白,分子量约为19 kDa,纯度达到95%以上;TAT-KGF-2对HaCaT在12.5ng/ml时具有增殖作用,并呈浓度依赖性,而且与不具有穿膜功能的KGF-2相比有更强的增殖效果。结论:成功纯化出TAT-KGF-2蛋白,并验证其对HaCaT具有增殖作用,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。     

中华大蟾蜍重组Gal-3C的原核表达、纯化及抗血清制备

半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)与肿瘤的发生发展密切相关,已有文献表明其羧基端galectin-3C(Gal-3C)具有一定的肿瘤抑制作用。为了获得Gal-3C的抗血清,实验以已有的重组质粒pGM-Gal-3为模板,利用PCR方法扩增中华大蟾蜍Gal-3C基因片段,并将其插入到表达载体pET28b上,构建中华大蟾蜍Gal-3C的原核表达载体pET28b-Gal-3C;将构建好的重组质粒pET28b-Gal-3C转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导蛋白质表达,并通过SDS-PAGE和Western-blot检测目的蛋白Gal-3C的表达;以纯化的重组蛋白Gal-3C免疫小白鼠,制备鼠抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清,用Western-blot检测抗血清的特异性及其效价。结果显示成功构建了中华大蟾蜍pET28b-Gal-3C重组质粒,并诱导得到了目的蛋白的表达,而且将表达产物免疫小鼠后获得了特异性良好的抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清。以上结果为抗肿瘤药物的研究和发展奠定了基础。     

猪瘟病毒NS2-3抗原集中区基因的原核表达及鉴定

为获得猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV) NS2-3抗原集中区蛋白,并建立CSFV抗体快速检测方法.本研究以CSFV全长基因组质粒为模板,PCR扩增NS2-3抗原表位集中区,利用扩增片段和克隆载体,构建重组表达质粒,命名为pET32a-NS2-3-1.重组表达质粒转化Rosetta (DE3)细胞,利用IPTG诱导表达, SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定重组表达产物.结果表明,重组质粒pET32a-NS2-3-1在28℃诱导5 h得到高效表达,重组蛋白能够与兔抗CSFV阳性血清发生反应.获得CSFV NS2-3抗原集中区蛋白,并且获得的重组蛋白具有抗原性,能够作为CSFV抗体检测的抗原.     

白喉毒素无毒突变体CRM197基因的克隆与表达

目的构建白喉毒素(Diphtheria toxin)无毒突变体CRM197(Cross-reacting materials 197)的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法以白喉杆菌(ATCC39255)基因组DNA为模版,采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增CRM197基因,插入表达载体pET11b中,构建重组原核表达质粒pET11b-CRM197。经双酶切及测序鉴定正确后,重组质粒被转化入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,结果表明与预期一致;表达的重组蛋白相对分子质量约58 000,并可与鼠抗CRM197单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组原核表达载体pET11b-CRM197,重组的CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了表达,为以该重组突变体作蛋白载体制备结合疫苗奠定了基础。     

人IL-3基因原核表达载体的构建及表达

目的:构建人IL-3基因原核表达载体pET32a-IL-3,并在大肠杆菌中诱导表达。方法:通过佛波酯(TPA)和植物球血凝素(PHA)刺激人T淋巴细胞系Jurkat细胞,增加IL-3mRNA表达水平,提取mRNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得cDNA,以Jurkat细胞cDNA为模板,通过PCR方法扩增得到人IL-3基因,将其克隆入原核表达载体pET32a(+)中,将重组质粒转化入大肠杆菌宿主菌株BL21中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,并通过改变IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等条件最终实现蛋白的可溶性表达。表达产物用SDS-PAGE检测表达情况。结果:酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体pET32a-IL-3。SDS-PAGE检测结果证明实现了人IL-3基因在大肠杆菌中的可溶性表达。结论:成功构建了人IL-3基因的原核表达载体并在大肠杆菌中获得了良好的表达。     

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了构建小鼠canstatinC端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatinC端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET／mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatinC端片段的cDNA长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatinC端片段氨基酸的同源性为61％。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28％,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatinC端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中高效表达。小鼠canstatinC端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。     

小鼠β-防御素30的原核表达和纯化

目的:在原核细胞中表达小鼠β-防御素30(DEFB30),并对表达产物进行鉴定和纯化。方法:用RT-PCR方法扩增小鼠Defb30的cDNA序列,将2个拷贝的cDNA序列串联连入原核表达载体pET28(a),构建重组表达载体pET28(a)-Defb30,并将重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,以Western印迹分析表达产物His-DEFB30,用Ni-NTA亲和柱纯化融合蛋白。结果:构建了Defb30基因的原核表达载体,经IPTG诱导,相对分子质量约15×103的融合蛋白获得表达,Western印迹分析证实此蛋白即为目的蛋白,经Ni-NTA柱亲和纯化,获得了高纯度的融合蛋白His-DEFB30。结论:获得了在大肠杆菌中表达的DEFB30,为研究该蛋白的免疫避孕效果、抗菌活性奠定了基础。     

含CSFV E2基因A/D区原核表达载体的构建、表达及其抗原性研究

应用RT PCR方法扩增了编码猪瘟病毒石门株 (CSFVshimenstrain)囊膜糖蛋白E2全基因 ,然后将其克隆到pMD 1 8T质粒中 ,获得重组质粒pMD E2。再以pMD E2为模板 ,另行设计两对引物 ,同时扩增其中一段适于在E .coli中表达且抗原反应性较好的基因片段 (E2蛋白A D抗原区基因序列 ) ,将扩增的两片段串联插入原核表达载体pET 32a中构建成重组质粒pET 2e。用酶切和序列分析鉴定插入目的基因的正确性。SDS PAGE和Western blot分析表明 ,经pET 2e转化、IPTG诱导的受体菌可表达目的蛋白 ,克隆在硫氧还蛋白 (thioredoxinprotein ,TrxA)基因下游的E2蛋白基因与TrxA基因获得了高效融合表达 ,并且具有免疫学反应活性 ,这为猪瘟的血清学诊断方法的建立打下了基础 。     

构建羰基还原酶基因工程菌生物转化产l-麻黄碱

以筛选得到的Morganella morganii J-8细菌的基因组为模板,通过PCR扩增得到目的基因mdlh2。核苷酸序列测定结果表明,基因全长1046bp。以pET28a（＋）为表达载体,构建重组质粒pET28a（＋）-mldh2,并在E．coli BL21（DE3）中表达。利用表达产物进行生物转化,发现其具有催化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮（简称MAK）产l-麻黄碱的活力。进一步考察了诱导时间和IPTG浓度对重组菌表达的羰基还原酶的影响,37℃下用0．5mmoL／L的IPTG诱导4h,重组羰基还原酶的酶活达到0．2U／mg蛋白,转化液中l-麻黄碱质量浓度达到45mg／L。     

人黑色素瘤相关抗原Restin的克隆和表达

目的:通过对原核表达载体、表达条件和宿主菌的优化,利用原核表达系统有效表达可溶性的人Restin融合蛋白.方法:应用PCR方法扩增获得Restin编码区,克隆入原核表达载体pET44a(+),分别转化E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta-gamiTM2(DE3),不同的IPTG浓度诱导表达Restin重组融合蛋白,SDS-PAGE和Western Blot分析表达产物.结果:成功构建了重组载体pET44a(+)-Restin,并在E.coli Rosetta-gamiTM2(DE3)中获得了可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的8.9%.结论:可溶性Restin融合蛋白的获得为后续的功能研究、蛋白制备及其抗体研制奠定了基础.     

结核分枝杆菌H37Ra株HspX蛋白的表达条件优化、纯化和鉴定

以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得HspX基因,通过DNA无缝克隆技术将其克隆至pET28a质粒中,构建重组表达质粒pET28a-HspX。将pET28a-HspX转化至大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3),采用不同温度、IPTG浓度和时间诱导HspX蛋白表达。使用Ni-IDA亲和层析柱纯化目的HspX蛋白,透析去除咪唑,通过Western blot检测HspX抗原特异性。最终确定表达重组蛋白HspX的最佳诱导条件为：诱导温度37℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导时间8 h。结果表明,获得了高纯度和被特异性识别的可溶性Hsp X蛋白,为未来Hsp X蛋白用于结核病诊断试剂和疫苗奠定基础。     

SPA-Luc嵌合基因的构建及其融合蛋白活性检测

目的:葡萄球菌A蛋白-荧光素酶(SPA-Luc)原核表达载体的构建,表达,纯化,并对其生物学效应进行初步研究。方法:PCR扩增SPA和Luc基因,并连接到pET28a(+)中,构建原核表达质粒。构建正确的重组质粒转化至E.coliBL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western Blot鉴定,同时用Ni-NTA亲和层析法纯化SPA-Luc蛋白,最后用荧光素酶试剂盒和ELISA检测融合蛋白的生物学活性。结果:成功构建重组质粒pET28a(+)-SPA、pET28a(+)-Luc和pET28a(+)-SPA-Luc,SDS-PAGE及Western Blot证明正确表达了重组蛋白,并获得了纯化的融合蛋白SPA-Luc。荧光素酶试剂盒检测发现该蛋白仍能与IgG结合,并且与兔和鼠的IgG有较高亲和性。ELISA显示SPA-Luc蛋白替代常规二抗检测抗原,具有更高的敏感性。结论:成功的克隆、表达、纯化的SPA-Luc蛋白可用于抗原抗体的检测,且比常规二抗具有更高的敏感性,为进一步研究其在免疫学中的应用奠定了实验基础。     

重组人纤溶酶原Kringle1-5的制备及其

为了研究重组人纤溶酶原 Kringle1-5(K1-5)的抗血管生成活性及其对内皮细胞增殖的影响, 通过PCR扩增人纤溶酶原K1-5 cDNA,定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体pET-K1-5, 转化E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达,SDS-PAGE 和Western 杂交检测K1-5的表达。鸡胚尿囊膜 (CAM) 实验和MTT实验分别检测重组人纤溶酶原Kringle1-5对鸡胚新生血管生成和内皮细胞的抑制作用。结果表明,IPTG诱导原核表达载体pET-K1-5在E.coli BL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的32%, K1-5主要以包涵体形式存在,包涵体经过洗涤、溶解、Ni-spin 亲合柱层析纯化以及蛋白质复性等步骤后,获得了纯度约为96%的重组K1-5蛋白。CAM实验表明,原核表达的重组人K1-5能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成。MTT实验结果显示,重组人K1-5特异地抑制内皮细胞的增殖, 而对非内皮细胞无抑制作用。     

热玫瑰小双孢菌来源的丙酮酸磷酸双激酶的表达及应用

以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板, 通过PCR扩增得到了编码PPDK的基因, 将此基因片段插入到表达载体pET28a(+)中构建得到了重组表达质粒pET28a(+)-PPDK, 将重组表达质粒pET28a(+)-PPDK转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经过IPTG诱导, 重组菌成功表达了N端带有6-His Tag的重组PPDK。经SDS-PAGE分析, 重组PPDK单体分子量为101 kD。经过镍亲和层析和超滤后, 重组PPDK蛋白基本达到电泳纯, 并被成功应用于焦测序中。     

热玫瑰小双孢菌来源的丙酮酸磷酸双激酶的表达及应用

以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板, 通过PCR扩增得到了编码PPDK的基因, 将此基因片段插入到表达载体pET28a(+)中构建得到了重组表达质粒pET28a(+)-PPDK, 将重组表达质粒pET28a(+)-PPDK转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经过IPTG诱导, 重组菌成功表达了N端带有6-His Tag的重组PPDK。经SDS-PAGE分析, 重组PPDK单体分子量为101 kD。经过镍亲和层析和超滤后, 重组PPDK蛋白基本达到电泳纯, 并被成功应用于焦测序中。     

棉花GhVHA A基因的原核表达及其重组大肠杆菌的抗逆性分析

为进一步验证棉花GhVHA-A基因的功能,该研究将棉花GhVHA-A基因构建到原核表达载体pET28a上,利用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,同时对重组大肠杆菌BL21(pET28a-GhVHA-A)进行抗逆性分析。结果表明:(1)半定量RT-PCR分析发现,棉花幼苗液泡膜H+-ATPase基因(GhVHA-A)表达水平受脱水和高盐胁迫诱导。(2)将1 872bp长的编码区序列连接至原核表达载体pET28a上,成功构建了原核表达载体pET28a-GhVHA-A;SDS-PAGE电泳检测结果表明,在70kD左右处有1条特异表达的蛋白质条带,与预期的目的产物大小一致。(3)重组菌BL21(pET28a-GhVHA-A)的抗逆性分析发现,重组菌对PEG6000(20%)和NaCl(0.5mol/L)的抗性明显高于对照菌株BL21(pET28a),表明GhVHA-A基因在大肠杆菌中表达后能够增强菌株的抗性。本研究结果为GhVHA-A基因在植物抗逆基因工程中的应用提供了理论依据。     

嗜热栖热菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质研究

用PCR方法从嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27中扩增出编码α-葡萄糖苷酶基因hbg,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a( )上,电击转化E.coliBL21(DE3),获得高效表达hbg基因的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为59kD,与预期分子量相符。经镍柱和阴离子交换柱纯化的重组表达的α-葡萄糖苷酶HBG最适温度为95℃,最适pH值为5.0。