产过敏素harpin的固氮工程菌的某些特性研究

研究了产过敏素harpin的固氮工程菌（Enterobacter cloacaeE4)在番茄,烟草叶片上的致过敏能力及该菌所携的双质粒的稳定性。试验结果表明：E4与DH5（pCPP430)致过敏能力的速度和强度基本相同,E4与308R（pCPP430)相比,烟草上它们致过敏能力的速度基本一致。但308R（pCPP430)致过敏能力的强度更强,在番茄叶片上,E4和308R（pCPP430)致过敏能力的速度和强度基本一样,E4所携的双质粒pCPP430和pMC73A在宿主细菌中是不稳定的,在宿主细菌连续繁殖过程中,质粒pCPP430和pMC73A随宿主细菌的繁殖而发生缺失,当连续传代48代时,双质粒的丢失率达100%,而且各含一种质粒的细胞产生的机率基本相同。     

转基因生防菌308R(pCPP430)对番茄根围菌群的影响

研究目的在于了解转基因生防菌308R(pCPP430)对番茄根围菌群代谢能力和群落结构的影响。实验中使用了两种互为补充的方法,即单一碳源利用测试(SCSU)和ERIC-PCR,对分别以308R(pCPP430)悬液、308R悬液和无菌水蘸根处理的番茄植株根围菌群进行比较。SCSU菌落计数的聚类分析表明,308R(pCPP430)和308R处理的根围菌重复之间相似性好,水处理的相似性差。主成分分析也得到了相同的结果。ERIC-PCR聚类结果表明,10种碳源,其中8种水处理和308R处理聚为一类。实验为生防菌与植物的互作提供一些依据,为根围菌群结构研究提供一些新的思路。     

利用转座子将parDE与pCPP430体内重组提高生防工程菌的遗传稳定性

带有梨火疫欧氏杆菌 (Erwiniaamylovora)完整的hrp基因簇的重组粘粒pCPP43 0转化到植物的附生菌成团泛菌 (Pantoeaagglomerans) 3 0 8R中后可以使成团泛菌获得在烟草等植物上引发过敏反应和诱导植物抗病性的能力。pCPP43 0携带着约 40kb的梨火疫欧氏杆菌的染色体DNA ,在成团泛菌 3 0 8R中不能稳定遗传。本文首先把广宿主范围质粒RK2的控制质粒稳定性的parDE片段插入到转座载体pUT mini Tn5Km的唯一克隆位点NotI上 ,然后利用Tn5的转座特性 ,将parDE体内重组到pCPP43 0上 ,经过在无抗生素选择压下反复传代和过敏反应活性测定 ,筛选到了遗传稳定性显著提高的重组生防工程菌。     

重组生防菌308R(pKSH)的遗传稳定性研究

工程菌308R（pKSH）携带有梨火疫欧文氏杆菌的hrpN基因,能产生并分泌诱导植物抗病性蛋白-Harpin。该工程菌在无选择压培养基中生长50代,带有重组质粒pKSH的细胞占总菌量的23．1％,对照菌308R（pCPP430）的细胞占4．75％。将工程菌和对照菌喷雾到番茄叶面,保湿条件下的13d内,叶面菌量维持在10^5cfu／cm^2以上,自然条件下的5d内,菌量维持在10^4cfu／cm^2以上,其间308R（pKSH）的稳定性一直高于对照菌。因此证明工程菌308R（pKSH）比对照菌308R（pCPP430）稳定性有所提高,但还是不够理想。讨论了该工程菌不稳定的原因以及改进途径。     

重组生防菌308R(pKSH)的遗传稳定性研究*

工程菌308R(pKSH)携带有梨火疫欧文氏杆菌的hrpN基因,能产生并分泌诱导植物抗病性蛋白-Harpin。该工程菌在无选择压培养基中生长50代,带有重组质粒pKSH的细胞占总菌量的23.1%,对照菌308R(pCPP430)的细胞占4·75%。将工程菌和对照菌喷雾到番茄叶面,保湿条件下的13d内,叶面菌量维持在10⁵cfu/cm²以上,自然条件下的5d内,菌量维持在10⁴cfu/cm²以上,其间308     

菜豆重金属响应基因PvSR2在烟草中的表达及镉抗性分析

重金属特异诱导基因PvSR2(Phaseolus vulgaris stress-related)是从法国菜豆中克隆出来的, 为了研究该蛋白能否提高植物的抗重金属能力, 将PvSR2基因插入到植物转化中间载体pCAMBIA2301中CaMV 35S启动子的下游, 用根癌农杆菌介导的叶盘法将其导入烟草中, 在含有100 mg/L Kan的MS培养基上筛选, 获得了转基因植株. PCR和Southern杂交结果表明PvSR2已整合在烟草基因组中, GUS和Northern分析表明PvSR2在转基因烟草中获得表达. 重金属抗性实验表明: 与野生型烟草相比, PvSR2转基因烟草具有较高的抗重金属镉(Cd)的能力. 组织Cd含量分析显示: 在低浓度Cd (0.5~0.75 mmol/L)处理时, Cd在PvSR2转基因烟草与野生型烟草根中的累积量没有明显的差别, 而在高浓度Cd(0.1 mmol/L)胁迫下, 转基因烟草根中Cd的累积量低于野生型烟草, 说明PvSR2的表达能够提高植物的抗重金属能力, 同时表明PvSR2可能与重金属在植物中的运输和积累有一定关系.     

青霉素G酰化酶调节基因的定位

为了定位青霉素G酰化酶的调节基因,从质粒Ppa6克隆了一系列青霉索G酰化酶基因(pac)的片段,将这些重组质粒转化E.coli D816,测定克隆片段对pac表达的影响。如果克隆片段含有完整的调节基因(pacR)。诱导剂不能使由高拷贝pacR表达的阻抑物失活,部分阻抑物结合pac操纵基困,阻碍RNA聚合酶对加pac的转录,因此pac的表达量降低。发酵结果表明,阻抑物可能是由pac结构基因内部的ORFⅡ编码的蛋白因子。     

软腐欧氏杆菌的Ⅲ型分泌系统对harpin蛋白的识别与分泌

本文研究软腐欧氏杆菌分泌致病蛋白的Ⅲ型分泌系统的组分是否能识别梨火疫欧氏杆菌存在于mRNA上的分泌识别信号。用PCR的方法,将带有上游75bp可以在其mRNA的5′端形成一个典型的作为Ⅲ型分泌识别信号的茎环结构的梨火疫欧氏杆菌的诱导植物过敏反应的harpin的基因hrpN,从带有hrp基因簇的质粒pCPP430上克隆到pGEM\|T载体上,获得重组质粒pWGF1,经化学法转化到hrpN基因的转座突变体DH5α(pCPP430hrpN-)中,同时将pWGF1电击转化到胡萝卜软腐欧氏杆菌Se9R中,转化子的无细胞抽提物(CFEP)经Western\|blot检测到harpin蛋白已被表达;带有双重质粒的DH5α(pCPP430hrpN-/pWGF1)在番茄植物上可以引起过敏反应,Se9R(pWGF1)在大白菜上的致病力明显低于Se9R,初步表明一种植物病菌的harpin蛋白可被另外一种病菌的Ⅲ型分泌系统所识别、分泌并保持生物活性。     

SlCBL1基因在番茄抗灰霉病中的作用

以番茄(Solanum lycopersicum L.)品种‘Micro Tom’为试材,分析番茄叶片和果实的灰霉病发病规律,及番茄类钙调磷酸酶B基因(tomato calcineurin B-like gene,SlCBL1)在叶片和果实中的表达变化;比较转SlCBL1基因番茄与对照的叶片和果实的灰霉病发病过程,分析转基因番茄抗病相关转录因子表达变化。结果表明:(1)非转基因番茄中,不同叶龄的叶片均在接种灰霉病4d开始发病;不同发育阶段的果实接种灰霉病后发病时间也不同,其中绿果(花后16~18d)接种5d还未发病,白果(花后34~36d)接种11d开始发病,红果(花后40~42d)接种5d开始发病;SlCBL1基因表达量在番茄叶片中较低,在绿果期和白果期的果实中表达量最高,红果期果实中表达量最低。(2)转SlCBL1基因后,SlCBL1基因的过量表达能够抑制番茄叶片和果实灰霉病发生;同时番茄叶片和果实中几乎所有的抗病转录因子的表达量都上调,其中WRKY转录因子家族基因SlWRKY33和SlWRKY70受到强烈调控。研究说明,SlCBL1基因过量表达能够提高番茄的抗灰霉能力,其主要机理是通过影响抗病相关转录因子进而调控番茄抗灰霉病的能力。     

含庚型肝炎病毒E2基因片段质粒DNA能诱发相当强烈的体液免疫应答

研究了庚型肝炎病毒E2(HGVE2 )基因片段作为DNA疫苗的可行性。将来自于质粒pThioHis-E2编码HGVE2的基因片段 (559bp)亚克隆到质粒pCMV-S中 ,使之和HBsAg基因位于同一阅读框 ,形成重组质粒pCMV-S-E2。用纯化的质粒pCMV-S-E2DNA注射到昆明小鼠后腿四头肌中来免疫小鼠 ,同时用pCMV-S作为对照。间隔 14天再加强一次免疫。在加强免疫后的第 8天眼眶取血。用E2-GST融合蛋白作为固定化抗原 ,通过ELISA检测受试小鼠的体液免疫应答。结果表明 ,用质粒pCMV-S-EDNA免疫的小鼠可以产生很强的体液免疫应答。     

石榴木质素合成相关基因PgMYB308的克隆和表达分析

该研究以‘红玉石籽’(Punica granatumcv.Hongyushizi)石榴为试验材料,采用RACE和RT-PCR方法,获得与木质素的合成相关基因PgMYB308。PgMYB308基因cDNA全长792bp,编码263个氨基酸。分子量为29.56kD,理论等电点为9.07。序列比对和功能域分析发现,PgMYB308包含R2和R3保守域,以及C1、C2、C4和锌指基序。系统进化树分析显示,PgMYB308与其他物种起源相同,而与桉树EgMYB308亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,PgMYB308在茎、叶和种子等组织中均有表达,其中茎中表达量最高,叶片中表达量最低;PgMYB308在‘突尼斯软籽’中表达最高,而在‘红玉石籽’和‘白玉石籽’中表达量较低;PgMYB308在‘红玉石籽’籽粒的不同时期均有表达,但在花后20d相对表达量最高,以后随发育进程呈现逐渐下降的趋势。     

紫色马铃薯花青素StAN1基因的克隆及功能分析

MYB是植物花青素合成代谢途径中最主要的转录因子。该研究以紫色马铃薯B-5为试验材料,通过同源克隆技术,克隆了马铃薯花青素StAN1基因,并对StAN1基因的表达、遗传转化及其转基因烟草的花青素含量进行分析。结果表明:(1)StAN1基因全长774bp,编码了258个氨基酸;系统进化树分析发现,StAN1与辣椒、茄子、芦竹的亲缘关系最近,与矮牵牛、苹果等的亲缘关系最远。(2)荧光定量PCR分析显示,StAN1基因在马铃薯不同组织均有表达,其表达量从小到大依次为:根叶茎匍匐茎薯皮薯肉。(3)成功构建了表达载体pJAM1502-AN1,并经农杆菌(Gv3101)转化获得根、茎、叶片及叶脉均为紫红色的转StAN1基因烟草,PCR鉴定表明目的基因StAN1已成功转入烟草中。(4)花青素含量分析表明,野生型烟草叶片中花青素含量为2mg/g,叶片颜色为绿色,而转StAN1基因烟草叶片花青素含量达20mg/g,叶片颜色变成了紫红色。     

转GhB301基因烟草的防御酶活性及抗病相关基因表达分析

为了明确棉花ERF-B3亚族转录因子基因GhB301在烟草异位表达后(抗枯萎病中)的功能,该研究以过表达GhB301基因烟草和野生型烟草为材料,采用枯萎病菌孢子悬浮液接菌方法,分析病原菌侵染前后防御酶活性变化以及防卫相关基因的表达变化与抗病性的关系。结果显示:(1)棉花枯萎病菌处理15d后,2个转基因株系烟草叶片黄化程度与野生型相比较轻。(2)棉花枯萎病菌处理后,过表达GhB301转基因烟草和野生型烟草叶片过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)的活性较未接菌对照显著提高,并且酶活峰值出现均早于野生型材料;转基因材料叶片的POD、PAL、PPO活性均在处理3d后达到峰值,而野生型材料叶片的POD、PAL活性在处理5d后才达到峰值。(3)接种棉花枯萎病菌后活性氧相关基因、乙烯(ET)/茉莉酸(JA)途径相关基因、病程相关基因的表达量在转基因株系OE1和OE2中均受到明显影响。研究推测,GhB301在烟草中的异位表达激活了防卫相关基因的表达,提高了防御酶的活性,从而增强了烟草对枯萎病菌的抗性。     

黄单胞菌(Xanthomonas campestris)XA5-5β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达

以黄单胞菌(Xanthomonas campestris)XA5-5为供体菌,广泛寄主质粒pRK404为载体,在大肠杆菌中克隆了一个β-葡萄糖苷酶基因,重组质粒pLZS1外源片段为1.1kb,将pLZS1接合导入黄单胞菌XA5-5,得到了克隆子XA5-5(pLZS1).以水杨苷为底物,XA5-5(pLZS1)的酶活性大大高于E.Coli JM83(pLZS1).并且质粒在XA5-5中能相对稳定地存在.初步结果表明,所克隆的基因编码的产物对于水杨苷底物有较强的亲和力,并可以在一定程度上降低XA5-5中酶与pNPG底物的亲和力,使其酶活减小.     

番茄SlGRAS4基因特征分析和耐热功能鉴定

GRAS转录因子是调控植物生长发育和非生物胁迫响应的重要转录因子之一,而目前还没有GRAS调控高温胁迫的研究。为了深入研究番茄SlGRAS4生物功能,以耐热番茄LA2093为试验材料,分析番茄SlGRAS4基因结构、启动子序列及进化关系,利用qRT-PCR检测SlGRAS4在不同胁迫和不同激素处理下的表达水平,利用VIGS验证SlGRAS4基因耐热功能。结果表明:(1)生物信息学分析显示,SlGRAS4蛋白长度为666 aa,分子量为75 737.72 Da,理论等电点为6.31,含有GRAS转录因子家族典型的结构域,主要集中在C末端的277～657 aa之间;在SlGRAS4启动子区域发现脱落酸(ABA)和水杨酸(SA)响应元件;SlGRAS4与烟草NtGRAS1蛋白亲缘关系最近,推测SlGRAS4可能与其同源基因具有相似的生物功能。(2)在高温、低温、盐和干旱胁迫处理12 h时番茄SlGRAS4基因表达量升至最高,分别增加到对照的8.86、4.86、55.38和7.63倍;在ABA和SA激素处理8 h时SlGRAS4基因的表达量达到峰值,分别达到对照的120.72和3.55倍,说明SlGRAS4可能参与了多种非生物胁迫响应和激素信号传导。(3)沉默SlGRAS4基因番茄植株(VSlGRAS4)在高温胁迫下较对照植株(Ve)更容易萎蔫,且F_v/F_m与SOD、POD活性显著降低,REL和H_2O_2含量显著升高,说明在高温胁迫下沉默SlGRAS4使番茄植株细胞膜氧化损伤加重,光合能力降低,活性氧(ROS)清除酶活性减弱。(4)qRT-PCR分析显示,VSlGRAS4植株中高温信号应答关键基因HsfA1b、ROS信号应答基因ZAT10和ZAT12以及ROS清除酶编码基因CuZnSOD、FeSOD、APX1、APX2、CAT的表达水平均显著低于Ve植株,表明SlGRAS4转录因子可以通过调控高温和ROS信号转导来影响番茄的耐热性。研究认为,高温、低温、干旱、盐、ABA和SA均可显著诱导番茄SlGRAS4基因的表达,沉默SlGRAS4基因番茄植株的耐热性显著降低,证明番茄SlGRAS4基因具有耐热功能,为进一步解析SlGRAS4参与番茄耐热调控的分子机制奠定基础。     

冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因克隆和序列分析*

从作者自行分离的冰核细菌(Erwinia ananas 110)中克隆到我国第1个细菌冰核基因,并完成其序列测定和分析。所克隆基因编码区全长3921bp,编码1306aa,氨基酸序列明显分为3个区即N-端(161aa)、C-端(41aa)的单一序列区和中部的高度重复序列R区(1104aa),以16氨基酸为重复单元的R区占整个编码序列的84.5％。序列分析表明我们所克隆的基因为一个新冰核基因,将其命名为iceA,该基因已在GenBank上登录,登录号为:AF387802。     

烟草NtSKOR1基因的克隆及功能分析

该研究利用拟南芥AtSKOR蛋白序列,通过NCBI的Blast搜索获得烟草NtSKOR1基因CDS序列。设计全长CDS扩增引物,通过RT PCR方法从栽培烟草中克隆得到NtSKOR1基因,对其进行生物信息学、表达特性等分析,并利用CRISPR/Cas9技术获得NtSKOR1的敲除材料。结果表明：(1)NtSKOR1基因CDS由2 466 bp核苷酸组成,编码821个氨基酸,推测NtSKOR1蛋白等电点为6.36,分子量为94.21 kD。(2)NtSKOR1定位于细胞膜,有6个跨膜区,无信号肽序列;NtSKOR1蛋白含有孔形成区(P)及锚定蛋白区(ANK)等典型SKOR类蛋白功能域。(3)进化树分析表明,烟草NtSKOR1蛋白与番茄和马铃薯的SKOR蛋白遗传距离最近,与禾本科植物的SKOR蛋白遗传距离较远。(4)组织特异性表达分析表明,NtSKOR1基因主要在烟草根中表达,其表达模式与拟南芥一致;钾胁迫处理后,NtSKOR1基因呈先降低后升高再降低的表达模式。(5)CRISPR/Cas9敲除NtSKOR1基因,烟草叶片钾含量显著降低,表明NtSKOR1基因是控制烟叶钾离子的关键基因之一。该研究结果为解析烟草钾离子吸收转运的分子机制提供重要依据。     

籼稻半矮秆基因sd-t(t)的遗传定位及定位区间物理距离的估计

矮秆和半矮秆基因的利用及作用机制一直是作物育种和分子遗传研究的重要内容. sd-t(t)是从籼稻矮秆材料矮泰引-2中发现的一个与sd-1不等位的新半矮秆基因.利用由矮泰引-2与无叶舌标志基因系B30杂交产生的包含474个单株的F₂群体, 将sd-t(t)基因定位在水稻第4染色体上RFLP标记R514和R1408B之间, 距R514和 R1408B的遗传距离分别为1.1和4.5 cM. 利用水稻品系IRBB56 的BAC文库构建了sd-t(t)位点的跨叠克隆群, 并确定 R514与R1408B之间的物理距离大约为147 kb, 为进一步克隆sd-t(t)基因奠定了基础.     

中国古老月季‘月月粉’FT/TFL1基因的鉴定与表达分析

该研究以中国古老月季品种‘月月粉’(Rosa chinensis‘Old Blush’)为试材,根据拟南芥和草莓FT/TFL1基因家族成员的保守结构域设计引物,对‘月月粉’基因组DNA进行克隆和测序,结合数据库序列和双单倍体基因组信息进行序列比对,结果共获得了8条月季的FT/TFL1基因家族序列,且8条序列分别注释为2个FT基因(RcFT1和RcFT2)、1个BFT基因(RcBFT)、1个ATC基因(RcATC)、2个MFT基因(RcMFT1和RcMFT2)和2个PEBP基因(PEBP1和PEBP2);进化树分析结果将这8个基因分为3个亚组;结构分析显示8个基因的内含子为1～5个不等。qRT-PCR分析显示,RcFT1、RcPEBP、RcMFT1、RcMFT2和RcBFT在‘月月粉’的叶片中表达量最高,茎尖中次之;RcFT2在茎尖中的表达最高,叶片中次之;RcATC在茎尖中的表达量高于其他组织;除RcPEBP在根组织中有表达外,其他基因在根组织中几乎没有检测到。进一步表达分析显示,RcFT1和RcFT2在‘无刺光叶蔷薇’(R.wichuriana‘Basye’s Thornless')生殖生长期的叶片、茎尖中的表达量显著高于营养生长期。研究推测,具有连续开花性状的中国古老月季‘月月粉’可能具有多个开花时间(FT)基因位点,FT有可能可以作为月季生殖转换的标记基因。     

Elicitins与植物的抗病性

Elicitins是一类分子量约为 10kD的小分子蛋白激发子 ,由Phytophthora和Pythium两个属的植物病原卵菌胞外分泌产生 ,在烟草上引起过敏性反应 (hypersensitiveresponse,HR)和系统获得抗病性 (systemicacquiredresistance ,SAR)。文中从Elicitins结构与功能、生物学意义、基因表达调控 ,Elicitins在植物上诱发的信号传导和转Elicitins基因的抗病基因工程5个方面概述了E