中国不同地区和人群HDV cDNA的筛选、克隆及抗原编码区基因异质性的分析

为研究我国不同地区不同人群中ＨＤＶ毒株的感染分子特征,从我国河南、内蒙、北京、四川、广西、西藏、新疆、辽宁、上海等地的ＨＤＶ健康携带者、慢性丁肝病人与重症肝炎病人中筛选获得１０余份ＨＤＶ－ＲＮＡ阳性血清。经逆转录一多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）交叉扩增获得ＨＤＶ抗原编码区的ｃＤＮＡ片段并克隆到ＰＧＥＭ－３Ｚｆ（－）或ＰＧＥＭ－Ｔ载体上,经序列分析研究其基因结构特点,结果表明：中国的ＨＤＶ毒株基因型均为Ⅰ型,但至少存在ⅠＡ、ⅠＢ两个亚型,ＨＤＶ毒株在不同地区间存在异质性,其中河南－１、－２、－３株及新疆株与台湾株同源性较高（核苷酸与氨基酸同源性分别大于９２．１％与８６．９％）．当为ⅠＡ型;内蒙－１、四川、广西、西藏－１、辽宁、北京株与美国－１株同源性较高（核苷酸与氨酸同源性分别大于９４．３％与８８．８％）,当为ⅠＢ亚型;上海株与意大利株的核昔酸同源性最高,为９８．１％。研究证明我国新疆、内蒙、西藏等地区抗ＨＤ阳性率比其他省市高并不是由于存在其他基因型所致。     

中国不同临床型来源的丁型肝炎病毒部分基因组序列的分析比较

从我国河南,内蒙。北京等地的ＨＤＶ健康携带者,慢性丁肝病人与重症肝炎病人中,筛选获得４份ＨＤＶ－ＲＮＡ阳性血清。经逆转录－聚合酶链反应交叉扩增获得ＨＤＶ－ｃＤＮＡ片段,并克隆到ＰＧＥＭ－２ｚｆ（－）或ＰＧＥＭ－Ｔ载体上。经序列分析研究其结构特点,结果表明,同属基因Ｉ型的４株中国丁型肝炎病毒,在基因序列上具有相似的保守区域,但与同亚型ＨＤＶ健康携带者相比,重症肝炎病人与慢性丁肝病人来源的ＨＤＶ毒株。     

中国河南株丁型肝炎病毒全基因组的cDNA克隆和序列分析

从我国河南－抗丁型肝炎病毒抗原（ａｎｔｉ－ＨＤＡｇ）及丁型肝炎病毒（ＨＤｖ）ＲＮＡ双阳性的ＨＢｓＡｇ携带者血清中提取ＲＮＡ,采用人工合成的引物进行逆转录和聚合酶链反应（ＰＣＲ）,获得了贯穿ＨＤＶ全基因组的６个相互重叠的ｃＤＮＡ片段。经双脱氧末端终止法进行核苷酸序列分析,得到了长度为１６７４ｂｐ的我国人河南株ＨＤＶｃＤＮＡ全序列。计算机分析表明,该株与我国台湾株（ＨＤＶＩＡ型）、美国－１株（ＨＤＶＩＢ型）、日本－１株（ＨＤＶⅡ型）和秘鲁－１株（ＨＤＶⅢ型）的核苷酸同源性分别为的９４．３％、８６．８％、７５．４％和６６．３％,氨基酸序列的同源性分别为８９．７％、８５．１％、７１．９％和６４．６％,并在核苷酸和推导的ＨＤＡｇ氨基酸序列中分别发现了５个和２个集中保守的区域。这些区域均与ＨＤＶ的某些重要功能密切相关。     

从重症肝炎病人血清分离的丁型肝炎病毒核酶区的克隆与序列分析

从我国一例四川丁型肝炎病毒HDVRNA,丁型肝炎抗原均阳性的重症肝炎患者的血清中,用异硫氰酸胍法提取RNA经过逆转录PCR扩增后获得一长289bp的HDVcDNA片段,将PCR产物回收后直接克隆到PCRTMⅡ质粒,挑出阳性克隆并亚克隆入M13mp19的EcoRⅠ区位点,提取单链进行序列分析,结果显示与已知的中国河南、美国、日本、秘鲁和中国台湾5株HDVcDNA相同片段比较,同源性分别为对97.2％、93％、94％、79％、96％。     

戊型肝炎病毒细胞分离株部分核苷酸序列分析

用抗原捕获／多聚酶链反应（ＡＣ／ＰＣＲ）对戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）细胞分离株ＭＪ９０和Ｒ２５基因组的部分核苷酸序列进行扩增,获得了与ＨＥＶ缅甸株ＥＴ１·１相同的ｃＤＮＡ扩增带。该ｃＤＮＡ扩增带纯化后用双脱氧核苷酸ＤＮＡ链末端终止法测序,ＣＪ９０、Ｒ２５株的核苷酸和氨基酸序列与ＥＴ１·１克隆的同源性分别为９９．６％、１００％和９９％、９９％,从而证明ＭＪ９０和Ｒ２５毒株为ＨＥＶ．     

比较不同中国株丁型肝炎病毒（HDV）重组抗原检测抗HDV抗体的差异

我国属于乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染高发区和丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）感染低发区。为了弄清我国ＨＤＶ感染率低是否是由于我国存在不同血清型ＨＤＶ所致。我们在原核细胞上表达了我国ＨＤＶ基因ＩＡ亚株型（河南株）和ＩＢ亚型株（四川株）抗原编码区基因,并应用这些基因重组丁肝抗原检测了四川,河南,内蒙三省（区）的２５２份ＨＢｓＡｇ阳性携带者血清,并与美国提供的重组丁肝抗原做了比较,结果证明,对以上三种抗原均阳性者８     

丙型肝炎病毒RNA打点杂交检测方法同RT－PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针,建立了用打点杂交（ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法,同采用ＨＣＶ基因组５’端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异地检出血清中ＨＣＶＲＮＡ,但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断,可采用这两种方法。这两种方法的敏感性在很大程度上依赖于引物和探针的敏感性,以及ＲＮＡ提取方法。ＲＴ－ＰＣＲ法适用于诊断病毒血症和复制,打点杂交法适用于研究ＨＣＶＲＮＡ量的变化,对治疗的评价,以及为实验筛选较高滴度的ＨＣＶＲＮＡ阳性样本。     

南方鲇生长激素完整cDNA的克隆及其DNA序列分析

采用RT-PCR法和3'、5'RACE(Rapid amplification of cDNA ends）法从南方鲇脑垂体RNA克隆出生长激素(Growth hormone,GH）cDNA。此cDNA全长1087nt(含Rloy(A)),其5'端非编码区长52nt、阅读框（Open rdading frame,ORF）长603nt、3'端非编码区长415nt。其推导的GH由200个氨基酸组成,其中前24个氨基酸为信号肽部分。氨基酸序列比较表明,南方鲇（GH）与Pangasianodon gigas、Ictalurus punctatus 和Heteropneustes fossilis三种鲇类的同源性分别为97.5%和95.0%,与鲢、鳙、草、鲤鱼的GH同源性达76.0%以上,而与人的GH(I、Ⅱ)同源性最低为31.0%和29.5%。     

鼻咽癌中Epetein－Barr病毒基因结构特点

鼻咽癌中感染的ＥＢＶ以潜伏态存在,只有少数基因得到表达。我们从分子生物学水平研究其潜伏机制。已知ＢＺＬＦｌ基因和ＢａｍＨＩＥＺ片段内部分基因对ＥＢＶ的复制激活起关键作用。我们用体外基因扩增（ＰＣＲ）法扩增ＢＺＬＦｌ基因外显子－１序列,并用序列分析法研究了该基因结构特点。此外,检测了ＢａｍＨＩＥＺ片段内缺失,结果发现２１例鼻咽癌（ＮＰＣ）组织中,ｌｌ例有ＢａｍＨＩＥＺ片段内缺失,长２．９９ｋｂ,与潜伏态存在的ＲａｊｉＥＢＶ类似。提示鼻咽癌小的ＥＢＶ以潜伏态存在,与ＮＰＣ发病有关。     

γ射线诱导质粒pGEM-3Zf(-)DNA lacZ基因突变的序列分析

利用质粒ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）ＤＮＡ上带有的ｌａｃＺ基因,通过Ｘ－ｇａｌ显色平板筛选经＾６０Ｃｏγ辐射诱导形成的突变体。对４个突变体的ｌａｃＺ基因进行序列分析发现,所有突变体无一例外地检测到碱基变化。在被测序的４８９ｂｐ范围内,一个突变体发生的碱基变异达２－７个位点。碱基变异的类型包括颠换（５７％）、转换（１９％）、缺失（１９％）及插入（５％）。在碱基置换中,以Ｃ／Ｇ→Ａ／Ｔ颠换最多（占５０％）。     

丙型肝炎病毒北京株NS3基因的克隆及测序

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从北京株丙型肝炎病毒中扩增出ＮＳ３区基因片段,该片段经ｐＧＥＸ－Ｔ载体克隆到大肠杆菌ＤＨ５α菌株中．经自动序列分析仪测出ＮＳ３基因的７２８ｂｐ长的核酸序列．发现在该片段中第３１位核苷酸发生Ａ→Ｔ突变,产生一个终止突变．这表明,丙型肝炎病毒北京株存在一定的变异,产生缺陷型病毒,这类缺陷型病毒的出现可能是丙型肝炎病毒持续性感染的原因之一．     

南京地区戊型肝炎病毒基因型鉴定和变异分析

为了解南京地区戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)基因型的分布以及变异状况,本研究采用逆转录套式聚合酶反应(RT-nPCR)的方法检测南京地区40份急性散发性戊型肝炎患者的粪便标本,对PCR产物进行测序,利用生物信息学软件比较核苷酸的同源性、遗传距离,进行基因分型和变异分析。40份粪便标本中检测到14份阳性HEV、RNA,检出率为35%,基因分型均为HEV IV型,且分属2个不同的亚型;利用生物信息学软件对国内I型和IV型毒株加以比较,发现HEV IV型毒株比I型变异程度高,不同年份的HEV IV型毒株变异更大,有新的亚型出现,且变异有随时间推移而增大的趋势。     

中国不同来源狂犬病病毒野毒株G基因主要功能区的序列分析

对我国不同来源的狂犬病病毒野毒株８２０２、ＢＲＶ、ＭＲＶ的Ｇ基因４０５￣１１４６位核苷酸序列,进行了逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增、克隆和序列测定,并应用计算机对这３个毒株的测定序列和已发表的中国人源毒株（ＣＧＸ８９）的相应序列进行了分析比较。结果表明,这４个中国不同来源狂犬病病毒的Ｇ基因同源性较低,８２０２与ＢＲＶ的核苷酸同源性只有７９．５％,与ＭＲＶ的氨基酸同源性亦只有８２．２％;同     

南京地区戊型肝炎病毒基因型鉴定和变异分析

为了解南京地区戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)基因型的分布以及变异状况,本研究采用逆转录套式聚合酶反应(RT-nPCR)的方法检测南京地区40份急性散发性戊型肝炎患者的粪便标本,对PCR产物进行测序,利用生物信息学软件比较核苷酸的同源性、遗传距离,进行基因分型和变异分析.40份粪便标本中检测到14份阳性HEV、RNA,检出率为35%,基因分型均为HEV Ⅳ型,且分属2个不同的亚型;利用生物信息学软件对国内Ⅰ型和Ⅳ型毒株加以比较,发现HEV Ⅳ型毒株比Ⅰ型变异程度高,不同年份的HEV Ⅳ型毒株变异更大,有新的亚型出现,且变异有随时间推移而增大的趋势.     

湖北麻鸭乙型肝炎病毒全基因组的克隆和序列分析

为了解湖北地区Thisfindingwasalsoconfirmedbythephylogenetictreeanalysis.麻鸭中鸭乙型肝炎病毒(DuckhepatitisBvirus,DHBV)自然感染状况以及湖北麻鸭所携带DHBV的基因结构特征,采集了70份成年麻鸭血清并应用PCR技术检测DHBVDNA,对其中一份DHBVDNA阳性血清进行DHBV全基因扩增,并进行克隆与序列测定分析。结果表明,湖北麻鸭DHBV自然携带率为10%;湖北DHBV分离株(GenBank登录号DQ276978)基因组的全长为3024bp,有编码P,S和C蛋白的三个开放阅读框;与GenBank中17株DHBV基因组比较,核苷酸同源性介于89.85%~93.29%之间;S蛋白、C蛋白和P蛋白结构功能区序列均高度保守;而对P蛋白标志性氨基酸和全基因进化树的分析表明,该分离株属于DHBV中国基因型中的一个亚型。     

湖北麻鸭乙型肝炎病毒全基因组的克隆和序列分析

为了解湖北地区This finding was also Confirmed by the phylogenetic tree analysis.麻鸭中鸭乙型肝炎病毒(Duck hepatitis B virus,DHBV)自然感染状况以及湖北麻鸭所携带DHBV的基因结构特征,采集了70份成年麻鸭血清并应用PCR技术检测DHBV DNA,对其中一份DHBV DNA阳性血清进行DHBV全基因扩增,并进行克隆与序列测定分析.结果表明,湖北麻鸭DHBV自然携带率为10%;湖北DHBV分离株(GenBank登录号DQ276978)基因组的全长为3024bp,有编码P,S和C蛋白的三个开放阅读框;与GenBank中17株DHBV基因组比较,核苷酸同源性介于89.85%～93.29%之间;S蛋白、C蛋白和P蛋白结构功能区序列均高度保守;而对P蛋白标志性氨基酸和全基因进化树的分析表明,该分离株属于DHBV中国基因型中的一个亚型.     

两例丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)重叠感染者的HCV核心区cDNA序列分析

从临床肝病患者中选择两例ＨＣＶ和ＨＢＶ重叠感染者ＨＳＱ和ＳＺＨ,他们血清中的生化指标丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ）持续异常,肝活检病理示有严重的肝损伤。在ＡＬＴ异常期,血清学检测结果为ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ阳性,抗ＨＣＶＩｇＧ（包括Ｃ２２、Ｃ３３ｃ）阴性,但套式ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ阳性,核心区ｃＤＮＡ序列分析发现该区有１个密码子（ＧＧＣｎｔ３８５—３８７）缺失,对应缺失的氨基酸是甘氨酸（ＧＬＹ）,从血清学检测和序列分析结果推测,在ＨＣＶ和ＨＢＶ重叠感染中,ＨＢＶ和ＨＣＶ均可处于持续复制状态,抗ＨＣＶＩｇＧ抗体阴性可能是ＨＣＶ的多蛋白前体翻译和病毒颗粒装配受到ＨＢＶ干扰的结果。