香鳞毛蕨 1 脱氧 D 木酮糖 5 磷酸合酶基因的克隆及表达分析

1 脱氧 D 木酮糖 5 磷酸合酶(DXS)是甲基 D 赤藓醇 4 磷酸(MEP)途径中控制影响植物萜类化合物合成的第一个限速酶。该研究对香鳞毛蕨(Dryopteris fragrans)DfDXS基因进行序列特征及生物信息学分析,并通过qRT PCR技术分析其在外源激素、干旱、盐胁迫、高温及低温处理下的表达模式,旨在探究DfDXS基因在香鳞毛蕨萜类生物合成及抗逆机制中的作用,为进一步解析香鳞毛蕨抗逆分子机制奠定基础。结果显示：(1) DfDXS1基因全长2 139 bp,编码712个氨基酸,而DfDXS2全长2 160 bp,编码719个氨基酸;结构域分析显示,其具有典型的转酮醇酶保守域,包含焦磷酸硫胺素结合位点和转酮醇酶结构域;DfDXS氨基酸序列与江南卷柏(Selaginella moellendorffii)和银杏(Ginkgo biloba)的DXS等关系较近。(2)水杨酸(SA)处理下,DfDXS基因的相对表达量先升高后降低;脱落酸(ABA)抑制DfDXS的表达;DfDXS1/2在茉莉酸甲酯(MeJA)处理下相对表达水平均显著高于对照;乙烯利(Eth)抑制DfDXS的表达,但DfDXS1处理3 h时表达水平显著高于对照。(3)聚乙二醇(PEG)、高温和低温均诱导DfDXS1上调表达。研究推测,香鳞毛蕨DXS基因在萜类物质合成与逆境胁迫机制中发挥着重要的作用。     

香鳞毛蕨DfDREB基因克隆与表达模式分析

DREB(dehydration-responsive element-binding)转录因子是响应非生物胁迫反应的主要调节因子,为探索DREB在多年生草本药用植物香鳞毛蕨[Dryopteris fragrans(L.) Schott]抗逆过程中的功能,该研究克隆了DfDREB基因并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR方法分析了DfDREB基因在不同激素及干旱、NaCl、高温和低温等逆境胁迫处理下的表达模式。结果表明:(1)成功获得DfDREB基因全长1 203 bp,其编码401个氨基酸,相对分子质量为43.66 kD,等电点为6.13,是亲水性非分泌蛋白,该蛋白具有AP2保守结构域,属于AP2家族。(2)实时荧光定量PCR分析表明,DfDREB基因在香鳞毛蕨根、叶柄和叶中均有表达,其中在叶中表达量最高,根中表达量最低;在水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯利(ETH)处理时,DfDREB基因表达上调,并都在1 h时表达量达到峰值;在脱落酸(ABA)处理时,DfDREB基因的相对表达量仅在12 h和24 h时呈上调表达,其余时间为下调表达;在干旱、NaCl和高温处理时,DfDREB基因表达均上调;低温处理0.5 h和12 h时DfDREB基因表达显著上调,但在低温处理1～6 h和24 h时无明显变化。研究表明,DfDREB基因响应激素和非生物胁迫处理,且基因表达受胁迫诱导。该研究结果为进一步探索香鳞毛蕨抗逆分子机制奠定了基础。     

百合LbCAT和LbGPX基因的克隆与表达分析

以切花百合(Lilium brownii var. viridulum)‘卡瓦纳’cDNA为模板,克隆了过氧化氢酶(LbCAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(LbGPX)基因。序列分析表明,这2个基因分别包含1 479 bp和519 bp的开放阅读框(ORF),编码492个和172个氨基酸。进化分析结果表明,LbCAT蛋白与岷江百合CAT蛋白的氨基酸序列相似性最高(99.19%),且亲缘关系最近;LbGPX蛋白与油棕GPX蛋白的氨基酸序列相似性最高(78.61%),亲缘关系最近。qRT PCR结果显示,LbCAT和LbGPX在百合根、鳞茎、叶和花中都有表达。LbCAT在叶中表达量最高,LbGPX在花中表达量最高。这2个基因在百合花蕾的生长发育过程中均有表达,且表达量逐渐增加;在PEG处理后2个基因的转录水平升高,但独角金内酯(SLs)处理却显著降低了这2个基因的转录水平;该结果为百合抗逆性机理研究以及抗逆育种奠定了基础。     

香鳞毛蕨的化学成分研究

本文对香鳞毛蕨水提液进行大孔树脂柱色谱,用水、30%、60%、95%乙醇依次洗脱,从香鳞毛蕨30%乙醇组分中分离得到10个化合物,通过波普数据和理化性质分别鉴定为:5,7二羟基-2-羟甲基色原酮(1)、咖啡酸甲酯(2)、2S-圣草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(3)、二氢松柏醇(4)、1,3-二羟基-5-丙基苯(5)、3β-羟基-5α,6α-环氧-7-大柱香波龙烯-9-酮(6)、2-羟基苯甲酸(7)、咖啡酸(8)、对羟基苯乙酮(9)、圣草素(10),以上化合物中4~10为首次从鳞毛蕨属植物中分离得到。     

香鳞毛蕨配子体发育的研究

研究了香鳞毛蕨(Dryopteris fragrans (L.)Schott)配子体的发育过程。结果发现孢子极面观为椭圆形,赤道面观为半圆形,单裂缝。孢子萌发为书带蕨型;丝状体2～9个细胞长,有明显顶端细胞,可形成多细胞的广阔板状片状体;片状体顶端分生组织继续分裂,发育为幼原叶体;原叶体发育为三叉蕨型;毛状体数量丰富,均为单细胞;颈卵器和精子器几乎同时形成,较小;成熟原叶体倒卵状心脏形。该配子体表现为进化性状。     

马尾松PmPGK1和PmGPIC基因的克隆和表达分析

为了解马尾松（Pinus massoniana）磷酸甘油酸激酶1（PGK1）与胞质溶胶葡萄糖磷酸异构酶（GPIC）的功能，采用RACE技术克隆了PmPGK1和PmGPIC基因，并进行了生物信息学分析与亚细胞定位，采用实时荧光定量PCR技术分析PmPGK1和PmGPIC的表达特性。结果表明，PmPGK1和PmGPIC全长为2 106和1 848 bp，分别编码507和566个氨基酸。PmPGK1和PmGPIC分别定位于叶绿体和胞质溶胶。PmPGK1表达量为新叶 > 老叶 > 新茎 > 根 > 花；而PmGPIC为老叶 > 花 > 新叶 > 新茎 > 根。低温胁迫24 h，PmPGK1和PmGPIC的表达量均随时间延长先降低后升高，且PmGPIC的表达量在处理2 h后即降至较低水平；高浓度CO₂胁迫24 h，PmPGK1的表达量随时间延长呈降低-升高-再降低的变化趋势，PmGPIC的表达下调但变化较不显著。因此，推测PmPGK1主要参与卡尔文循环及叶绿体/质体糖酵解，PmGPIC主要参与细胞质基质糖酵解；PmPGK1、PmGPIC活性在低温胁迫下均受抑制；PmPGK1活性在CO₂胁迫下受到显著抑制，而PmGPIC活性的影响不大。     

菜心SOD基因的克隆及其在低温条件下的表达分析

采用同源克隆法从菜心中获得3个SOD基因,并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR分析3个基因在不同组织器官和低温胁迫下的表达模式。结果表明:(1)获得Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD基因的ORF,分别命名为BclCZSD、BclFSD、BclMSD,序列长分别为459、639、696bp,分别编码152、212、231个氨基酸。(2)生物信息学分析显示,3种蛋白均为稳定的亲水性蛋白,均不存在跨膜结构和信号肽,BclCZSD的二级结构以无规则卷曲为主,含有2个Cu/Zn-SOD结构域,BclFSD和BclMSD的二级结构以α-螺旋为主,含有一个相同的Mn/Fe-SOD结构域;进化分析显示BclCZSD和BclMSD与油菜最先聚在一个分支,BclFSD与甘蓝、萝卜、油菜、芜菁聚在一个分支。(3)qRT-PCR结果显示,BclCZSD、BclFSD和BclMSD基因在菜心根、茎、叶和叶柄中均有表达,且在根、茎、叶和叶柄中的表达模式不完全相同;低温条件下,3个基因的表达量随着胁迫时间的延长均呈先升高后降低的变化趋势。研究结果为进一步探讨菜心SOD基因在低温胁迫下的响应机制奠定了基础。     

香菜CsEF 1α基因克隆与表达分析

翻译延伸因子EF 1α(elongation factor 1 alpha)是细胞中最丰富的蛋白质之一,其在确保mRNA正确解码以产生细胞蛋白质方面发挥重要作用。该研究采用RT PCR扩增方法克隆香菜CsEF 1α基因序列,利用生物信息学对CsEF 1α基因结构、序列特征及系统进化等进行分析,并采用qPCR探究CsEF 1α基因在香菜不同生长时期和非生物胁迫下的表达模式,为进一步揭示EF 1α基因调控机制的研究奠定基础。结果显示：(1)成功克隆获得香菜CsEF 1α基因序列;CsEF 1α基因包含1个1 344 bp的开放阅读框,编码447个氨基酸,分子式为C₂₂₀₂H₃₅₄₄N₅₉₄O₆₄₄S₂₀,蛋白质分子量为49.29 kD,等电点为9.12;氨基酸序列组成中赖氨酸数量最多(49个,占11.0%),色氨酸数量最少(3个,占0.7%);属碱性蛋白。(2)CsEF 1α蛋白主要由无规则卷曲(36.91%)和α 螺旋(30.43%)构成,定位于细胞质;系统进化树分析显示,CsEF 1α与胡萝卜、野生番茄、青蒿素和非洲菊的亲缘关系较接近;启动子分析包括4种植物生长发育元件、3种激素响应元件和3种胁迫响应元件。(3)qRT PCR结果显示,CsEF 1α基因的表达量随着香菜生长发育时间的延长而升高,并且与转录丰度的变化一致;CsEF 1α基因对4种不同非生物胁迫的响应表达模式有所差异;随着胁迫时间的延长,在盐胁迫下CsEF 1α基因表现出先升高后降低趋势,而在低温、高温和干旱胁迫下表现出先降低再升高的趋势。研究表明,CsEF 1α基因参与了香菜对非生物胁迫的应答,在香菜生长发育和非生物胁迫中具有重要调控作用。     

鹅掌楸LcUGE基因的克隆和组织表达分析

为了解鹅掌楸(Liriodendron chinense)的UGE基因功能,采用RACE和EPIC-PCR技术克隆到2个UGE基因,命名为LcUGE1和LcUGE2。结果表明,LcUGE1基因的c DNA全长为1 531 bp,包含1 050 bp的开放阅读框,编码349个氨基酸, gDNA长度为11 920 bp;LcUGE2基因的c DNA长度为1 378 bp,包含1 056 bp的开放阅读框,编码351个氨基酸,g DNA长度为6544 bp。LcUGE1和LcUGE2基因均含有9个外显子和8个内含子,且外显子长度和内含子剪切位点序列几乎一致,但内含子片段长度存在显著差异。编码的LcUGE1和LcUGE2蛋白高度保守,保守性达到82%。LcUGE1基因在雄蕊中表达量最高,而LcUGE2基因则在花萼中表达量最高。这表明LcUGEs基因可能参与鹅掌楸的生殖发育过程。     

华丽龙胆GsF3′5′H和GsFNS基因的克隆及表达分析

该研究以华丽龙胆(Gentiana sino ornata)5个不同开放阶段(H₁~H₅)的蓝色花冠为试材,利用RT PCR技术克隆GsF3′5′H和GsFNS全长序列,并进行生物信息学分析,比较GsF3′5′H和GsFNS在不同组织和不同开放阶段的基因表达模式。结果显示：(1)所克隆的GsF3′5′H和GsFNS基因分别包含1 560 bp和1 590 bp开放阅读框(OFR),并分别编码520和529个氨基酸。(2)结构分析显示,GsF3′5′H和GsFNS均具有典型的F3′5′H和FNSⅡ蛋白保守结构域。(3)系统进化树分析表明,GsF3′5′H和GsFNS亲缘关系最近的物种是三花龙胆(Gentiana triflora)。(4)qRT PCR结果显示,GsF3′5′H和GsFNS基因在根、茎、叶和花冠中均表达,其中GsF3′5′H基因在花冠H₃阶段表达量最高。GsFNS在根中表达量最高,其次在花冠H₄阶段两基因的表达均较高。研究推测,GsF3′5′H基因表达产生的飞燕草素苷和GsFNS表达产生的黄酮共着色作用可能使华丽龙胆的花冠呈更稳定艳丽的蓝色,为蓝色花分子育种提供重要的基因资源。     

桂花RAP2 12基因的克隆与表达模式分析

国家自然科学基金(31870695);     

桂花查尔酮异构酶OfCHI基因的克隆与表达分析

查尔酮异构酶CHI是花青素苷合成途径中的关键酶。为了解桂花花青苷的合成机理,该研究对3个桂花品种的花青苷含量进行了测定。结果显示:(1)‘橙红丹桂’花中的花青苷含量最高,‘金桂’和‘早银桂’中花青苷含量较低。(2)利用RACE和RT-PCR方法获得了桂花查尔酮异构酶基因(OfCHI)的全长cDNA序列1 069bp,该基因编码248个氨基酸,相对分子量为26.85kD,等电点为6.34。(3)多重序列比对显示,OfCHI与金花茶CnCHI、忍冬LjCHI、石榴PgCHI的相似性分别为68.13%、65.86%和63.53%,氨基酸序列中含有CHI蛋白的活性位点Thr47、Tyr108、Met115以及Ser192;系统进化树分析表明,OfCHI与其他物种起源相同,而与油橄榄OeCHI亲缘关系最近。(4)利用qRT-PCR对不同桂花品种、不同组织中OfCHI的表达量检测结果显示,OfCHI在‘橙红丹桂’花中表达量最高,在‘金桂’和‘早银桂’中表达量较低;OfCHI在‘橙红丹桂’、‘金桂’和‘早银桂’的花、茎、叶中均有表达,且表达趋势相同,均为叶中表达量最高。该研究为揭示桂花青素苷的合成机理奠定了理论基础,并为培育不同花色的桂花新品种提供了基因专利。     

穿龙薯蓣DnSQS基因的克隆及表达分析

角鲨烯合成酶(SQS)是植物甾醇和萜类化合物合成的关键酶之一。为了揭示穿龙薯蓣SQS基因的功能,该研究以穿龙薯蓣cDNA为模板,采用PCR方法克隆DnSQS基因,并对得到的序列进行生物信息学分析。采用HPLC方法检测不同组织的薯蓣皂苷元含量,采用实时荧光定量PCR技术分析DnSQS基因在不同组织、激素诱导及非生物胁迫下的表达特征。结果表明：(1)成功克隆得到穿龙薯蓣2个基因DnSQS1与DnSQS2,二者分别编码409和433个氨基酸,但编码的蛋白二级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主,都存在由α螺旋折叠形成的保守催化中心以及2个富含天冬氨酸的功能结构,都具有2个跨膜螺旋结构,并且都定位于内质网。(2)DnSQS1和DnSQS2与盾叶薯蓣DzSQS的亲缘关系较近,2个DnSQS蛋白在进化上相对保守。(3)不同组织的薯蓣皂苷元含量存在差异,其含量大小依次为叶>根状茎>地上茎>根;DnSQS1与DnSQS2基因在不同组织中的表达也具有显著差异,其中DnSQS1在地上茎中表达水平最高,DnSQS2在叶中表达水平最高。(4)以激素MeJA、ABA、SA、Eth及非生物胁迫H     

NaCl胁迫对5个桂花品种叶片超微结构的影响

该研究以5个桂花品种为材料,以Hoagland培养液为对照,设计2个NaCl含量(70、100 mmol/L)处理10 d后利用透射电镜和扫描电镜观察各处理不同品种的叶片超微结构特征,以明确桂花品种对耐NaCl胁迫的解剖结构响应机制。结果显示：(1)透射电镜观察发现：随NaCl 胁迫程度的加强,5个桂花品种叶肉细胞中叶绿体结构受到不同程度地破坏;70 mmol/L NaCl处理后,5个品种的细胞核基本保持正常,而100 mmol/L NaCl处理后核内染色质发生降解;随着NaCl胁迫程度的加强,5个桂花品种的类囊体片层结构中嗜锇颗粒明显增多;在膜结构方面,大叶银桂的叶肉细胞被破坏程度最为严重,叶绿体膜被破坏,叶绿体形状基本不能辨认。(2)扫描电镜观察结果显示：随着NaCl浓度的增大,5个品种叶片表面的气孔密度不断增大,而张开气孔的密度却不断减小,且叶肉细胞体积均缩小;‘大叶银桂’、‘笑秋风’、‘晚籽银桂’的栅栏组织占叶厚的比重随NaCl胁迫浓度的增大而升高,‘潢川金桂’和‘紫梗籽银桂’的栅栏组织占叶厚的比重则随NaCl胁迫浓度的增大而呈先升高后降低的趋势。研究表明,NaCl胁迫对桂花叶片细胞叶绿体、细胞核等的超微结构会造成损伤,且NaCl胁迫浓度越高损伤越明显。该试验可初步判断‘大叶银桂’、‘笑秋风’、‘晚籽银桂’的耐盐性略高于‘潢川金桂’和‘紫梗籽银桂’。     

Anticariogenic activity of macelignan isolated from Myristica fragrans (nutmeg) against Streptococcus mutans

The occurrence of dental caries is mainly associated with oral pathogens, especially cariogenic Streptococcus mutans. Preliminary antibacterial screening revealed that the extract of Myristica fragrans, widely cultivated for the spice and flavor of foods, possessed strong inhibitory activity against S. mutans. The anticariogenic compound was successfully isolated from the methanol extract of M. fragrans by repeated silica gel chromatography, and its structure was identified as macelignan by instrumental analysis using 1D-NMR, 2D-NMR and EI-MS. The minimum inhibitory concentration (MIC) of macelignan against S. mutans was 3.9 microg/ml, which was much lower than those of other natural anticariogenic agents such as 15.6 microg/ml of sanguinarine, 250 microg/ml of eucalyptol, 500 microg/ml of menthol and thymol, and 1000 microg/ml of methyl salicylate. Macelignan also possessed preferential activity against other oral microorganisms such as Streptococcus sobrinus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei in the MIC range of 2-31.3 microg/ml. In particular, the bactericidal test showed that macelignan, at a concentration of 20 microg/ml, completely inactivated S. mutans in 1 min. The specific activity and fast-effectiveness of macelignan against oral bacteria strongly suggest that it could be employed as a natural antibacterial agent in functional foods or oral care products.     

盐穗木HcPEAMT基因的克隆及表达分析

依据盐穗木编码PEAMT的EST序列设计引物,通过快速扩增cDNA末端技术,获得盐穗木磷酸乙醇胺甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)全长cDNA,命名为HcPEAMT。序列分析表明HcPEAMT基因开放阅读框为1 482bp,编码494个氨基酸,推测分子量为56.3kD,理论等电点为5.51。保守结构域分析表明,HcPEAMT含有2个独立的S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的保守结构域,每个结构域含有4个基序。系统进化树分析确认HcPEAMT与盐生植物盐角草的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,盐胁迫3h时,盐穗木同化枝和根中HcPEAMT基因的表达迅速上调并达到最大值,分别为对照的4.3倍和6.7倍。脱落酸(ABA)胁迫3h时,同化枝中HcPEAMT的表达量达到最高,而根中HcPEAMT的表达在12h才达到最高,表达量分别为对照的2.6和2.5倍。研究结果表明,HcPEAMT基因表达受盐胁迫的强烈诱导,也受ABA胁迫的诱导。该研究结果有助于阐明HcPEAMT基因表达与植物抗逆性的相关性。     

遮阴对四季桂生理生态特性的影响

为了解遮阴对四季桂(Osmanthus fragrans)生长的影响,研究了成都地区夏季遮阴处理下四季桂扦插苗生理生态特性的变化。结果表明,随遮光率增加,比叶重下降;叶绿素b(Chl b)含量增加,Chl a/b降低。遮阴下叶片可溶性糖、可溶性蛋白含量降低,以80%遮光率下降的最显著;随遮光率上升,叶片丙二醛(MDA)含量下降,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性降低,以55%、80%遮光率的MDA含量下降显著。遮阴处理下,叶片光饱和点(LSP)、光补偿点(LCP)、最大净光合速率(Pmax)、暗呼吸速率(Rd)均下降,而表观量子速率(AQE)增大;瞬时光能利用率(LUE)升高,净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、气孔限制值(Ls)均降低,胞间CO_2浓度(Ci)升高。四季桂幼苗主要通过提高Pn和抗氧化酶活性来适应强光环境;降低SLW、LSP、LCP和Rd,提高Chl和Ci含量,增大AQE和LUE提高弱光利用能力,中度遮阴(25%、55%遮光率)有利于幼苗在夏季的生长。     

甘菊ClHSP70与ClHSP90基因的克隆及表达分析

该研究以甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)为实验材料,通过RT-PCR方法从甘菊转录组数据中分离出热激蛋白合成相关基因,命名为ClHSP70和ClHSP90。序列分析表明,ClHSP70基因ORF全长为2 559bp,编码852个氨基酸,蛋白功能区预测表明含有典型的HSP70蛋白NBD和SBD保守结构域;ClHSP90基因ORF全长为2 094bp,编码697个氨基酸,含有HATPase结构域和HSP90保守结构域。生物信息学分析表明,甘菊ClHSP70与大豆(Glycine max)和烟草(Nicotiana tomentosiformis)HSP70蛋白有较高的一致性,ClHSP90基因编码的氨基酸序列与紫茎泽兰(Ageratina adenophora)HSP90高度相似;实时荧光定量表达分析表明,在42℃处理不同时间,甘菊叶片中ClHSP70和ClHSP90基因表达均在0.5h时显著增加,1h达到最大值,2h后缓慢下降;不同组织表达分析表明,甘菊在42℃处理1h后,ClHSP70在成熟叶中的表达量显著高于嫩叶和根等其他组织;ClHSP90在成熟茎中的表达量最高。研究说明,ClHSP70和ClHSP90基因具有热激蛋白特征,参与了甘菊热胁迫应答过程,该研究结果为以后深入研究其基因功能奠定了基础。