siRNA分析nm23-H1基因与人慢性髓性白血病的关系

设计并筛选靶向nm23-H1基因的siRNAs序列,探讨nm23-H1基因与人慢性髓性白血病之间的关系。依据siRNA设计原则,设计3条siRNA序列。将不同靶点的siRNA用lipofectamine2000转染人慢性髓性白血病细胞株K562。转染后24h RTPCR检测nm23-H1mRNA水平变化;转染后48h免疫细胞化学法检测nm23-H1蛋白表达。MTT法检测转染后24h、48h和72h有效siRNA对K562细胞生长的影响。3条siRNA中,siNM526能有效地抑制K562细胞nm23-H1基因表达,转染siNM526的K56细胞生长受到抑制。说明下调nm23-H1基因的表达有抑制K562细胞增殖的作用,即降低了K562细胞的恶性程度。nm23-H基因有可能成为白血病治疗潜在的分子靶点。     

慢性髓性白血病K-562细胞的凋亡耐受

慢性髓性白血病（CML）K－562细胞株对与类别无关的多种凋亡诱导剂具有耐受性,表现为凋亡潜伏期延长,caspases激活延迟及其活性谱和亚细胞分布改变,电泳不易显示典型、清晰的DNA梯形条带。K－562细胞凋亡耐受机制复杂,Bcr-Abl上调ERK／MAPK通路,经尚未阐明的中间环节,抑制凋亡诱导剂引起的线粒体释放反应,导致caspase-3激活延迟,是其可能的机制。目前研究中的克服K－562细胞凋亡耐受、治疗CML的策略包括特异性酪氨酸激酶抑制剂等。     

蛋白酶体抑制剂MG132的浓度对人白血病细胞K562凋亡的影响

探讨蛋白酶体抑制剂MG132 在诱导人白血病K562细胞凋亡过程中作用.分别以不同浓度的蛋白酶体抑制剂MG132 处理人白血病细胞K562,通过MTT法检测K562细胞活力,应用Annexin Ⅴ和PI 双染的细胞流式法检测K562细胞凋亡率和细胞内活性氧(ROS) 水平,应用酶标仪法检测K562细胞内Caspase- 3活性变化的情况.结果表明,随着MG132浓度的增加,各个指标与对照组比较差异均有显著性(P<0.05):K562细胞增殖明显受到抑制;细胞凋亡率明显增加,且当MG132浓度为900 nmol/L时,细胞凋亡率达36.5 %;同时,ROS 水平和caspase- 3活性明显升高.因次,蛋白酶体抑制剂MG132可显著抑制人白血病细胞K562增殖并促进其凋亡.     

CDA基因沉默对人慢性髓系白血病细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨胞苷脱氨酶(CDA)基因沉默在治疗人慢性髓系白血病(CML)中的潜在价值。方法:通过RT-PCR和Western blot检测CML患者和造血干细胞移植供体的骨髓单个核细胞中的CDA表达。对CML KCL-22细胞系转染shRNA和过表达CDA的p BS/U6-Neo质粒来诱导CDA基因沉默或过表达。通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定和细胞集落形成实验评价细胞增殖,通过流式细胞仪检测细胞凋亡。此外,将0.2 m L不同处理的细胞悬浮液(106个细胞/m L)注射到裸鼠中建立裸鼠肿瘤异种移植模型。结果:与造血干细胞移植供体相比,CML患者的骨髓单个核细胞中的CDA m RNA和蛋白表达显著升高(P 0.05)。转染shRNA-CDA显著降低了KCL-22细胞的细胞活力和细胞集落数(P0.05)。与对照组(4.32%)相比,shRNA-CDA组(13.45%)的细胞凋亡率显著升高(P0.05)。与对照组相比,shRNA-CDA组的BCL-2蛋白表达水平显著降低,而cleaved caspase-3显著升高(P0.05)。与对照组相比,shRNA-CDA组的PI3K蛋白表达水平和Akt磷酸化水平显著降低(P0.05)。接种30 d后,与对照组相比,shRNA-CDA组裸鼠的肿瘤重量和肿瘤体积均显著降低(P0.05)。结论:CDA在人慢性髓系白血病中高表达,CDA基因沉默可在体内和体外抑制肿瘤细胞的生长。其机制与抑制PI3K/Akt信号通路的激活有关。     

天花粉蛋白诱发白血病细胞K562凋亡的研究

天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS),是一种从栝楼块根内提取的核糖体失活蛋白,具有流产、抗肿瘤和抗HIV等多种生物活性。本文利用FACS检测到天花粉蛋白可使K562白血病细胞产生明显的凋亡小峰、DNA区带电泳成典型的“梯状”条带,电镜检测可观察到明显的细胞凋亡形态。这些结果表明天花粉蛋白可以诱发K562白血病细胞产生凋亡。     

人参皂苷Rg1、Rb1和Re对人慢性粒细胞白血病细胞株K562增殖的影响

目前已发现30余种人参皂苷单体,不同的人参皂苷单体的药理作用及机制各异。本实验通过研究人参皂苷单体Rg1、Rb1和Re对K562细胞增殖的影响,探讨其抗肿瘤作用及机制。取对数生长期K562细胞,分为阴性对照组、不同浓度的Rg1组、Rb1组、Re组,培养24h、48h、72h,以噻唑蓝（MTT）比色法和台盼蓝活细胞计数法测定不同浓度的Rg1、Rb1、     

SHIP1在急性髓细胞白血病患者中的表达及对人白血病细胞凋亡的影响研究

目的:探讨含SH2结构域的肌醇1(SHIP1)在急性髓细胞白血病患者中的表达及对人白血病细胞凋亡的影响。方法:采用Western blot检测收集的急性髓细胞白血病患者骨髓中SHIP1的表达。人白血病细胞U937转染SHIP1过表达载体(pEGFP-SHIP1组)及对照空载体(pEGFP组),同时设置对照组,对照组细胞不转染载体,其他步骤同pEGFP-SHIP1组和pEGFP组。流式细胞仪检测48 h的细胞凋亡情况,Western blot检测48 h细胞中SHIP1、Bcl-2、Bax、Akt、p-Akt的表达。结果:急性髓细胞白血病患者骨髓中SHIP1表达明显低于正常人(P0.05)。pEGFP-SHIP1组细胞中SHIP1、Bax表达和凋亡率均明显高于pEGFP组及对照组(P0.01),Bcl-2、p-Akt表达均明显低于对照组(P0.01)。结论:SHIP1在急性髓细胞白血病患者骨髓中表达下调,其可能通过Akt信号促进人白血病细胞凋亡。     

敲低去泛素化酶USP13抑制K562细胞的增殖*

目的:研究去泛素化酶USP13对人慢性髓系白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响,并进行初步的机制探究。方法:构建pLKO.1-shUSP13-GFP慢病毒干涉载体,慢病毒包装后感染并建立稳定敲低USP13的K562细胞株。免疫印迹检测K562细胞中USP13蛋白的敲低效率。流式细胞术分析敲低USP13对K562细胞增殖和凋亡的影响。免疫共沉淀和蛋白质泛素化实验探究USP13调控K562细胞的分子机制。结果:成功构建pLKO.1-shUSP13-GFP慢病毒干涉载体,同时利用慢病毒体系获得稳定敲低USP13的K562细胞株。流式细胞术结果显示,敲低USP13促进K562细胞凋亡、抑制细胞增殖。分子机制研究发现,敲低USP13通过增强c-Myc泛素化进而导致其蛋白质水平降低。结论:初步揭示了USP13调控K562细胞增殖和凋亡的分子机制,为治疗慢性髓系白血病提供了潜在的靶点。     

ZnPcH1介导的光动力疗法对K562细胞的作用及其机制研究

探讨新型光敏剂ZnPcH1介导的光动力疗法对K562细胞的杀伤效应及其杀伤机制.应用MTT比色法检测光动力疗法对K562细胞增殖能力的影响;采用AO/EB荧光染色法、DNA片段化分析、TUNNEL、AnnexinV-FTTC/PI双染法等检测ZnPcH1-PDT诱导K562细胞的死亡方式;以RT-PCR法检测ZnPcH...     

三氧化二砷对K562/A02 细胞的凋亡及细胞周期的影响

目的:研究三氧化二砷对多药耐药急性白血病细胞株K562/A02凋亡与细胞周期的影响及可能机制。方法:取阿霉素(Adr)的耐药白血病细胞株分为未加药的对照组及加入不同浓度的三氧化二砷(其终浓度为4.0μmol/L、5.0μmol/L)组,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分布,Western blot方法检测不同浓度三氧化二砷对K562/A02细胞核NF-κBp65蛋白水平。结果:与对照组比较,三氧化二砷可显著增加Adr对K562/A02细胞凋亡率,阻滞细胞于G0/G1期,降低K562/A02细胞胞核中NF-kB p65的表达(P均<0.05)。结论:三氧化二砷可能是通过抑制NF-kB的胞内活化转位,从而促进K562/A02细胞凋亡及抑制细胞增殖。     

氯化高铁血红素诱导K562细胞红系分化对其细胞周期的影响

细胞周期的测量是细胞增殖动力学的研究基础。通过添加30μmol·L-1氯化高铁血红素(Hemin)诱导人慢性髓系白血病K562细胞红系分化,利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)与7-AAD双染的方法检测Hemin诱导的K562红系分化细胞对细胞周期各期比例的影响,未诱导的K562细胞周期各期比例作为对照,检测发现Hemin诱导的K562红系分化细胞对其细胞周期相对值无明显影响。应用BrdU间隔染色结合流式细胞术的方法,通过分析BrdU间隔染色后BrdU阳性细胞群的动态变化规律,从而推算出K562红系分化细胞的倍增时间及细胞周期各期时长。根据测量结果发现,未诱导的K562细胞总倍增时间约为20 h,与通过生长曲线公式法计算倍增时间的结果相符,Hemin诱导的K562细胞的细胞周期倍增时长约为23 h。Hemin诱导的K562红系分化细胞较未诱导的K562细胞倍增时间与各期时长无明显差异。因此,Hemin诱导K562细胞红系分化对其细胞周期绝对值及相对值均无明显影响。     

DADS 上调K562 细胞p21WAF1 表达对细胞生长阻抑和凋亡 的实验研究

目的:探讨二烯丙基二硫(DADS)对体外培养的人白血病细胞系K562细胞生长阻抑和凋亡作用及机制。方法:采用MTT分析法检测细胞活性、流式细胞术分析细胞周期及凋亡率、免疫组化检测p21WAF1基因表达。结果:1).DADS在10mg/L～80 mg/L范围内,对K562细胞的抑制作用呈剂量-时间依赖效应;2).不同浓度DADS作用于K562细胞24h后,细胞周期发生了变化:DADS可以将K562细胞阻滞于G2/M期;3).DADS浓度在10mg/L～80mg/L时作用K562细胞24h后,凋亡率逐渐升高,有显著的统计学意义(P<0.05或P<0.01);4).用浓度分别为0mg/L,20mg/L,40mg/L,80mg/L处理K562细胞24h后,p21WAF1蛋白表达上调,有统计学意义(P<0.05或P<0.01),溶媒组和阴性对照组无差别(P>0.05)。结论:DADS有抑制K562细胞增殖和促进K562细胞凋亡的作用。其作用的可能机制与上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21WAF1表达,从而诱使k562细胞阻滞于G2/M期有关。     

利用CRISPR/Cas9技术建立敲除JAK2基因K562细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9技术对K562细胞系JAK2基因进行编辑,构建JAK2基因敲除的K562细胞系。方法:使用CRISPR在线设计工具,针对JAK2基因设计sgRNA,构建Cas9-sgRNA共表达质粒。使用第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染K562细胞,提取细胞基因组DNA,Sanger测序和TA克隆检测基因编辑活性。无限稀释法将编辑阳性的细胞接种于96孔板并扩培得到单克隆细胞株,提取基因组DNA,Sanger测序和TA克隆分析敲除JAK2单克隆细胞的基因型。结果:成功构建靶向敲除JAK2基因的lentiCRISPRv2-sgRNA3-1质粒。优化方案得到低细胞毒性高转染效率的感染K562细胞慢病毒量。CRISPR/Cas9系统成功在JAK2基因sgRNA3-1识别位点发挥基因组编辑活性,获得纯合敲除JAK2基因细胞株K562-JAK2~(-/-)(两个等位分别发生移码突变,预期编码没有功能的JAK2蛋白)。结论:CRIAPR/Cas9系统通过慢病毒感染方式获得JAK2基因纯合敲除的K562细胞株,该细胞模型可用于研究在慢性髓系白血病中JAK2基因的作用,为构建K562敲除其他基因细胞系提供实验依据,为探究造血分化机制的研究奠定实验基础。     

DC-CIK对K562/A多药耐药基因mdr1表达的影响

目的：体外观察树突状细胞（dendritic cell,DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine inducedkiller,CIK）对K562/A细胞株多药耐药基因mdr1表达的影响。方法：采集健康人的外周血,分离出单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,在体外加入多种细胞因子经诱导生成DC及CIK细胞,以流式细胞仪检测其表面标志,将DC细胞内加入K562/A细胞裂解物致敏后,再与CIK细胞混合培养48小时。将致敏后的DC-CIK细胞与K562/A及K562分组培养后以荧光定量PCR检测其mdr1基因表达的情况,PBMC作为对照组。结果：RT-PCR中可见K562/A＋DC-CIK组中mdr1 mRNA表达较K562/A明显降低,经荧光定量PCR观察到K562/A内mdr1 mRNA表达为K562的10.27倍、K562/A/PBMC略低于未处理的K562/A（P〉0.05）,K562/A/DC-CIK细胞中mdr1 mRNA含量较K562/A、K562/A/PBMC少（P〈0.05）。DC-CIK细胞与细胞株混合培养后,mdr1基因表达较混合培养前明显降低。结论：实验数据显示DC-CIK可使耐药细胞株内mdr1基因表达下调。但K562与DC-CIK混合培养后该基因降低不明显,提示该基因在细胞中存在着基础表达,意义在于维持细胞内稳态。目前针对逆转白血病耐药的研究较少,需要多进行相关研究以拓宽细胞免疫治疗在逆转耐药领域的应用。DC-CIK是具有发展潜力的抗肿瘤方法。本实验将为下一阶段研究逆转耐药的机制提供依据,DC-CIK细胞免疫疗法有望成为逆转肿瘤耐药的新方法。     

二烯丙基二硫上调Beclin1介导白血病K562细胞自噬性死亡的研究

目的：通过二烯丙基二硫诱导白血病K562细胞发生自噬性死亡,探讨其作用机制。方法：40 mg/LDADS作用K562细胞12小时后,透射电镜观察K562细胞超微结构,MDC染色荧光显微镜观察自噬泡及流式细胞仪定量检测自噬率,RT-PCR检测Beclin1mRNA的表达水平。结果：DADS作用后的K562细胞后,透射电镜可观察到胞质内出现大量自噬体;MDC染色荧光显微镜观察显示,K562细胞胞浆中的自噬泡明显增多,而空白组与溶媒组胞浆中的自噬泡很少;流式细胞术定量测定空白对照组、溶媒对照组、DADS药物组自噬率分别为（7.27±5.60）%、（7.10±5.13）%、（27.39±6.51）%（P〈0.05）;空白对照组为0.658±0.007,溶媒对照组为0.671±0.012,两者的Beclin1mRNA的表达强度无明显差异（P〉0.05）,DADS药物组为0.911±0.008,高于对照组（P〈0.05）。结论：二烯丙基二硫可诱导白血病k562细胞发生自噬性死亡,其机制可能与Beclin1的上调有关。     

二烯丙基二硫上调Beclin1 介导白血病K562 细胞自噬性死亡的研究

目的：通过二烯丙基二硫诱导白血病K562 细胞发生自噬性死亡,探讨其作用机制。方法：40 mg/LDADS 作用K562 细胞12 小时后,透射电镜观察K562 细胞超微结构,MDC 染色荧光显微镜观察自噬泡及流式细胞仪定量检测自噬率,RT-PCR 检测Beclin1mRNA 的表达水平。结果：DADS 作用后的K562 细胞后,透射电镜可观察到胞质内出现大量自噬体;MDC染色荧光显微镜观 察显示,K562 细胞胞浆中的自噬泡明显增多,而空白组与溶媒组胞浆中的自噬泡很少;流式细胞术定量测定空白对照组、溶媒对 照组、DADS药物组自噬率分别为(7.27± 5.60)%、(7.10± 5.13)%、(27.39± 6.51)%（P<0.05）;空白对照组为0.658± 0.007,溶媒对 照组为0.671± 0.012,两者的Beclin1mRNA 的表达强度无明显差异（P>0.05）,DADS 药物组为0.911± 0.008,高于对照组（P<0. 05）。结论：二烯丙基二硫可诱导白血病k562 细胞发生自噬性死亡,其机制可能与Beclin1 的上调有关。     

基于CRISPR/Cas9技术AEG-1基因敲除神经细胞系的构建及AEG-1基因敲除介导的神经细胞周期阻滞和细胞凋亡抑制

星形胶质细胞上调基因-1(AEG-1)是近年来研究较多的癌基因,但在神经系统疾病方面研究尚少。AEG-1与神经退行性疾病有关,然而其具体作用机制尚不明确。本研究通过设计靶向AEG-1 sgRNA序列并合成相应寡核苷酸,将其克隆到GV392质粒中,构建sgRNA/Cas9二合一表达载体,并进行慢病毒包装纯化。用慢病毒感染小鼠海马神经元HT22细胞,进行药物筛选和sgRNA活性鉴定,建立稳定的AEG-1基因敲除的细胞系;并进一步观察神经元HT22细胞的增殖与凋亡能力。结果显示,成功构建了3种靶向AEG-1基因的sgRNA/Cas9二合一表达载体。所设计的sgRNA的插入序列和开放阅读框架完全正确,成功建立了AEG-1基因敲除的稳转神经细胞系。进一步研究表明,AEG-1敲除后的神经HT22细胞与正常神经HT22细胞相比,细胞突起数目减少, 细胞周期阻滞,细胞凋亡率减少。以上结果为后续进一步研究AEG-1与神经系统疾病关系奠定了基础。     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导K562和HeLa细胞凋亡程度存在明显差异

蛋白酶体抑制剂MG132诱导人白血病细胞K562和宫颈癌细胞HeLa凋亡,用3个不同浓度的蛋白酶体抑制剂MG132处理人白血病细胞K562和宫颈癌细胞HeLa,通过MTT检测、annexin Ⅴ/ PI 双染法、流式细胞术、酶标仪和Western 印迹分别检测MG132对K562细胞和HeLa细胞的生长效应、细胞凋亡率、细胞内活性氧(ROS)水平和caspase-3活性变化的影响.蛋白酶体抑制剂MG132诱导K562细胞凋亡明显,对HeLa细胞诱导凋亡不明显.结果表明,蛋白酶体抑制剂MG132特异性诱导不同肿瘤细胞凋亡的程度存在明显差异.     

用限制性cDNA文库制作K562细胞基因表达谱芯片探针

以人红白血病K562细胞为材料,应用限制性显示PCR（RD-PCR）技术构建cDNA文库,该文库通过PCR引物3′端延伸两个不同碱基形成136对引物对cDNA进行限制性扩增,得到136组不同的PCR扩增产物,纯化后与载体连接并转化细菌,即为限制性cDNA文库,根据不同的分组进行克隆的鉴定和分离。并进行大量扩增制备cDNA芯片探针,该方法构建的文库因经过了限制性分组扩增,每组均含有特定的cDNA,因而大大加快了随后克隆的分离 和鉴定的速度,为基因芯片探针制备提供了一个新方法。