水稻种子特异表达OsEm基因5'上游调控区的克隆与序列分析

植物分子农场能以低成本大规模生产重组医药蛋白,种子是重组蛋白最理想的积累场所。为了获得分子医药种子特异表达启动子,以取材方便的地方栽培水稻为材料克隆了种子特异Os Em基因767 bp的5'端调控序列。顺式作用元件分析的结果发现5'端调控序列含有50 bp的核心启动子区域和保守的调控元件TATA box及CAAT box,还含有脱落酸和茉莉酸甲酯等激素响应元件、光反应元件、缺氧特异诱导元件以及种子特异性元件。进一步分析发现本研究克隆的序列内部有15 bp的核苷酸缺失,它与Gen Bank收录的野生型水稻Os Em基因5'端调控序列之间的序列相似性为98.08%。上述结果揭示不同来源的Os Em基因5'端调控序列具有序列多样性,它们能够参与激素、光和逆境胁迫防御等反应,可作为植物分子农场种子特异性启动子。     

OsEBP-89启动子中应答茉莉素信号的必需DNA区域的分析

水稻OsEBP-89基因的表达受乙烯（ET）、脱落酸（ABA）、茉莉素等激素和干旱、低温等逆境胁迫处理的诱导．本研究中,克隆该基因启动子和预测应答胁迫与激素信号相关顺式作用元件的基础上,通过农杆菌注射法介导的瞬时表达证实了该启动子在烟草叶片中驱动GUS报告基因的表达受茉莉素的诱导．为了进-步确定该启动子中应答茉莉素信号的重要DNA区域,对该启动子进行了-系列的缺失突变,并将相关的缺失启动子片段与GUS报告基因融合．烟草叶片中GUS报告基因瞬时表达分析表明,该启动子中位于-1200bp和-800bp的碱基是该基因应答茉莉素信号的必需DNA区域,其中在-1127bp处有一个G—box元件;结合已有的研究结果,发现应答茉莉素信号的必需DNA区域不同于该基因应答ACC处理的必需DNA区域（在-562bp处存在一个ERE元件）．总之,本研究结果有助于探讨该基因应答不同胁迫信号表达的分子机制．     

白桦BpPIN5基因启动子组织定位及外源激素应答分析

PIN家族蛋白作为IAA的极性输出载体,在植物胚胎发育、器官发育和向性生长,尤其是植物叶序、叶脉的形成及维管组织分化过程中起关键作用。为了明确白桦（Betula platyphylla）BpPIN5基因对外源激素的应答特性,实验以白桦全基因组DNA为参考,克隆获得BpPIN5基因的上游1 447 bp启动子序列,采用PLACE在线软件对该序列含有的顺式作用元件进行预测,结果表明,BpPIN5启动子序列含有生长素（IAA）、赤霉素（GA）、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯（ET）等不同类型的生长素响应元件。实验构建了pro-BpPIN5：：GUS载体进行白桦转基因,GUS组化染色分析显示,BpPIN5启动子在白桦叶裂顶端、细叶脉及根中有转录活性。分别用IAA、GA、MeJA、SA及ABA激素处理转基因白桦,结果显示,BpPIN5启动子对上述5种激素在白桦第1叶片的裂叶边缘、第2叶的叶柄及根组织部位均有应答,且响应变化基本一致。研究结果为揭示白桦BpPIN5基因功能提供参考。     

白桦APETALA2基因启动子的克隆及其表达分析

APETALA2（AP2）转录因子亚家族普遍存在于植物中,参与植株的生长发育、胁迫应答和多种生理生化反应的信号传导。本研究从白桦（Betula platyphylla Suk.）基因组中克隆了AP2基因2 308 bp的启动子序列,生物信息学分析发现,该序列除具有TATA-box和CAAT box等高等植物普遍具有的保守元件外,还具有大量光响应元件和激素响应元件,如响应赤霉素、脱落酸、茉莉酸甲酯等的元件。将白桦AP2基因启动子克隆至pBI121-35S：：GUS植物表达载体中,命名为pBI121-proAP2：：GUS,用农杆菌介导法侵染白桦和拟南芥,并进行GUS染色分析,结果表明AP2基因启动子驱动下的GUS报告基因在整个拟南芥中都表达,在白桦的营养器官和雌花种翅及花柄中也有表达,说明其具有启动活性,可能参与该器官的发育。     

水稻OsGSTL1启动子的分离和表达分析

从水稻基因组文库中筛选得到一个水稻GST基因,命名为OsGSTL1.半定量RT-PCR分析表明OsGSTL1基因的表达不受绿磺隆、乙烯利、脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯的诱导,因此该基因可能与植物抗逆性无关.为了研究OsGSTL1启动子在植物体内的表达特性,将OsGSTL1起始位点5＇端上游不同长度的调控序列与报告基因GUS融合,并在洋葱表皮瞬间表达和拟南芥中稳定表达.研究表明：在洋葱表皮细胞中,160bp及更长的上游调控序列均能启动GUS基因的表达;而在转基因拟南芥中,含有2155 bp的上游序列的PGZ2.1：：GUS具有时空表达的特性,在转基因的早期幼苗中GUS基因在子叶中特异性表达,但在根中没有表达;而在幼苗生长的后期,根、茎、叶中都有少量的表达.但包含1 224 bp的上游序列的PGZ1.2：：GUS却表现为组成型表达的特性.由此推测,OsGSTL1启动子启动的基因表达可能与幼苗的营养代谢相关;而OsGSTL1启动子的时空表达相关元件可能位于OsGSTL1翻译起始位点5＇端上游-2155 bp至-1224 bp范围内.     

西瓜APX基因的序列分析及其茉莉酸甲酯诱导表达特性

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)作为植物抗氧化防御系统中的重要一员,在一定程度上决定着植物的抗逆性。茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)作为逆境信号物质可以诱导植物抗逆响应,但是能否诱导APX基因表达、其表达趋势如何到目前为止尚未见报道。我们根据拟南芥APX同源基因At APXIII(AJ006030.1)的序列在西瓜基因组数据库中搜索获得一个高度同源序列:Cla015833,命名为Cl APX1。我们对该基因进行了生物信息学分析并以二倍体西瓜细胞为材料,利用q RT-PCR技术对Cl APX1在茉莉酸甲酯诱导下的表达特性进行了研究。结果表明Cl APX1基因的转录起始位点位于起始密码子上游980 bp处,启动子区域包含典型启动子必须的调控元件,多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件等;该基因编码的蛋白含有286个氨基酸,分子量为31.56 k D,理论等电点为6.67,此蛋白可能定位在细胞质中,属于c APX;该基因在亲缘关系上较为接近同科的黄瓜和甜瓜。在茉莉酸甲酯施加了0.5 h后Cl APX1基因的表达量高于本底水平,一直持续到8 h,变化呈现出先上升后下降的趋势。本研究说明了Cl APX1基因对茉莉酸甲酯模拟的逆境信号做出了响应且表达量提高。本研究为利用茉莉酸甲酯提高植物抗逆性提供了理论支持,为植物的APX基因对茉莉酸信号响应方式和表达调控趋势做了补充,为以后深入研究APX基因奠定基础。     

苹果果实β-半乳糖苷酶基因启动子的克隆与功能分析

根据已发表的苹果基因组序列设计特异引物,克隆得到苹果品种‘嘎拉’中β-半乳糖苷酶基因(Md-gal)的启动子。序列分析表明,该启动子除含有大多数高等植物启动子具有的保守元件外,还含有大量光响应元件和与激素相关的顺式作用元件,主要有赤霉素响应元件(GARE-motif和P-box)、茉莉酸甲酯(MeJA)应答元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)和生长素响应元件(TGA-element);构建5个不同长度Md-gal启动子和GUS基因融合的瞬时表达载体,并进行苹果果实和烟草叶片转化试验,结果显示,5个启动子均具有启动子活性,在Md-gal启动子序列中激活与抑制调节元件并存,正调控元件位于-1206~-754bp区域,负调控元件位于-754~-597bp区域;对Md-gal启动子进行激素响应分析结果显示,激素处理可对其产生诱导作用,且MeJA处理后GUS活性最高。研究表明,Md-gal启动子具有真核基因启动子的基本结构特征和正负调控特性,可响应外源激素处理,可能在苹果果实生长发育和成熟软化方面具有一定的作用。     

普通野生稻根特异启动子的克隆与鉴定

通过普通野生稻转录组文库筛选到一个普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)根特异表达基因,并克隆启动子序列,命名为Or RSGp,长度为896 bp,含有CAAT-box、TATA-box等主要功能元件,还有参与茉莉酸甲酯反应的响应元件,以及抗旱、抗逆等响应元件。将其与gus报告基因融合转化拟南芥,GUS组织化学染色与定量分析结果表明,Or RSGp调控gus基因在根部特异表达。     

小麦冰重结晶抑制蛋白基因TaIRI5的克隆及分析

为了明确小麦冰重结晶抑制蛋白基因(TaIRI5)在小麦生长发育过程中的作用,该研究以小麦品种‘北京841’为材料,利用RT-PCR方法克隆TaIRI5基因,并对该基因进行生物信息学分析、组织特异性表达分析、启动子活性分析以及亚细胞定位分析。结果显示:(1)成功克隆到TaIRI5基因,该基因全长1203 bp,开放阅读框为858 bp,编码285个氨基酸,蛋白质分子量为70.7 kD,等电点为5.07,属于疏水性蛋白。(2)实时荧光定量PCR结果显示,TaIRI5基因在小麦的根、茎、叶片、雌蕊、雄蕊、护颖、种子中均有表达,其中根部的相对表达量最高,在雌蕊中表达量最低,表明该基因在小麦的生长发育过程中起重要作用。(3)TaIRI5基因的启动子分析表明,该区域除CAAT-box和TATA-box启动子核心元件外,该序列还包含9个光响应元件和6个激素应答元件及其他元件;利用TaIRI5基因不同长度(498 bp、999 bp、1500 bp)的3个候选启动子,构建了含有GUS基因的pCAMBIA1301融合表达载体;烟草转化实验表明,3个候选启动子都能启动该基因的表达,但表达模式略有差异。(4)成功构建含有GFP基因的融合载体pCAMBIA1300-TaIRI5-GFP,亚细胞定位结果显示,TaIRI5定位于细胞膜上。该研究结果为进一步研究小麦TaIRI5基因功能奠定了基础。     

海南龙血树WD40转录因子基因DcWD40-1的克隆和表达分析

海南龙血树是国产血竭的主要基源植物,其血竭主要化学成分为类黄酮化合物。为进一步了解DcWD40-1在类黄酮生物合成中的潜在功能和作用机制,该研究根据海南龙血树转录组数据,利用RT-PCR技术在海南龙血树中克隆了一个WD40基因DcWD40-1,该基因全长1 550 bp,包含一个1 353 bp的开放阅读框,编码450个氨基酸,蛋白质分子量50.77 kD,理论等电点5.71。生物信息学分析显示,DcWD40-1属于WD40蛋白家族成员,具有5个保守的WD40结构域,和其他植物WD40蛋白同源性高,保守性强。利用Genome Walking方法分离了1 503 bp的DcWD40-1启动子序列,该区域具有典型真核生物启动子结构特征,并含有多个应答激素和胁迫的响应元件。表达分析显示,血竭诱导剂能够诱导Dc WD40-1的表达,DcWD40-1的变化与血竭形成及类黄酮积累正相关。此外,DcWD40-1也能对茉莉酸甲酯、细胞分裂素、油菜素内酯和UV-B处理做出积极响应。     

核桃WD40转录因子JrATG18a基因的克隆及逆境响应

WD40转录因子在植物逆境响应中具有重要作用。本研究克隆获得核桃的一条WD40家族的自噬相关蛋白(Autophagy-related protein)18a基因(JrATG18a),通过生物信息学和基因表达技术,分析不同非生物及植物激素处理下JrATG18a基因的表达规律,预测JrATG18a的基本生物功能。结果显示,JrATG18a的开放阅读框(ORF)为1371 bp,编码蛋白含456个氨基酸,分子量为50.746 k D,理论等电点为5.97。与草莓、苹果、碧桃等具有较近的进化关系。其启动子含有热激响应(HSE)、低温胁迫(LTR)、水杨酸(SA)响应等相关元件。表达分析发现JrATG18a基因在热、寒、旱、SA、茉莉酸甲酯(Me JA)、脱落酸(ABA)处理下能被不同程度的诱导,且体现出根和叶的表达差异。这些结果表明,JrATG18a基因能响应逆境参与核桃适应不良环境,可作为核桃抗逆分子育种的重要候选基因。     

刺五加鲨烯环氧酶基因DNA和启动子的克隆与分析

本研究以刺五加鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因的c DNA序列为基础设计特异性引物,利用PCR和TAIL-PCR扩增SE DNA的全长序列,结合Plant CARE等软件,对启动子中的作用元件进行生物信息学分析。克隆得到长6 307 bp的刺五加SE DNA和启动子序列,包含8段外显子、7段内含子及两端的非翻译区,编码554个氨基酸;上游启动子序列长1 907 bp,含36个TATA-box,27个CAAT-box,此外还有茉莉酸甲酯调控元件、脱落酸调控元件以及光调控元件等多种顺势作用元件,表明SE基因表达受植物激素、光照以及温度等多种因素的调控。     

铁皮石斛异胡豆苷合成酶基因STR序列结构及表达模式分析

异胡豆苷合成酶基因STR编码吲哚类生物碱合成的关键酶异胡豆苷合成酶,并参与植物抗逆和花粉发育等生物过程。本研究通过对铁皮石斛异胡豆苷合成酶基因DoSTR的结构及特异性表达进行分析,探究其在铁皮石斛生长发育中的潜在功能。从铁皮石斛基因组数据中获得铁皮石斛异胡豆苷合成酶编码序列(DoSTRs),利用ClustalW软件进行氨基酸序列的比对,利用Gene Structure Display Server 2. 0在线软件分析基因内含子和外显子结构,利用PlantCARE数据库分析基因启动子区元件;基于转录组数据和qRT-PCR对铁皮石斛根茎叶组织、共生与非共生生长的种子和根、冷诱导和茉莉酸甲酯诱导后叶片中的STR家族基因的表达情况进行检测和分析,从铁皮石斛基因组中预测获得10个STR成员,具有典型的"Str_synth"结构域,且启动子区存在大量顺式作用元件,涉及到茉莉酸甲酯响应和低温响应等多个生物学过程;DoSTRs基因家族不同成员表达模式存在较大差异,DoSTR3、DoSTR7、DoSTR10在叶片中的表达量高于茎和根中,DoSTR9和DoSTR2在铁皮石斛种子萌发时显著高表达,DoSTR5和DoSTR10在茉莉酸甲酯处理早期,具有明显的上调表达趋势,推测STR家族可能参与不同的生物学过程,研究结果为深入探究铁皮石斛STR家族基因奠定了基础。     

丹参转录因子SmMYB7的克隆及表达模式分析

分析丹参转录组数据库(SRX021907),得到一条R2R3-MYB基因,blast比对发现该基因为丹参Sm MYB7(KF059361.1)。分别从g DNA和c DNA水平克隆该基因全长,测序结果表明该基因与公布序列一致,分析发现该基因无内含子序列,包含一个长为954 bp的开放读码框(ORF),编码317个氨基酸残基。多重序列比对和系统进化树分析显示Sm MYB7蛋白与拟南芥At MYB73同属R2R3-MYB第22个亚家族。已有丹参基因信息结合BD walking获得1 974 bp的启动子序列,分析结果表明多种顺式作用元件存在于该基因的启动子区。实时荧光定量PCR分析显示,该基因的表达为组成型,在丹参根、茎、叶、花中都表达;随着花的发育,该基因的表达量逐渐增加;此外,Sm MYB7在盐胁迫、水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸处理下表达均上调,推测该基因参与调控植物防御和花的发育。     

水稻OsHAK26启动子的克隆及瞬时表达分析

对水稻KT/HAK/KUP钾离子转运蛋白家族OsHAK26起始密码子上游2 064bp序列进行分析,发现该序列除了具备TATA-Box、CAAT-Box等基本启动子元件外,还含有许多发育、激素、非生物胁迫等响应元件以及KT/HAK/KUP家族启动子普遍存在的元件。用该片段及5'端缺失的-1 473bp、-963bp、-441bp、-193bp四个片段分别取代植物瞬时表达载体pBI-221的CaMV35S启动子区域,并利用拟南芥叶肉原生质体进行瞬时表达分析。结果表明,这五种片段都具有一定的启动活性,随着长度减小,活性下降,但缺失-963bp~-441bp之间的片段却导致活性显著回升,推断该区段含有抑制元件,缺失-441bp~-193bp之间的片段导致活性大幅下降,推断-441bp~-193bp为OsHAK26基因启动子的核心启动区域。     

miR156调控菊花逆境响应与开花的表达特性研究

为明确菊花miR156及其靶基因CmSPL13在逆境胁迫应答和生长发育中的表达特性,该研究以菊花‘神马’为材料,采用高保真PCR技术扩增MiR156启动子序列,并分析该序列特性;通过激素(茉莉酸甲酯、水杨酸甲酯、生长素类似物NAA)和逆境胁迫(干旱、盐)处理,分析菊花miR156及其靶基因CmSPL13对激素和逆境胁迫的响应表达特征;并分析蔗糖处理下miR156表达特性与开花时间的关系,为miR156参与菊花生长发育与逆境响应的分子机制研究奠定基础。结果表明：(1)克隆获得了MiR156启动子1 584 bp,该启动子序列包含激素(茉莉酸、水杨酸和生长素)应答、厌氧和干旱诱导等逆境胁迫以及光响应等顺式作用元件。(2)茉莉酸甲酯处理下,miR156的表达水平在0～3 h显著上调,3 h后逐渐下降,呈现出先上升后下降的趋势,而其靶基因CmSPL13的表达量呈先下降后上升的趋势,在12 h达到峰值;水杨酸甲酯和生长素NAA处理下,miR156的表达在3 h显著下调,而后逐渐升高,在6～12 h时达到峰值,而后又逐渐下降,但CmSPL13的表达具有与之相反的趋势;PEG处理下,miR156的表...     

Pib启动子中茉莉酸和乙烯响应元件的转基因分析

水稻Pib基因的表达受茉莉酸、乙烯等激素诱导, 为了确定该基因启动子响应茉莉酸和乙烯诱导的必需区域, 进一步阐明茉莉酸和乙烯响应分子元件, 文章用PCR制备了Pib全长启动子-3 572~2 bp及3个5′端有不同长度缺失的Pib启动子片段-2 692~2 bp、-1 335~2 bp、-761~2 bp。4个不同长度Pib启动子分别置换掉双元质粒中gus基因上游的35S构建为重组质粒, 经农杆菌介导转入水稻获得转基因植株。转基因水稻中gus活性的蛋白质水平和mRNA水平的定性和定量分析结果表明, 全长Pib启动子(-3 572~2 bp, pNAR901)启动活性最强, 茉莉酸或乙烯诱导6 h后, 其驱动gus基因在转基因植株各部组织中的表达量明显上升。而-3 572~-2 692 bp区段序列缺失后不但Pib启动子启动活性显著降低而且也丧失了对茉莉酸和乙烯的诱导活性。pNAR902(-2 692~2 bp),pNAR903(-1 335~2 bp)和pNAR904(-761~2 bp)中的Pib启动子序列的缺失长度相差达2倍和3倍以上, 但其对茉莉酸和乙烯的诱导响应没有区别。这些结果显示3个Pib启动子缺失体构建中, 其共同缺失序列即-3 572~-2 692 bp区域是Pib启动子茉莉酸和乙烯诱导响应的必需区域。软件检索证实, Pib启动子序列中只在上述共同缺失区段之内的-2 722 bp处有一个GCCGCC基序。文章报道的转基因实验表明GCCGCC基序可能是Pib基因中有关茉莉酸和乙烯诱导响应的顺式分子元件。     

白桦BpPIN3基因启动子序列及应答特性分析

PIN蛋白家族作为植物中重要的生长素外排载体家族,在植物生长和发育过程中表现出广泛的生理效应。为了进一步了解BpPIN3的功能,探究其在白桦（Betula platyphylla）发育过程中及其对不同激素信号和非生物胁迫的响应,采用生物信息学方法分析白桦BpPIN3启动子序列。以1年生和2年生白桦无性系苗木的根、茎、叶和顶芽为材料进行组织部位表达模式分析。以白桦幼苗为材料,用100 μmol·L^-1生长素（IAA）、100 μmol·L^-1赤霉素（GA₃）、200 μmol·L^-1脱落酸（ABA）和长光照条件下分别进行激素诱导和光胁迫处理,并取激素处理后0、2、4、8、16、24、48 h以及光胁迫后0、1、3、6,12、24、48、72 h时的白桦叶片和根提取RNA,利用qRT-PCR技术分析BpPIN3基因的表达情况。结果显示：BpPIN3启动子序列包含赤霉素、脱落酸、茉莉酸甲酯等不同类型的生长素响应元件,以及多个与逆境相关的顺式调控元件。BpPIN3在不同生长年份白桦的多个组织部位都有表达,尤其在叶片中表达量较高,并且所有组织部位中BpPIN3第二年的表达量均高于第一年。BpPIN3基因在不同处理条件下,不同部位间的相对表达量的变化存在一定差异,IAA及GA能够诱导白桦叶片组织细胞中的BpPIN3上调表达;而在ABA处理下除16、48 h外,BpPIN3基因表现出与IAA处理下相反的表达模式。在根组织中,IAA、GA₃及ABA均能诱导BpPIN3的表达。在叶片组织中,遮光胁迫诱导了BpPIN3基因的表达;在根组织中,随着处理时间的推移,12 h开始BpPIN3基因的相对表达量均显著高于对照（0 h）。根据试验结果,推测BpPIN3基因在白桦生长发育过程,以及IAA、GA₃和ABA信号转导途径和植物光响应过程中发挥重要调控作用。     

小麦TaLhca基因的克隆及表达分析

为了从分子水分研究小麦的光合作用,该研究采用RT-PCR方法,从小麦品种‘百农207’的叶中克隆到1个捕光叶绿素a/b结合蛋白基因,命名为TaLhca。序列分析结果表明,TaLhca的编码区序列(coding DNA sequence,CDS)长810 bp,编码269个氨基酸,推测分子量为29.31 kD,等电点为8.69。TaLhca被定位于叶绿体,无信号肽,存在3个明显的跨膜区域,预测其蛋白结构含有典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域(chlorophyll a/b binding domain),为亲水性非分泌蛋白。蛋白序列比对和进化树分析表明,小麦与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)和水稻(Oryza sativa)中的Lhca序列相似性最高,亲缘关系最近。启动子顺式作用元件预测表明,启动子区域包含多个光响应元件及逆境响应元件。实时荧光定量PCR分析表明,TaLhca基因在小麦根、茎、叶中均有表达。其中在叶中表达量最高,在根中表达量最低,且受NaCl、干旱、ABA、H2O2和低温胁迫表达增强,受黑暗胁迫表达降低。该研究结果为进一步解析小麦光合作用机理及其相关基因的诱导表达特性提供了依据。     

扩展蛋白与激素调控的生长发育

扩展蛋白是一类具有细胞壁松弛功能的蛋白质,它不仅能调节细胞壁的松弛和伸张,而且在调控植物的生长发育以及逆境响应过程中具有重要的作用。扩展蛋白作为激素调节因子能够对多种激素产生响应,从而调节植物的生长发育:扩展蛋白参与了乙烯调节的植物生长发育过程;改变植物内源的生长素水平或用外源生长素进行处理同样影响扩展蛋白基因的表达;扩展蛋白可能参与赤霉素和脱落酸调节的生长发育和逆境响应过程;此外,施加外源的茉莉酸甲酯、油菜素内酯和细胞分裂素也会影响扩展蛋白基因的表达水平。本文综述了扩展蛋白在激素介导的植物生长发育方面的最新研究进展,以期为研究者更直观便捷的了解该方面现状提供依据。