转录因子PaPho与丝状真菌Podospora anserina中磷元素的吸收和利用研究

作为生物体必需的营养元素之一,磷在物质代谢、信号传导和能量储存中起着关键作用。【目的】研究丝状真菌Podospora anserina中调控磷酸盐代谢相关转录因子的作用,可进一步阐明真核微生物中磷元素吸收的调控机制。【方法】利用同源重组的方法定点敲除P.anserina中2个磷代谢相关转录因子PaPho1和PaPho2,遗传杂交构建双重突变体ΔPaPho1ΔPaPho2;通过表型分析、无机磷含量测定和酸性磷酸酶活性测定分析各突变菌株的变化;利用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析磷代谢相关基因的表达情况。【结果】在无机磷作为唯一磷来源的培养基上,ΔPaPho1ΔPaPho2无法生长;在添加有机磷的培养基中,ΔPaPho1ΔPaPho2和野生型菌株生长无显著性差异。在同时添加有机磷和无机磷的培养基中,ΔPaPho1ΔPaPho2的无机磷含量和酸性磷酸酶活性比野生型菌株的分别下降了25.0%和61.9%,ΔPaPho1ΔPaPho2中无机磷酸盐转运蛋白基因的表达水平显著降低。【结论】在P...     

来源于真菌AA9家族裂解性多糖单加氧酶的研究进展

AA9家族的裂解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO)广泛存在于真菌中,由于其能作用于木质纤维素的结晶多糖,从而使其在生物转化生物质方面发挥重要的作用。本文首先综述了AA9家族LPMO的结构特点、催化机制、结构与功能之间的关系,其次阐述了AA9家族LPMO的微生物表达与调控,最后简单介绍了AA9家族LPMO在转化木质纤维素中的应用。     

丝状真菌Podospora anserina中光敏色素基因的鉴定及功能分析

光敏色素在细菌和植物发育中起着关键作用,但它们在真菌中的生物学功能尚不完全清楚。【目的】探究光敏色素基因PaPhy1和PaPhy2在Podospora anserina有性生殖和无性发育中的作用及其调控机制。【方法】利用同源重组方法对P.anserina中2个光敏色素基因PaPhy1和PaPhy2进行定点敲除,获得光敏色素基因缺失菌株ΔPaPhy1和ΔPaPhy2,并通过遗传杂交构建双重突变体ΔPaPhy1ΔPaPhy2;分析突变型菌株和野生型菌株在不同光照下有性生殖、无性发育、生长速率和活性氧代谢等方面的差异,明确光敏色素基因在P.anserina中的主要功能。【结果】白光和蓝光诱导P.anserina子实体的形成,ΔPaPhy在光照下产生子实体的数量减少,ΔPaPhy的生命周期延长。【结论】光敏色素基因与P.anserina有性生殖密切相关;ΔPaPhy的衰老延迟和活性氧代谢有关。本研究的结果为进一步探索光照对丝状真菌繁殖调控机制以及抗衰老研究提供了新的思路。     

溶解性多糖单加氧酶的研究进展

木质纤维素是地球上储藏量最为丰富的可再生生物资源。将木质纤维素酶解成寡糖或单糖是生物质利用的关键。然而,传统的糖苷水解酶很难对其进行有效降解。溶解性多糖单加氧酶是一种全新的生物质降解酶,丰富了生物质降解的模式。它以氧化方式作用于糖链,产生更多的还原端以便糖苷水解酶能进一步进行催化。本文综述了LPMO的发现历史、分类、作用机制与活性测定方法,并讨论了LPMO在饲料添加剂、功能性食品与生物能源等领域的应用前景。     

中华根瘤菌NP1氨单加氧酶基因的克隆与功能鉴定

以中华根瘤菌NP1(Sinorhizobium sp.NP1)为原始菌株,通过同源克隆与Tail-PCR方法,获得1089bp的氨单加氧酶基因(amo)全长序列.该基因编码362个氨基酸,其二级结构与Sinorhizobium meliloti1021AMO的二级结构相似,该蛋白有9个跨膜区段.以自杀穿梭质粒pJQ200SK为原始载体,构建NP1amo基因敲除质粒pJQ200SK-amo-Tc.采用三亲本杂交的方法将该质粒转入原始菌株NP1中,获得amo基因敲除菌株NP1∷amo.通过本贝洛氏(Berthelot)法对氨氮进行测定,发现NP1∷amo的脱氮效率比原始菌株NP1下降约35%.该结果表明,本实验中所克隆的氨单加氧酶基因为脱氮关键酶基因.     

一种几丁质裂解性多糖单加氧酶的活性评价及稳定性研究

【目的】裂解性多糖单加氧酶(LPMO)是一类铜离子依赖型的单加氧酶,能够通过氧化的方式断裂糖苷键,进而显著提高多糖的降解效率,受到广泛的关注。但是LPMO单加氧酶的性质使其容易被自身氧化而失活,且底物的聚合性质和释放产物的多样性使得对LPMO催化过程活性的评估变得十分困难。【方法】本研究以2,6-二甲氧基苯酚(2,6-DMP)和H2O2为底物,建立了测定几丁质裂解性多糖单加氧酶(BtLPMO10A)活性的评价体系,并研究该酶在降解几丁质底物过程中的稳定性。【结果】研究发现,在测定BtLPMO10A活性的过程中,较高的酶浓度,过氧化氢浓度和2,6-DMP浓度均使得反应过程脱离了线性范围,而抗坏血酸的加入能够提高灵敏度,但是对活性测定过程有较大影响。BtLPMO10A对2,6-DMP和H2O2的Km分别为0.53mmol/L和5.31 mmol/L,亲和性高于纤维素裂解活性的NcLPMO9C。BtLPMO10A在还原剂抗坏血酸存在的条件下容易失活,但底物几丁质的加入能够一定程度上稳定LPMO的活性,但是其在降解几丁质过程中活性依然会下降。【结论】本研究以2,6-二甲氧基苯酚为底物检测BtL...     

AA10家族裂解多糖单加氧酶的模块化组成及底物选择性的研究进展

AA10家族裂解多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases, LPMOs)主要分布于细菌中,因其具有催化纤维素和几丁质等结晶多糖氧化降解的特性,在工业生物质转化过程中具有极强的应用潜力,从而受到广泛关注。然而,AA10家族不同LPMOs作用的底物种类及氧化位点和氧化产物也不尽相同,LPMOs的结构与组成对其底物选择性的影响机制有待进一步探究。因此,本文综述了AA10家族LPMOs的模块化结构组成及其催化机制,梳理了AA10家族LPMOs的底物谱,系统总结了AA10家族LPMOs的结构、关键作用残基及多模块组合对底物选择性影响的最新进展,并展望了LPMOs在生物质转化和生物燃料工业中广阔的应用前景。     

新基因PRR11的克隆、原核表达及鉴定

克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其原核表达载体,并进行表达检测及鉴定.以Hela细胞cDNA为模板,RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入原核表达载体PET-28a中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组原核表达载体PET-28a-PRR11.然后把PET-28a-PRR11重组载体转化到BL21中,经IPTG诱导蛋白表达,提取细胞蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到原核表达载体PET-28a中,目的蛋白成功表达.成功构建的PRR11基因的原核表达载体,及PRR11的重组蛋白表达产物,为进一步研究PRR11的基因功能奠定了基础.     

瘤胃木质纤维素降解菌及降解酶基因的研究进展

反刍动物瘤胃是公认的木质纤维素高效降解的天然反应器,对瘤胃微生物的研究已成为开发生物能源的热点领域之一。目前的研究手段已经从传统的依赖分离培养从瘤胃中获得木质纤维素降解菌,并对降解菌中的木质纤维素降解酶逐一分析,发展到通过基因组/元基因组学技术,直接从瘤胃中发现并获得大量新的木质纤维素降解酶基因/基因簇,进而探讨其降解的分子机理。已有的研究结果表明,瘤胃微生物降解木质纤维素的过程非常复杂,涉及大量不同种类的微生物及基因/基因簇,随着新分析技术的建立和完善,对这些微生物和基因的研究已取得了诸多进展。本论文综述了近期有关该方向的研究进展。     

新型隐球菌临床菌株中CNAG_01032基因的鉴定和功能研究

新型隐球菌是一种具有荚膜的重要临床致病真菌。本课题组在前期工作中发现CNAG_01032基因可能引起不同来源菌株的表型差异,本研究在此基础上以新型隐球菌临床来源菌株IFM56800（C1）、IFM56769（C2）为背景构建CNAG_01032基因敲除突变体,并检测突变株和野生型菌株经典毒力因子变化情况;使用API 20C AUX测试系统测试突变株和野生型菌株对19种糖的利用情况;使用尾静脉注射法感染BALB/c雌性小鼠进行致病性检测。结果显示：成功构建以临床株C1、C2为背景的CNAG-01032基因敲除突变株;突变株在37℃生长、黑色素产生与野生型菌株无显著差异,但荚膜厚度分别比C1、C2减少16.4%、18.2%;两基因敲除菌株均不能分解利用纤维二糖;致病性与野生型菌株无显著差异。新型隐球菌CNAG_01032基因可能参与临床来源菌株IFM56800、IFM56769的荚膜合成和纤维二糖的代谢。     

基于转录组和加权基因共表达网络的广叶绣球菌木质纤维素降解特性分析

【目的】分析广叶绣球菌（Sparassis latifolia）在不同木质纤维素诱导条件下基因表达差异,为广叶绣球菌木质纤维素降解关键基因和分子机制研究提供参考。【方法】以松木、杉木、甘蔗渣和天然堆积发酵后的杉木和发酵后的甘蔗渣为碳源,在液体培养条件下培养诱导广叶绣球菌,对其转录组进行测序研究,并对不同木质纤维素诱导样本进行加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）。【结果】杉木培养与松木培养比较组差异表达基因最少（20个）,蔗渣培养与松木培养比较组差异表达基因最多（486个）。基因本体（gene ontology,GO）富集分析结果表明,差异表达基因主要涉及氧化还原酶活性、单加氧酶活性和铁离子结合活性等,京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析结果表明,差异表达基因主要涉及戊糖和葡萄糖醛酸转换、甲烷代谢和乙醛酸盐和二羧酸盐代谢等通路。发酵甘蔗渣为碳源培养时,纤维素和半纤维素降解相关的糖苷水解酶基因表达量总体上较高,而未发酵的松木、杉木和甘蔗渣为碳源培养时木质素降解或修饰相关的碳水化合物辅助酶基因表达量总体上较高。利用WGCNA共鉴定出10个共表达模块,其中green模块与未发酵蔗渣诱导显著正相关,blue模块与发酵甘蔗渣诱导显著正相关,magenta和turquoise模块与发酵杉木诱导显著正相关。GO富集分析结果表明,turquoise模块内基因显著富集到尿素跨膜转运子活性、甲基转移酶活性和单加酶活性等,blue模块基因显著富集到水解酶活性和β-甘露糖苷酶活性。KEGG通路富集分析结果表明,blue模块内基因显著富集的通路有半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢、苯丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等。通过构建互作网络图挖掘到12个核心基因,其可能参与了基质降解及相关基因的表达调控。【结论】不同木质纤维素类型显著影响了广叶绣球菌木质纤维素降解基因的差异表达轮廓,这种差异反映了广叶绣球菌对不同木质纤维素特异的降解策略。     

瘤胃中木质纤维素降解菌及降解酶基因的研究进展

摘要：反刍动物瘤胃是公认的木质纤维素高效降解的天然反应器,对瘤胃微生物的研究成为开发生物能源的热点领域之一。其研究手段已经从传统的依赖分离培养从瘤胃中获得木质纤维素降解菌,并对降解菌中的木质纤维素降解酶逐一分析,发展到通过基因组/元基因组技术,直接从瘤胃中发现获得大量新的木质纤维素降解酶基因/基因簇,进而探讨其降解的分子机理。已有的研究结果表明,瘤胃微生物降解木质纤维素的过程非常复杂,其中涉及到大量不同种类的微生物、酶及基因/基因簇,随着新分析技术的建立和完善,对这些微生物、酶和基因的研究已取得了诸多进展。本论文综述报道了近期有关该方向的研究进展。     

条件性基因敲除:骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因小鼠的建立和基因型鉴定

Ncol2是新发现的参与免疫调节的重要因子,Ncol2基因骨髓细胞特异性敲除小鼠的建立,能够有针对性的研究Ncol2基因缺失后对免疫系统的影响。根据条件性基因敲除的原理,本文利用loxp转基因小鼠和在骨髓细胞特异性表达Cre重组酶的LysMcre小鼠,繁殖建立了骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因的小鼠,并提供了用鼠尾做基因型鉴定的简便方法。     

构菌栽培过程中对木质纤维素的降解和几种多糖分解酶活性的变化

本文分析了构菌在木屑-麦麸基物上生长发育期间,基物主要组分的降解和几种多糖分解酶活性的变化。结果表明,菌丝体迅速生长期间呼吸强度最大,在菌丝长满基物到子实体发生期间的呼吸强度很小,子实体发育期呼吸强度再次升高。在以新鲜木屑为主要基物时,构菌对基物中的纤维素和半纤维紊的分解作用较弱,并且构菌仅有很徽弱的木紊分解能力。胞外羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶,木聚糖酶、果胶酶和淀粉酶的活性存在于构菌整个栽培过程,在菌丝体迅速生长期淀粉酶活力较高,在菌丝长满基物后活力明显下降,其它四种酶的活性变化规律与淀粉酶活性变化规     

纤维二糖脱氢酶生成羟自由基和还原各种自由基的研究

利用电子顺磁共振（ＥＳＲ）技术和硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）反应研究了纤维二糖脱氢酶（ＣＤＨ）生成·ＯＨ和还原各种自由基的能力．以纤维二糖为电子供体时,ＣＤＨ可以生成·ＯＨ．·ＯＨ生成量与ＣＤＨ、Ｆｅ３＋和Ｏ２的浓度有关．加入过氧化氢酶可使·ＯＨ的生成明显减少．ＣＤＨ可以还原自旋加合物［ＰＢＮ－ＯＨ］·、氮氧自由基和天然木素分子中的自由基．结果表明,ＣＤＨ具有生成·ＯＨ和还原各种自由基的能力．对该酶在木质纤维素降解中的作用进行了探讨     

白腐菌液体和固体培养产生木质纤维素降解酶的比较研究

侧耳sp2(Pleurotus sp．2)和粗毛栓菌(Trametes gallica)是产木质纤维素降解酶能力强,且产酶较快的菌株。对其在液体培养基、固体培养基中产生木质纤维素降解酶能力和行为进行了比较分析和研究。结果表明,Pleurotus sp．2在低氮高碳高无机盐培养基中的锰过氧化物酶(Manganese peroxidases, MnPs)、木质素过氧化物酶(Lignin peroxidases．LiPs)、漆酶(laccases,Lacs)和半纤维素酶(Hemicellulases, Hcels)的活性最高。当该菌株培养在含有低氮无碳高无机盐液体培养基的麦草粉中时,MnPs和Lacs的活性峰值均出现在10d,而Hcels的活性在40d时达到峰值。Trametes gallica在高氮低碳高无机盐培养基中的Lacs和LiPs的活性最高,在低氮高碳高无机盐培养基中的MnPs和Hcels的活性最高。当该菌株培养在含有高氮无碳高无机盐和低氮无碳高无机盐液体培养基的麦草粉中时,MnPs存10d、Lacs和Hcels在40d、LiPs存50d,分别达到峰值。Pleurotus sp．2和Trametes gallica在液体培养基中具有很强的木质纤维素降解酶产生能力且产酶速度较快,在固体培养基中具有很强的降解麦秸生物质能力,但这两株菌在液体和固体培养基中,产木质纤维素降解酶的能力和行为都有较大的差异,相关性小。     

基因敲除动物的研究和应用

目的基因敲除动物是近十几年来发展起来的在个体水平上研究基因功能的一类实验动物,它以基因敲除技术和胚胎干细胞技术为基础,在生命科学研究的各个领域得到了广泛应用。最近两年发展起来的RNA干扰技术仍然不能代替它。本文综述了基因敲除动物在各医学生物领域的研究与应用、浅谈其与RNA干扰技术的比较及其发展前景。     

枯草芽孢杆菌CAS15嗜铁素基因dhbC的克隆、表达及功能鉴定

通过PCR技术扩增得到dhbC基因,对其进行序列分析发现,dhbC基因片段长为1197bp,预期编码398个氨基酸,蛋白分子量大小为43.8kD。将目的片段连接到表达载体pET-30a(+),转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)/pET-30a-dhbC,以IPTG在30oC诱导4h实现高效表达,获得一个分子量为48.8kD的融合蛋白。重组蛋白可溶性分析结果表明:融合蛋白主要为可溶性蛋白。Western blotting分析结果表明:重组蛋白可与兔抗His-tag多克隆抗体发生特异性反应,在48.8kD处有特异条带,与预期结果一致,证明重组质粒中含有dhbC基因。通过同源重组的策略将dhbC基因敲除后重新导入,验证了dhbC基因与嗜铁素的生物合成密切相关。     

胰岛素样生长因子结合蛋白4基因敲除小鼠的建立和鉴定

[目的]用CRISPR/Cas9技术构建胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP-4)基因敲除(knock-out,KO)小鼠,以研究IGFBP-4对脑发育的影响。[方法]将IGFBP-4引导RNA和Cas9 mRNA显微注射于小鼠受精卵,繁育小鼠并观察体重和脑重改变。PCR和RT-PCR鉴定DNA和mRNA突变,Isotropic Fractionator测脑细胞总数和神经元数量,Western Blot观察NeuN表达,转棒实验测试动物行为学。[结果]KO造成了4种DNA缺失和插入突变,选择缺失GGGT致移码突变的动物进行繁育。与野生型小鼠相比,3月龄KO小鼠体重减轻了10.8%(P <0.05),整脑、皮层和小脑重量分别减轻了7.2%、6.9%和10.3%(P <0.05),小脑神经元比例和NeuN表达水平分别降低了14.3%和15.3%(P <0.05),Rotarod运动能力有所降低。[结论]用CRISPR/Cas9成功制备了IGFBP-4 KO小鼠,动物体重和部分脑区重量和神经元数量受到了影响。     

禾谷镰刀菌中FgPDE1基因的敲除及其功能的研究

目的:旨在敲除禾谷镰刀菌Fusarium graminearum Fg PDE1基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。方法:应用Split-marker技术构建含有潮霉素基因敲除盒,通过PEG介导原生质体转化,PCR筛查抗潮霉素转化子以获得缺失突变体ΔFg PDE1,根据突变体表型变化及致病性的检测对Fg PDE1基因的功能进行分析。结果:采用Split-marker技术,成功构建了Fg PDE1基因敲除盒;PEG介导转化禾谷镰刀菌原生质体后成功获得转化子。经PCR筛查,得到3个PCR确认的敲除突变体;表型观察发现,ΔFg PDE1菌落的外型及菌落生长速度与野生型没有明显差异。孢子侵染西红柿果实实验证明:以西红柿为侵染宿主,相对于野生型,突变体致病性没有明显减弱;但突变体分生孢子产量显著下降。结论:Fg PDE1基因可能与禾谷镰刀菌分生孢子的形成有关。