BPOZ基因剔除小鼠模型的建立

BPOZ是在卵巢癌等肿瘤组织中表达下调的细胞生长抑制基因,建立BPOZ基因剔除小鼠模型,可以为在体研究BPOZ基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.运用生物信息学手段确定小鼠BPOZ基因组序列,设计基因剔除策略,构建完成了基因剔除载体XpPNT-BPOZ.以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得抵抗克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆.将同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠.嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti毛色的小鼠30只,其中15只为BPOZ基因剔除杂合子小鼠,阳性率为50%.在雌雄杂合子交配的后代中获得纯合子小鼠.初步的表型观察发现BPOZ基因剔除小鼠发育正常,有繁殖能力,进一步的表型分析工作正在进行之中.     

LIF基因转染的ES细胞生长与分化特性的研究

我们将人D型LIF cDNA以正反两种方向分别克隆到载体pKCR 3,并引入neo~r基因,构建成pSVLD( )和pSVLD(-)质粒,按磷酸钙沉淀法分别转染ES-5胚胎干细胞,经G418和不同浓度LIF条件培液共同筛选、Nor-thern和Southern分析以及ES-5细胞集落分化抑制能力测定,建立了过度表达分泌LIF的ESL( )细胞株和表达外源反义LIF RNA的ESL(-)细胞株。我们发现,ESL( )A2细胞能够在无外源LIF常规培液下至少传13代以上,仍能正常生长和传代,并保持与ES-5细胞同样的体外生长的特征性形态,以及具有干细胞特点和发育多潜能性,表明过度表达LIF确实能使ES细胞完全脱离对外源LIF条件培液的依赖性;而表达反义LIP RNA的ESL(-)细胞对培液中LIF浓度的依赖性明显升高,也更易分化,说明ES细胞内源LIF基因的表达水平虽低,但对于抑制ES细胞的分化仍可能是必需的。形态学观察发现,体外悬滴培养中经10~(-6)mol/L RA诱导后,过度表达LIF并未产生抑制ESL( )A2细胞分化的现象,和亲本ES-5细胞比较,也未发现其明显改变了10~(-6)mol/L RA对ESL( )A2细胞诱导分化的方向;而相同条件下,表达外源反义LIF RNA,则使ESL(-)B5细胞更易于向形态明确的细胞包括成纤维样和梭样细胞分化。上述细胞株的建立,提供了一个研究在不添加LIF的常规培液中生长的ES细胞或表达外源反义LIF RNA的ES细胞的生长分化的模型。     

研究哺乳动物早期胚胎发育与分化的ES细胞途径

ＥＳ细胞即胚胎干细胞,它是由哺乳动物附植前早期胚胎的内细胞团细胞体分离培养而建立的。其特点是只生长,不分化,并保持发育的多能性。作为一种理想的模型系统与有用的工具,可用于研究哺乳动物早期胚胎的发育与基因的表达。     

维生素A酸受体γ基因表达及其对ES细胞分化和凋亡的影响

We have constructed pSG5-RAR gamma-neo plasmid containing mouse retinoic acid receptor gamma (RAR gamma) gene and neo gene, and introduced it into embryonic stem ES-5 cells, by calcium phosphate mediated transfection. Some G418-resistant clones were isolated and from RNA dot blot analysis of these clones, a clone overexpressing RAR gamma gene was established, designated as ES-gamma cell line. Northern blot hydridization and Southern blot hydridization analysis of ES-gamma cells (Fig 3, 4) demonstrated that ES-gamma cells overexpressed exogenous RAR gamma mRNA and the exogenous RAR gamma cDNA integrated into the genome of ES cells. ES-gamma cells retained undifferentiated morphology and positive alkaline phosphatase activity (Plate I, Fig. 1, 2), so it resembled ES-5 cells in terms of stem cell characteristics. When ES-gamma cells were subcutaneously inoculated into nude mouse and differentiated in vivo, tumorous nodules containing various tissue structures were obtained, demonstrating their pluripotent properties just like parent ES-5 cells. Contrasting with ES-5 cells, the histological features of tumors showed no cartilage tissues, but abundant muscle tissues and keratinized cyst like structures constituted by stratified squamous epithelia (Plate I, Fig. 3). Differentiating in vitro by hanging drop culture methods, ES-gamma cells differentiated mostly into fibroblast-like cells, (Plate II, Fig. 1-5). The above results indicated that overexpression of RAR gamma gene changed the cell type of ES cells differentiating in vivo and in vitro. During the differentiation of ES-5 cells induced by RA, a large number of cells rounded up, detached from the dish and tended to die. We suspected that this phenomenon may be apoptosis. The ultrastructure appearance of the dying cells displayed typical apoptotic changes including chromatin condensation and nuclear fragmentation (Plate I, Fig. 4, 5). Detection of DNA fragments using agarose gel electrophoresis showed characteristic laddered patterns of apoptotic DNA fragments (Fig. 5). The above results indicated that RA induced apoptosis of ES-5 cells in the course of differentiation. The percentage of apoptosis of ES-5 cells increased accordingly, with the increase of RA concentration (Fig. 6). With the same concentration of RA 10(-7) mol/L, the percentage of apoptotic of ES-gamma death was roughly one times more than that of ES-5 cells (Fig. 7), a fact indicating that RAR gamma may mediate the apoptotic signal transduction of ES cells by RA.     

研究哺乳动物早期胚胎发育与分化的ES细胞途径

ＥＳ细胞即胚胎干细胞,它是由哺乳动物附植前早期胚胎的内细胞团细胞体外分离培养而建立的。其特点是只生长,不分化,并保持发育的多能性。作为一种理想的模型系统与有用的工具,可用于研究哺乳动物早期胚胎的发育与基因的表达。本文从以下四个方面分述了ＥＳ细胞的具体应用及其研究进展：１）探讨早期胚胎生长发育的条件;２）研究胚胎组织分化的发生及其诱导;３）用ＥＳ细胞与正常胚胎细胞在体外重建胚胎;４）ＥＳ细胞体外定位整合外源ＤＮＡ。     

P^53基因在U937细胞生长和分化过程中的调节作用

The expression of p53 gene has been found to be regulated during the induction of differentiation of U937 leukemic cells into mature macrophages by recombinant human granulocyte- macrophage colony stimulating factors (rhGM-CSF) We showed here that the increased expression of p53 seemed to be necessary for the differentiation of U937 cells induced by rh-GM-CSF. The inhibition of p53 expression by a p53 antisense oligodeoxynucleotide lead to the significant decrease of formation of mature macrophages from U 937 cells in the presence of rhGM-CSF. By contrast, the p53 sense oligodeoxynucleotide had no any effect. Furthermore, we have analysed the growth of U937 cells in the presence or absence of rhGM-CSF. The results showed that rhGM-CSF dramatically inhibited the growth of U 937 cells in the cultures. At the same time, the antisense inhibition experiment demonstrated that the inhibition of p53 expression partially diminished the growth-inhibitory effect of rhGM-CSF on U 937 cells. These results suggested that the p53 was required for the initiation of rhGM-CSF-induced differentiation of U 937 cells on one hand, and the inhibition of cell growth on the other hand. Thus we deduce that the increased expression of p53 induced by rhGM-CSF may be a coupling event of switch of U 937 cells from growth into differentiation.     

ES小鼠和ES细胞中H19基因甲基化状态

为探讨印迹基因H19的甲基化状态与ES小鼠胚胎发育之间的关系, 以遗传背景相同的正常成年对照小鼠、22只成年ES小鼠和8只新生死亡的ES小鼠以及不同传代次数的ES细胞为实验材料, 利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR技术分别检测了其印迹基因H19的5′非翻译区两个位点的甲基化状态。结果表明, 发育至成年的ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与正常成年对照小鼠之间没有差异, 而新生死亡的ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠以及正常成年对照小鼠相比则存在明显差异。推测ES细胞中印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠以及正常成年对照小鼠之间可能存在 差异。     

小鼠锌指蛋白基因ZF-12基因剔除的ES细胞系的建立

利用小鼠锌指蛋白ZF－12基因组DNA片段,构建了针对小鼠ZF－12基因座的替换型打靶载体pSSC-TV-10.5。经限制性核酸内切酶酶切及部分测序鉴定其结构正确后,通过电穿孔将线性化打靶载体导入ES人,经G418／GANC双药筛选和分子鉴定,获得4个ZF－12^ /-基因的ES细胞杂合子克隆,其生长状态良好,为进一步建立ZF－12基因剔除的小鼠动物模型创造了条件。     

p~(53)基因在U 937细胞生长和分化过程中的调节作用

本文报道了p~(53)基因对人白血病细胞系U 937细胞生长和分化的调节作用。重组人GM-CSF(rhGM-CSF)可诱导U 937细胞向成熟巨噬细胞分化,这反映在分化后的细胞表达有巨噬细胞许多表型特征和功能活性。在这一分化过程中同时伴随着p~(53)基因的表达增加和U 937细胞生长受抑。进一步,用反义脱氧寡聚核苷酸抑制试验特异性地抑制p~(53)基因表达,结果发现p~(53)反义脱氧寡聚核苷酸可以明显抑制rhGM-CSF诱导U 937细胞向成熟巨噬细胞分化,同时也明显解除rhGM-CSF介导细胞分化过程中的细胞生长抑制作用。这些结果说明p~(53)基因在U 937细胞的生长和分化过程中可能起偶联调控作用。     

Smad5双等位基因剔除ES细胞的建立及其初步研究

Smad5是TGF-信号的细胞质内信号转导分子. Smad5的定位剔除导致小鼠胚胎期死亡. 为了进一步研究Smad5在组织器官发育中的功能, 利用同源重组技术获得了Smad5双等位基因剔除的胚胎干(ES)细胞. 首先利用Cre-LoxP系统删除了Smad5中靶ES细胞的抗性基因, 再用相同的打靶载体进行转染, 经Southern杂交筛选获得了Smad5双等位基因剔除的ES细胞. 嵌合体研究的结果表明, Smad5在心脏和神经管的正常发育中可能起重要的作用. Smad5双等位基因剔除ES细胞在裸鼠皮下可以形成畸胎瘤, 并可分化成包括神经细胞、肌肉细胞、软骨细胞、内皮细胞等在内的多种细胞, 因而Smad5双等位基因剔除的ES细胞可用于研究Smad5介导的TGF-信号在多种组织器官发育和ES细胞体外定向分化中的作用.     

鸡胚ESC和SSCs特定基因表达差异的研究

目的:探讨鸡胚胎干细胞(ESC)和精原干细胞(SSCs)在基因表达水平上的差异.方法:传至二代的ESC和SSCs,采用免疫荧光和碱性磷酸酶检测法联合鉴定其干细胞特性,RT-PCR方法检测两者相关基因的表达差异.结果:两种处于未分化状态时的干细胞基因表达存在差异:未分化的ESC表达基因GDF3基因和Nanog基因;SSCs表达特定基因c-kit、Cvh和Stra8基因.结论:两种干细胞在基因表达水平上有差异,为ESC与SSCs在基因水平上的鉴定提供参考依据.     

绵羊GDF9基因PCR-SSCP分析

生长分化因子9（GDF9）是由卵母细胞分泌的一种生长因子,它对早期卵泡的生长和分化起重要的调节作用。采用PCR－SSCP技术分析了GDF9基因在小尾寒羊、湖羊、多赛特羊和萨福克羊4个绵羊品种的多态性。结果表明：GDF9基因在两对引物扩增片段中均存在PCR－SSCP多态性。对于引物1扩增片段,4个绵羊品种均检测到AA基因型,AB基因型只出现在湖羊、多赛特羊和萨福克羊中,仅在萨福克羊中检测到BB基因型;在4个绵羊品种中,A等位基因频率明显高于B等位基因频率。对于引物2扩增片段,4个绵羊品种均检测到AA基因型,AB基因型只出现在湖羊、多赛特羊和萨福克羊中,4个绵羊品种均没有检测到BB基因型;在4个绵羊品种中,AA基因型频率最高,A等位基因频率明显高于B等位基因频率。引物1的多态性片段测序分析表明：位于GDF9基因cDNA第152处发生了单碱基的改变（A→G）,并导致了氨基酸的改变（天冬酰胺→天冬氨酸）。     

定向诱导小鼠ES细胞向心肌细胞的分化

为了提高体外诱导ES细胞向心肌细胞分化的效率 ,对以往的诱导方法加以改进 ,采用直接悬浮培养和 0 8%DMSO诱导 ,建立了简便、高效的定向诱导ES细胞向心肌细胞分化的体系 .诱导第 9d起可见自发性、有节律跳动的类胚体出现 ,第 14d达到高峰 ,约有 70 %的拟胚体产生跳动 .用RT PCR的方法在跳动的拟胚体中检测到心肌细胞特异性标志物的表达 ,采用免疫荧光染色的方法在蛋白水平检测到心肌特异的α辅肌动蛋白 (α actinin)的表达 ,并可见清晰肌小节 ,表明在改进的体外诱导条件下ES细胞可分化为成熟的心肌细胞 .     

生长分化因子9基因的分子生物学

生长分化因子9是卵母细胞分泌的一种生长因子,它对卵泡的生长分化起着重要作用。本文介绍了生长分化因子9的结构、功能和调控,生长分化因子9基因的克隆及基因结构、发育性表达和作用、定位和多态性,并讨论了该基因与哺乳动物繁殖性能的关系。     

慢病毒介导Nanog基因在小鼠ES细胞的表达

试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。结果显示通过RT-PCR扩增出918bp的小鼠Nanog基因,测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异,在无LIF的ES细胞培养液培养条件下,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落,碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。根据小鼠Nanog基因m RNA序列设计Nanog基因引物,引物两端带有Nhe I和Xho I酶切位点。Trizol试剂处理小鼠ES细胞,通过RT-PCR扩增出小鼠Nanog基因,小鼠Nanog基因用Nhe I和Xho I酶切后连入pcDNA3.1载体中,PCR检测阳性的细菌克隆进行测序,测序正确的Nanog基因片段连接入PLL-IRES-Neo慢病毒表达载体中,包装含有Nanog基因的慢病毒感染小鼠ES细胞,在SNL细胞饲养层上G418筛选2周后,添加普通ES细胞培养液在普通小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上培养。结果显示通过RT-PCR扩增出918 bp的小鼠Nanog基因,测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异,在无LIF的ES细胞培养液培养条件下,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落,碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。     

小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞的基因芯片分析

弄清胚胎肝脏发育的分化调节机制,对指导干细胞在肝再生中的应用以及研究肝分化相关疾病分子机制具有重要意义．胚胎干细胞的全能性使得体外建立肝向分化模型成为可能,采用单层贴壁培养方式,分阶段加入成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素(OSM)等因子,诱导小鼠胚胎干细胞D3(mESC-D3)的肝向分化．分化细胞在光镜和电镜下呈现肝样细胞形态,RT-PCR、细胞免疫荧光检测以及PAS染色分析表明,这些细胞具有肝细胞特征性的基因表达和生化功能．采用干细胞分化相关基因芯片比较早期肝定向分化前后的基因表达差异,结果显示,48个差异表达基因中(大于2倍),20个上调、28个下调．进一步的生物信息学分析发现,它们集中体现在细胞外基质、细胞连接、FGF、BMP分子及Notch、Wnt信号通路上,提示这些改变可能与胚胎早期的肝向分化密切相关．     

人胚胎干细胞培养建系及其应用

简要概述了自1998年首次建立hES细胞系以来近6－7年国内外的现况、分离培养建系、鉴定标准和冻存技术发展、定向诱导分化及其应用等方面的研究进展。