新型人冠状病毒HCoV—NL63和HCoV-HKU1的研究进展

多年来,人们公认的人冠状病毒包括HCoV-229E和HCoV-0C43等2株。但2002-2003年,由一种新型人冠状病毒SARS-CoV所引发的全球范围的严重急性呼吸综合征（SARS）的流行,使多国蒙受巨大损失,由此,冠状病毒又成为研究的焦点。随着分子生物学技术的发展,2004-2005年,又发现了2种新型人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1。在此,就这2种病毒的发现、流行情况,及其与疾病的相关性做一简要综述。     

猪丁型冠状病毒荧光定量RT-PCR与S1蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

最近,新发现的猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCo V)可导致仔猪腹泻,亟待建立有效准确的核酸及血清学检测方法并调查猪场的PDCo V感染情况。本研究采用针对病毒M基因的探针荧光定量RT-PCR检测方法,对2014-2015年间收集的河南、湖南、浙江、江西、安徽、河北、黑龙江、江苏、山东和上海等10个省市收集的共254份腹泻仔猪小肠匀浆或粪便样本进行检测,共检出11份PDCo V阳性样本,总阳性率为4.33%。采用在昆虫细胞表达纯化的PDCo V囊膜S1蛋白为包被抗原,建立间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测2015-2016年间收集的来自江苏、湖南、浙江等7个省份的609份具有腹泻症状的猪血清样品,抗PDCo V S1抗体检出率为44.17%(269/609)。上述建立的两种方法分别针对病毒的RNA或抗体对PDCo V进行特异性检测,可以应用于PDCo V流行情况的监控。     

实时荧光定量PCR及RT-PCR与常规PCR及RT-PCR检测对虾病毒效果的比较

常规PCR及RT-PCR已用于对虾DNA及RNA病毒检测,但存在费时、灵敏度较低、不能定量等问题。建立了TaqMan实时荧光定量PCR及RT-PCR方法,分别用于检测白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)及桃拉综合征病毒(TSV)、黄头病毒(YHV)4种对虾病毒。与常规PCR及RT-PCR比较,所建立的TaqMan实时荧光定量PCR及RT-PCR检测上述4种对虾病毒不仅有很高的特异性,检测灵敏度也提高了10～100倍,同时还具有快速、简便、不污染环境、重复性好、实时定量等优点,可明显提高对虾病毒检验检疫工作质量及效率。     

SARS冠状病毒实时荧光RT-PCR定量检测

为建立一种快速、准确、特异的SARS病毒RNA定量检测方法,根据复合探针荧光定量分析原理,对SARS病毒核酸进行实时荧光定量RT-PCR检测.借助计算机辅助,对SARS病毒基因靶序列以及检测引物和探针进行了优化筛选;利用体外转录SARS病毒RNA靶序列,对RT-PCR反应的镁离子浓度参数进行了优化;比较Trizol法、磁珠法、Qiagen法、煮沸法等4种方法提取RNA的检测效果,建立了样本处理方法;通过对构建的体外转录靶序列模型的检测,对本方法的灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评价,并通过对42例临床标本的检测对本方法的检测效果进行了评估. 通过克隆SARS病毒核酸靶序列并进行体外转录,获得了长度约1.2 kb的体外转录RNA靶序列;经优化,荧光RT-PCR反应液中的Mg²⁺浓度以4.0 mmol/L为最好;RNA提取方法采用磁珠法效果较好;本方法的检测灵敏度最低可达5个拷贝的体外转录RNA分子,特异性100%,C_t值的CV值小于5%.对临床确诊的42份SARS病人血清和漱口水标本的检测结果表明,该方法的检出率为79%,与荧光抗体检测法的符合率为70%.上述结果表明,该方法建立的荧光定量RT-PCR技术能够快速准确、特异、敏感地对SARS病毒核酸进行定量分析,为临床SARS冠状病毒RNA的检测提供了新的,更为有效的检测方法.     

李痘病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立李痘病毒(PPV)特异、灵敏、快速的实时荧光定量RT-PCR检测方法,用于核果类种苗的健康评测及李痘病毒疫情监测。方法:根据PPV-D株系和PPV-M株系的外被蛋白(CP)基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,扩增全长CP基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立PPV的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:此荧光定量RT-PCR方法对PPV检测呈现高灵敏度和高特异性,与马铃薯Y病毒和马铃薯X病毒无交叉反应,最低检出限可达1.6×102拷贝/μL,标准曲线的相关系数为0.999 18。结论:建立了李痘病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,可望应用于检验检疫部门对李痘病毒的快速检测。     

人B组轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

人B组轮状病毒曾在我国发生过散发和暴发流行,近年来在世界多个国家也均有报道。为建立一种灵敏和特异的人B组轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对人B组轮状病毒NSP3片段保守区设计和筛选特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并对该方法的灵敏性、特异性、稳定性进行评价。结果显示,该方法针对人B组轮状病毒检出限可以达到6.28拷贝/μL;与多种常见和罕见的人腹泻病毒没有交叉反应;批内和批间等重复性试验变异系数均小于5%。本研究建立的人B组轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、稳定性好、检出率高,可作为一种新的技术手段应用于人B组轮状病毒的快速筛查与诊断。     

中东呼吸综合征冠状病毒多重荧光定量RT-PCR检测技术的建立

建立中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染的筛查与诊断应用的核酸检测方法。本研究建立了基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重的三种荧光定量RT-PCR检测技术方法,分别与前期建立的单重荧光定量RT-PCR(upE或N2)检测方法做了比较,并且采用MERS-CoV病毒毒株、上海提供的口岸发烧病人样本以及由首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品和全血的样品做了临床验证。结果显示:采用MERS-CoV病毒毒株作为模板,三种新建立的多重检测方法与单重荧光定量RT-PCR检测方法最低检测限均能达到10PFU/mL,且与其他常见呼吸道病毒的阳性样本均无交叉反应,特异性良好。对临床样品的验证中,上海病人咽拭子样本均为阴性,而中国首例MERS输入病例的急性期咽拭子样品均为阳性,而全血样的检测结果显示N2靶标有较高检出率,明显优于基于upE单一靶标。本研究所建立的基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重荧光定量RT-PCR检测技术方法用于MERS-CoV感染的实验室诊断,具有较高灵敏度与特异性及适用性。     

人冠状病毒NL63棘突蛋白的研究进展

20世纪60年代以前,人们普遍认为只有2种人冠状病毒(HCoV)HCoV-229E和HCoV-OC43感染人类,2002～2003年出现的由SARS-CoV引发的严重急性呼吸综合征(SARS)的流行使人冠状病毒又一次成为研究的焦点,2004年又发现了一种新的人冠状病毒HCoV-NL63。在此,主要就HCoV-NL63,特别是其主要结构蛋白——棘突蛋白的研究进展做一简要综述。     

中国蓝舌病病毒流行株血清型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

[背景]蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,我国存在12种血清型BTV (BTV-l、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21和-24)的流行.[目的]建立12种血清型BTV的RT-qPCR定型方法,为BTV的诊断与流行病学研究提供技术保障....     

鸭冠状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种鸭冠状病毒（Duck coronaviruses,DuCoV）的临床快速诊断方法,根据鸭冠状病毒1b基因保守区域设计特异性引物,成功建立了用于检测鸭冠状病毒的特异性SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法特异性强、敏感性高、重复性好,对鸭冠状病毒有特异性扩增,最低检测限为8.04×100拷贝/μL,比普通PCR方法敏感10倍,批内变异系数与批间变异系数分别为0.28%～0.34%、0.25%～0.36%,均小于1%。对临床可疑鸭泄殖腔拭子进行检测,本方法与常规PCR方法的检测结果阳性符合率为100%,阴性符合率为96.43%,样本总符合率为97.62%。本研究建立的鸭冠状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于鸭冠状病毒的临床快速诊断及流行病学监测。     

北京地区人冠状病毒NL63 N和E蛋白基因序列及生物信息学分析

为了解北京地区新近发现的新型冠状病毒-人冠状病毒NL63(Human coronavirus NL63,HCoV-NL63)的N和E蛋白编码基因的特征,从经RT-PCR检测阳性的临床标本中扩增得到的HCoV-NL63 N蛋白和E蛋白编码基因序列,分别克隆至pCF-T和pUCm-T载体中并进行测序,同时运用生物信息学的方法,对北京HCoV-NL63阳性标本BJ8081 N和E蛋白编码基因的核苷酸和氨基酸序列与HCoV-NL63原型株及其他几种冠状病毒的N和E蛋白编码基因的核苷酸和氨基酸序列进行比较分析和种系进化分析;用SOPMA方法对BJ8081 N和E蛋白的二级结构进行了预测分析,并对N和E蛋白的其他生物学特性进行了预测分析.经序列比对分析发现,BJ8081 N蛋白氨基酸序列在78～85肽段(FYYLGTGP)内与所比较的其他冠状病毒N蛋白相应位置的氨基酸序列完全相同,提示此区段可能为包括HCoV-NL63在内的所有冠状病毒N蛋白的保守区域.在BJ8081 N蛋白氨基酸序列的100～121肽段可能是和基因组RNA相结合的位置;在BJ8081 E蛋白的15～37位氨基酸可能是E蛋白的跨膜区域.研究对BJ8081 N蛋白和E蛋白的编码基因序列进行了测定和生物信息学分析,为今后对HCoV-NL63的进一步深入研究奠定了基础.     

人冠状病毒NL63核壳蛋白和棘突蛋白的表达及其在血清学检测中的初步应用

目的:重组表达人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)的核壳蛋白(N蛋白)及棘突蛋白(S蛋白),用于检测血清中的相应抗体。方法:用原核表达系统表达HCoV-NL63的N蛋白,建立检测N抗体的Werstern印迹法;用真核表达系统表达HCoV-NL63的S蛋白,建立检测S抗体的间接免疫荧光(IFA)法。结果:经Werstern印迹检测,重组S蛋白和N蛋白表达正确;初步建立了N蛋白纯化方法。利用建立的检测方法,检测了100份正常成人血清,总阳性率为81%。其中S抗体阳性率为66%,N抗体阳性率为38%,S抗体和N抗体均为阳性的占总数的22%,双抗体均为阴性的占总数的19%;S抗体的检出率明显高于N抗体。结论:重组HCoV-NL63N蛋白及S蛋白表达成功;S抗体和N抗体共同检测可获得较好的检测结果,减少漏检。     

禽流感和新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的：建立二重荧光定量RT-PCR方法,用于禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）的检测。方法：根据AIV和NDV的基因保守序列,设计了AIV和NDV的2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针;对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测AIV和NDV的Z-重荧光定量RT-PCR方法。结果：所建方法特异性好,对AIV和NDV的检测敏感性均达到2000个模板拷贝数,比常规RT-PCR敏感性高100倍;抗干扰能力强,对AIV和NDV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测2种病毒。对保存的AIV或NDV鸡胚尿囊液及临床病料进行二重荧光定量RT-PCR检测,结果尿囊液检测的拷贝数均达到10^10/μL以上,临床病料的拷贝数为2．13x10^8-6．52x10^4／μL。结论：建立了用于检测AIV和NDV的二重荧光定量RT-PCR法,该方法特异、敏感、快速、可定量,对AIV和NDV的防制有重要意义。     

NL63冠状病毒木瓜样蛋白酶去泛素化酶活性和对宿主抗病毒天然免疫反应调节作用

引起人类呼吸道感染的冠状病毒已多达5种．冠状病毒与宿主相互作用决定了其致病性和免疫特性．冠状病毒感染后宿主会立即启动抗病毒天然免疫反应,而人类冠状病毒往往会编码特定蛋白逃逸或抑制宿主的天然免疫反应．NL63冠状病毒是一种新型人类冠状病毒,其非结构蛋白nsp3编码2个木瓜样蛋白酶(PLP)核心结构域PLP1和PLP2．前期研究发现,人类冠状病毒PLP2是一种病毒编码的去泛素化酶(DUB),但是对其DUB特性和功能还不清楚．研究发现,NL63冠状病毒PLP1和PLP2两个核心结构域中只有PLP2具有DUB活性,而且,PLP2的DUB活性对K48和K63连接的多聚泛素化修饰不表现明显特异性．同时,蛋白酶活性催化位点C1678和H1836突变后对其DUB活性有明显抑制作用,而蛋白酶活性催化位点D1849突变后对DUB活性无影响．其次,PLP2而非PLP1核心结构域能够明显抑制仙台病毒和重要信号蛋白(RIG-I、ERIS/STING/MITA)激活的干扰素表达,表明PLP2是一种冠状病毒编码的干扰素拮抗剂,而且PLP2的干扰素拮抗作用不完全依赖其蛋白酶活性．机制研究表明,PLP2能够与干扰素表达通路中的重要调节蛋白RIG-I和ERIS发生相互作用,通过对RIG-I和ERIS的去泛素化负调控宿主抗病毒天然免疫反应．此外,PLP2除利用DUB活性抑制干扰素表达外,很可能存在不依赖自身催化活性的其他组分共同抑制干扰素的产生．以上研究对阐明人类新发冠状病毒免疫和致病机理以及抗病毒药物研发具有重要参考价值．     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severe acute respiratory syndrome -associate coronavirus,SARS-CoV)核酸.筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性. 实验结果表明本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好.本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测.     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RTPCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severeacuterespiratorysyndromeassociatecoronavirus,SARSCoV)核酸。筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RTPCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性。实验结果表明:本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好。本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测。     

Comparison of SARS and NL63 papain-like protease binding sites and binding site dynamics: inhibitor design implications

The human severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) and the NL63 coronaviruses are human respiratory pathogens for which no effective antiviral treatment exists. The papain-like cysteine proteases encoded by the coronavirus (SARS-CoV: PLpro; NL63: PLP1 and PLP2) represent potential targets for antiviral drug development. Three recent inhibitor-bound PLpro structures highlight the role of an extremely flexible six-residue loop in inhibitor binding. The high binding site plasticity is a major challenge in computational drug discovery/design efforts. From conventional molecular dynamics and accelerated molecular dynamics (aMD) simulations, we find that with conventional molecular dynamics simulation, PLpro translationally samples the open and closed conformation of BL2 loop on a picosecond-nanosecond timescale but does not reproduce the peptide bond inversion between loop residues Tyr269 and Gln270 that is observed on inhibitor GRL0617 binding. Only aMD simulation, starting from the closed loop conformation, reproduced the 180° ?-ψ dihedral rotation back to the open loop state. The Tyr-Gln peptide bond inversion appears to involve a progressive conformational change of the full loop, starting at one side, and progressing to the other. We used the SARS-CoV apo X-ray structure to develop a model of the NL63-PLP2 catalytic site. Superimposition of the PLP2 model on the PLpro X-ray structure identifies binding site residues in PLP2 that contribute to the distinct substrate cleavage site specificities between the two proteases. The topological and electrostatic differences between the two protease binding sites also help explain the selectivity of non-covalent PLpro inhibitors.     

人博卡病毒TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人博卡病毒(HBoV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码HBoV非结构蛋白NP-1的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与传统PCR方法进行比较,然后分别对两者的灵敏性、特异性、稳定性及临床样本检验的适用性等进行评价。结果:所建立的实时定量PCR检测方法可用于HBoV的特异性检测;相对于传统PCR所达到的250拷贝/反应的检测灵敏度,实时定量PCR的检测灵敏度可高达10拷贝/反应,检测范围为109～101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性;初步用于76份临床呼吸道标本检测,检出阳性5例,高于普通PCR方法(3/76)。结论:建立了HBoV TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,为开展HBoV流行病学监测及早期临床诊断提供了技术手段。