定向引入N-糖基化位点改进黑曲霉β-1,4-内切木聚糖酶热稳定性

【背景】木聚糖是生物圈中仅次于纤维素的第二大多糖,其结构复杂,完全降解需要多种木聚糖酶协同作用。β-1,4-内切木聚糖酶是木聚糖主链水解过程中最关键的酶,已广泛应用于饲料、造纸、能源、食品和医药等行业。但在实际应用中,由于真菌木聚糖酶的热稳定性较差,限制了其在工业中的应用。【目的】提高来源于黑曲霉(Aspergillusniger)的β-1,4-内切木聚糖酶(xynB)热稳定性。【方法】采用氨基酸虚拟突变技术对xynB定向引入一个N-糖基化位点,将虚拟突变后筛选获得的候选突变体和野生型在毕赤酵母SMD1168中表达,并对纯化后的野生型和突变体酶进行酶学性质和稳定性分析。【结果】经虚拟突变和筛选获得5个候选突变体,在毕赤酵母SMD1168中成功表达了4个突变体,其中3个突变体发生了糖基化。突变体和野生型酶均表现出宽范围的酸碱耐受性,且突变体xynB~(A92N/D94T)在pH4.0–11.0条件下的稳定性明显优于野生型;糖基化突变体xynB~(A92N/D94T)、xynB~(G66N/A68T)和xynB~(G66F/D67N/G69T)在温度为60–80°C时热稳定性明显高于野生型,xynB~(G66N/A68T)在80°C保温30 min后的残留酶活比野生型提高了约30%。【结论】本研究方法可为其他来源木聚糖酶和其他工业酶的热稳定分子改造提供参考。     

定点突变对酰胺水解酶DamH可溶性表达和酶活的影响

摘要:【目的】DamH是一种具有酯酶活性的酰胺水解酶,其非活性中心氨基酸残基的突变对重组酶可溶性表达和比酶活产生一定的影响。拟探索DamH的活性中心氨基酸残基构成,并对其非活性中心氨基酸残基突变对可溶性表达和比酶活的影响进行研究。【方法】通过重叠延伸的方法对DamH可能的活性中心氨基酸S149、E244和H274以及非活性中心氨基酸D165及N192进行定点突变,通过静息细胞测活验证了S149、E244和H274 在催化2-氯-N-(2’-甲基-6’-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)水解反应中的作用,通过Ni2+- NTA亲和层析对D165及N192突变子进行纯化,对突变株和野生型比酶活进行比较。【结果】研究表明S149A使DamH的CMEPA 水解酶活性下降为野生型的5%,E244A和H274A突变导致其失去活性;D165P和N192P突变影响到DamH的可溶性表达,表达量分别为野生型的28.2%和20.8%,突变子N192P、D165P比酶活分别为野生型比酶活的55.5%和49.7%。【结论】DamH催化酯类底物和芳基酰胺类底物可能共用同一活性中心S149、E244和H274,其两个α螺旋的转角处氨基酸侧链极性和刚性结构的改变对可溶性表达以及活性有很大的影响。     

GH42家族保守氨基酸位点累积突变对Geobacillus stearothermophilus来源β-半乳糖苷酶BgaB催化活性的影响

【背景】β-半乳糖苷酶转糖苷活性弱,产物低聚半乳糖(galactooligosaccharides, GOS)易被水解,致其催化得率普遍较低。【目的】以GH42家族Geobacillus stearothermophilus来源β-半乳糖苷酶BgaB为对象,探讨家族保守氨基酸位点突变对β-半乳糖苷酶BgaB催化活性的影响。【方法】在单点突变体功能研究基础上,采用定点突变与化学修饰相结合的方法,对保守氨基酸位点E303与F341进行累积突变。【结果】与野生型酶相比,所构建双点突变体Ox-E303C/F341S水解活性降低为30%;GOS最大得率由0.75%提高到19.50%。【结论】家族保守氨基酸位点累积突变能够使单点突变体功能得到共同进化,降低β-半乳糖苷酶水解活性和底物抑制作用,能够提高其转糖苷催化活性。     

长双歧杆菌N-乙酰氨基己糖1-位激酶的活性位点

【目的】研究长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)JCM1217的N-乙酰氨基己糖1-位激酶(Nacetylhexosamine 1-kinase,Nah K)中对催化活性有影响的位点。【方法】利用点突变试剂盒,获得Nah K的4个位点的共10种单点突变体表达菌株。诱导表达并纯化野生型和突变体酶,用DNS法和NADH偶联的微孔板分光光度法检测野生型及突变体酶的最适p H和最适Mg~(2+)浓度,并测定酶促反应动力学参数。【结果】D208A、D208N、D208E和I24A四种突变体的催化活性几乎丧失。突变体H31A、H31V、F247A和I24V的最适p H由野生型的7.5变为7.0,突变体H31A和F247A的最适Mg~(2+)浓度由野生型的5 mmol/L变为10 mmol/L。反应动力学参数测定结果表明,突变体F247Y对底物Glc NAc/Gal NAc及ATP的催化活性均高于野生型。【结论】通过定点突变,确定了对Nah K催化活性有影响的4个位点,并且获得了一个催化效率提高的突变体(F247Y),为进一步对Nah K进行分子改造奠定了一定基础。     

短链壬基酚聚氧乙烯醚脱氢酶脱氢催化机理

【目的】为研究短链壬基酚聚氧乙烯醚脱氢酶(sNPEO-DH)的脱氢氧化机制(基因克隆于Ensifer sp.AS08),我们进行了以下实验。【方法】采用同源序列比对及同源建模的方法筛选出与其辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)异咯嗪基邻近的4个氨基酸残基。以定点突变方法分别构建了突变体,并进行了重组蛋白的表达纯化和酶活力测定。【结果】野生型和突变体的酶学动力学实验表明,突变体N90A和N509A对亲水性底物聚乙二醇(PEG1000)的相对活性分别降低为51%和89%,对疏水性底物sNPEO的活性分别降低为26%和40%,说明氨基酸残基N90和N509可能与底物的结合相关。突变体H465A的相对活性丧失了90%以上,突变体N507A完全丧失活性;瞬时"停-流"检测实验进一步证明N507A突变体阻断了底物向FAD传递质子的过程,突变体H465A阻断了对FAD还原形成的FADH2脱氢再生的过程。【结论】以上结果说明N507和H465为sNPEO脱氢酶活性中心中参与对底物氧化脱氢及FADH2脱氢再生进行下一次反应的催化位点。     

全细胞高通量筛选a-氨基酸酯水解酶突变体的方法

【目的】建立高效敏感的高通量筛选方法,用于筛选头孢克洛合成活性提高或热稳定性提高的a-氨基酸酯水解酶。【方法】根据头孢克洛在碱性条件下水解生成的衍生物在340 nm处有特征吸收峰的原理,制作出标准曲线。采用全细胞96孔板紫外分光光度法高通量测定a-氨基酸酯水解酶突变体的头孢克洛合成活性。【结果】头孢克洛含量与△A340?405在0.1?0.6×10?3 mol/L浓度范围内有良好的线性关系, 服从朗伯-比尔定律, 平均回收率为99.8%?101.3％。一轮定点饱和突变产生的2 300个克隆经该方法的筛选, 获得3株kcat提高40%以上, 4株半失活温度较野生型提高5 °C以上的突变体酶。【结论】该方法准确可靠,每天筛选量可达到2 000个反应, 达到高通量筛选要求。     

全细胞高通量筛选α-氨基酸酯水解酶突变体的方法

【目的】建立高效敏感的高通量筛选方法,用于筛选头孢克洛合成活性提高或热稳定性提高的α-氨基酸酯水解酶。【方法】根据头孢克洛在碱性条件下水解生成的衍生物在340 nm处有特征吸收峰的原理,制作出标准曲线。采用全细胞96孔板紫外分光光度法高通量测定α-氨基酸酯水解酶突变体的头孢克洛合成活性。【结果】头孢克洛含量与△A340?405在(0.1?0.6)×10?3 mol/L浓度范围内有良好的线性关系,服从朗伯-比尔定律,平均回收率为99.8%?101.3%。一轮定点饱和突变产生的2 300个克隆经该方法的筛选,获得3株kcat提高40%以上,4株半失活温度较野生型提高5°C以上的突变体酶。【结论】该方法准确可靠,每天筛选量可达到2 000个反应,达到高通量筛选的要求。     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶突变体Q316P的酶学性质

【目的】对北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)进行改造,期望获得具有较高酶活力且酶活性质改善的高产天冬氨酸族氨基酸的优良突变株,并削弱甚至解除Thr对AK的反馈抑制作用。【方法】利用定点突变技术对Gln(Q)316位点进行突变,高通量筛选获得活力提高明显的突变体,并将其在大肠杆菌BL21中高效表达,对野生型(Wild type,WT)和突变体Q316P AK用镍柱纯化,进行酶动力学及酶学性质研究。【结果】获得突变体Q316P,并在大肠杆菌BL21中成功表达。与野生型相比,突变体Q316P的V_(max)提高8.53倍,n值由2.15降低为1.29,正协同性减弱;最适温度由25°C升高至30°C;最适p H由8.0降低至7.5,半衰期由3.8 h延长至5.0 h;且在实验范围浓度内,底物抑制剂苏氨酸对突变体Q316P表现出激活作用;Q316P AK对金属离子K+和有机溶剂甲醇表现出良好抗性。【结论】获得酶活力提高、酶学性质改善的突变体,并一定程度上解除苏氨酸对AK的反馈抑制,为构建高产天冬氨酸族氨基酸工程菌提供参考。     

定向进化提高灰盖鬼伞过氧化物酶染织废水脱色效率

【目的】获得染织废水脱色能力增强的灰盖鬼伞过氧化物酶。【方法】使用基因合成及定点突变平台合成突变灰盖鬼伞过氧化物酶基因CIPmt4(I49S、V53A、M166F和M242I),并调整密码子至毕赤酵母偏好性。以CIPmt4为模板进行定向进化,经过三轮易错PCR和高通量筛选得到一个酶学性质显著改善的突变体(CIPmt5)。通过3D建模和分子动力学模拟分析蛋白的结构及热稳定性,并进一步研究CIPmt5和野生型CIP对刚果红、氨基黑、甲基橙、次甲基蓝、苯胺蓝、结晶紫、溴酚蓝共7种染料的脱色能力。【结果】序列分析显示该突变体积累了I49S、V53A、T121A、M166F和Y272F共5个氨基酸突变,与野生型灰盖鬼伞过氧化物酶相比,以ABTS为底物酶活性是野生型的2.01倍(24.44 U/mg),最适反应p H由5.0提高到6.5,最适反应温度由25°C提高到45°C。除次甲基蓝外对其它染料脱色的最适p H都往中、碱性方向偏移,脱色率普遍高于野生型。模型分析显示CIPmt5活性中心更开放,热稳定性增强。【结论】突变体酶CIPmt5能够更好地替代野生型灰盖鬼伞过氧化物酶应用于染织业染料脱色、化工废水和染织废水的生物修复。     

内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶关键氨基酸位点的改造提高对烷基取代2-酮酸的催化活力

【背景】高效实现D-氨基酸的生物合成一直是人们关注的热点。内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-diaminopimelate dehydrogenase,DAPDH)能够直接催化2-酮酸和氨合成D-氨基酸。【目的】提高DAPDH对烷基取代2-酮酸的催化活力,并解释其催化机制。【方法】以来源于嗜热共生杆菌(Symbiobacteriumthermophilum)的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)为模板,在前期结构分析结合被选择位点突变结果的基础上,确定对H227位进行定点饱和突变,并以D-丙氨酸、D-2-氨基丁酸、D-正缬氨酸、D-谷氨酸为底物进行筛选。【结果】获得突变体H227Q和H227N。突变体H227Q对丙酮酸、2-氧代丁酸、2-氧代戊酸、2-酮戊二酸的比活力比野生型分别提高了10.9、11.5、8.6和7.6倍。动力学参数表明,突变体H227Q同时提高了酶对底物的亲和力及催化常数,使其对丙酮酸的催化效率(k_(cat)/K_m)相较于野生型提高了9.4倍。利用分子模拟技术分析突变体H227Q与产物氨基酸之间的相互作用表明,227位的谷氨酰胺通过与氨基酸的羧酸形成氢键,使得氨基酸产物Cα上的氢和辅酶烟酰胺环C4原子之间的距离缩短。【结论】利用定向进化技术提高DAPDH对烷基取代2-酮酸的催化活力,有助于开发新型的高效生物催化剂,这些工作也为下一步继续进行更具挑战性的D-氨基酸研究提供了基础。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。