非洲猪瘟病毒内囊膜蛋白p17与宿主互作蛋白的初步鉴定

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的感染导致猪的死亡率高达100%,给养猪业造成毁灭性灾难。因此,开展针对ASFV感染复制的研究有着重大的意义。目前发现ASFV有超过150个开放阅读框,其中D117L基因编码的内囊膜蛋白p17参与病毒二十面体结构的形成,但是对p17调控宿主细胞功能的机制知之甚少。研究通过免疫沉淀技术联合蛋白质谱分析,初步筛选出与ASFV p17潜在的宿主互作蛋白。通过进一步免疫共沉淀技术和激光共聚焦实验确认了p17与线粒体外膜蛋白TOMM70(translocase of outer mitochondrial membrane 70)、热休克蛋白HSPA8(heat shock 70 kDa protein 8)的互作。该研究为进一步探索p17在ASFV感染过程中的功能提供了重要信息。     

非洲猪瘟病毒编码蛋白功能研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪或野猪引起的一种急性、出血性、高度接触性传染病,其特征是病程短、高热和出血性病变,急性感染死亡率高达100%,严重威胁全球养猪业但目前尚未开发出有效的疫苗和治疗方法。ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员,为大型双链DNA病毒,主要在巨噬细胞胞质中复制,其基因组约170?193 kb,含有150?167个开放阅读框,编码150?200种蛋白质。目前已知功能的病毒编码蛋白约有50个,大部分为病毒的结构蛋白,仍有一半以上的ASFV编码蛋白功能尚不清楚。除结构蛋白以外,病毒含有完整的酶和与病毒转录有关的因子,编码调节宿主细胞功能及与病毒免疫逃逸相关的蛋白等。本文综述了ASFV的结构蛋白、非结构蛋白以及参与免疫逃逸等相关蛋白功能的研究进展,以期为ASFV病毒蛋白研究及疫苗研发提供相关借鉴。     

非洲猪瘟病毒及其衣壳蛋白CD2v研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起的严重急性、出血性、烈性传染病,病死率可达100％.2018年我国发生首例非洲猪瘟疫情,并迅速蔓延,给我国生猪产业造成数百亿元的经...     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

2018年8月我国发现非洲猪瘟(African swine fever,ASF),并在多地蔓延,由于尚无疫苗和有效的治疗方法,病死率高达100%,给养猪业带来巨大的损失。目前控制该病,主要依靠快速、准确的诊断方法,尽早发现、处理,防止扩散。为制备特异性的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p54蛋白单克隆抗体,本研究利用大肠杆菌表达ASFV p54蛋白C端胞内区片段,构建能表达ASFV p54蛋白的工程菌E.coli BL21/pET-p54,经IPTG诱导表达可溶性的p54蛋白。用纯化后的可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经4次筛选和3次亚克隆获得了21株分泌ASFV p54蛋白单克隆抗体的细胞株。通过ELISA测定腹水效价,结果均在1︰40 000～1︰5 120 000范围之内。以免疫组织化学染色法鉴定单克隆抗体,结果有9株可以特异性检出ASFV抗原。对免疫组化阳性的单克隆抗体进行亚类鉴定,结果 5株为IgG1,4株为IgG2a。以免疫印迹试验(Western Blot)和间接免疫荧光法(Indirect ...     

非洲猪瘟病毒CP204L基因的原核表达与单抗制备

由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的非洲猪瘟(ASF)给我国养猪业带来了不可估量的经济损失,严重阻碍了我国养猪业的发展,研发ASFV快速诊断试剂是目前最重要的内容之一。CP204L基因编码ASFV结构蛋白p30。本研究以克隆ASFV的CP204L基因为基础,通过基因重组技术,加入His标签,将构建的重组质粒命名为pET-28a-CP204L。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,37℃经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达6h,表达蛋白进行SDS-PAGE鉴定和Western Blot检测。重组蛋白纯化后免疫小鼠制备筛选单克隆抗体,Western Blot和IFA验证单抗的结合特异性。结果表明,重组的pET-28a-CP204L诱导后表达蛋白为30kD,以不可溶性包涵体形式存在;表达蛋白利用His标签进行纯化,获得纯化蛋白2mg,单克隆抗体筛选获得5株IgG亚型的ASFV p30蛋白的单抗,且均具有良好的结合活性。本研究为发展ASFV检测方法提供了基础。     

非结构蛋白在非洲猪瘟病毒感染中作用

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、出血性猪传染病,给疫情发生国家(地区)的养猪业造成重大经济损失.ASFV为双股DNA病毒,基因组含有150～167个开放阅读框(ORFs),可编码150～200种蛋白质,其中非结构蛋白有100余种.ASFV编码的酶、转录因子、调节宿主细胞功能蛋白和病毒免疫逃逸相关蛋白等作为重要的非结构蛋白,在病毒核苷酸代谢、DNA复制、修复、转录、蛋白修饰以及病毒与宿主细胞相互作用等过程中发挥重要作用,但仍有许多非结构蛋白的功能尚不明晰.因此,本文综述了 ASFV非结构蛋白在病毒感染中的作用,以期为ASFV非结构蛋白的进一步研究提供参考.     

猪流行性腹泻病毒非结构蛋白nsp9互作宿主蛋白对病毒复制的影响

猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)导致仔猪和育肥猪发生急性肠道传染病，是危害养猪业最重要的病原体之一。目前发现PEDV能够编码至少16个非结构蛋白，其中nsp9能够结合至单链RNA中，但是其功能机制还不清楚。本研究通过免疫沉淀联合蛋白质谱分析，筛选出潜在的与PEDV nsp9宿主互作蛋白。通过进一步免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)和激光共聚焦技术确认了nsp9与热休克蛋白HSPA8、Toll相互作用蛋白Tollip、热休克蛋白HSPA9、线粒体外膜蛋白TOMM70互作。其中，过表达HSPA8使nsp9的表达量先上调而后下调，并促进PEDV的增殖；过表达Tollip使nsp9的表达量显著上调，并抑制PEDV的增殖；过表达TOMM70使nsp9的表达量显著下调，但对PEDV的增殖无明显影响；过表达HSPA9对nsp9的表达以及PEDV的增殖均无明显影响。该研究为探索nsp9互作蛋白在PEDV感染过程中的功能提供了重要信息。     

非洲猪瘟病毒p35蛋白作为诊断抗原的抗原性比较

为了筛选出酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)反应性最佳的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)诊断抗原,通过建立ELISA方法,以杆状病毒昆虫细胞表达系统表达的ASFV p30蛋白诊断抗原为参照,首次探讨原核表达系统表...     

与猪流行性腹泻病毒M蛋白互作的宿主蛋白的鉴定

【背景】猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)膜蛋白(M)在病毒粒子的组装、膜融合和病毒复制等方面具有重要的作用,但M蛋白与宿主细胞的互作机制尚不清楚。【目的】利用免疫沉淀技术和液质联用技术筛选细胞内与PEDVM蛋白相互作用的蛋白,为揭示M蛋白在病毒增殖过程中发挥的功能提供研究基础。【方法】将MOI=0.1的PEDV DR13疫苗株接种于长成单层的Vero细胞,感染36 h后,收集细胞并进行裂解。利用抗M的单克隆抗体沉淀与M相互作用蛋白复合物,通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行鉴定并利用细胞功能富集分析(Gene ontology,GO)对感染组鉴定到的细胞蛋白进行分析,确定两个细胞内源性蛋白为候选蛋白,进行免疫共沉淀(Co-IP)验证和共定位分析。【结果】基于鉴定蛋白的肽段数的方法分析显示,感染组与对照组相比,鉴定了218个与M蛋白相互作用的细胞内源性蛋白,分别与蛋白质合成、代谢、细胞信号通路转导等密切相关,选择细胞分裂周期蛋白42 (Cell division cycle 42,CDC42)、真核翻译起始因子3亚基L蛋白(eIF3L)为候选蛋白进行Co-IP(Co-immunoprecipitation)验证和共定位分析,结果证实CDC42、eIF3L蛋白分别与M蛋白在细胞内存在相互作用。【结论】鉴定出PEDV M蛋白能够与宿主细胞CDC42和eIF3L蛋白相互作用,并鉴定出其他可能与M蛋白发生相互作用的宿主蛋白60个,为开展PEDV与宿主细胞蛋白相互作用研究提供了重要理论依据。     

Regulation of antiviral immune response by African swine fever virus (ASFV)

African swine fever (ASF) is a highly contagious and acute hemorrhagic viral disease with a high mortality approaching 100% in domestic pigs. ASF is an endemic in countries in sub-Saharan Africa. Now, it has been spreading to many countries, especially in Asia and Europe. Due to the fact that there is no commercial vaccine available for ASF to provide sustainable prevention, the disease has spread rapidly worldwide and caused great economic losses in swine industry. The knowledge gap of ASF virus (ASFV) pathogenesis and immune evasion is the main factor to limit the development of safe and effective ASF vaccines. Here, we will summarize the molecular mechanisms of how ASFV interferes with the host innate and adaptive immune responses. An in-depth understanding of ASFV immune evasion strategies will provide us with rational design of ASF vaccines.     

A simple nanobody-based competitive ELISA to detect antibodies against African swine fever virus

African swine fever virus (ASFV) infection is a big threat to the global pig industry. Because there is no effective vaccine, rapid, low-cost, and simple diagnosis methods are necessary to detect the ASFV infection in pig herds. Nanobodies, with advantages of small molecular weight and easy genetic engineering, have been universally used as reagents for developing diagnostic kits. In this study, the recombinant ASFV-p30 was expressed and served as an antigen to immunize the Bactrian camel. Then, seven nanobodies against ASFV-p30 were screened using phage display technique. Subsequently, the seven nanobodies fused horseradish peroxidase (nanobody-HRP) were secretory expressed and one fusion protein ASFV-p30-Nb75-HRP was selected with the highest sensitivity in blocking ELISA. Using the ASFV-p30-Nb75-HRP fusion protein as a probe, a competitive ELISA (cELISA) was developed for detecting anti-ASFV antibodies in pig sera. The cut-off value of cELISA was determined to be 22.7% by testing 360 negative pig sera. The detection limit of the cELISA for positive pig sera was 1:320, and there was no cross-reaction with anti-other swine virus antibodies. The comparative assay showed that the agreement of the cELISA with a commercial ELISA kit was 100%. More importantly, the developed cELISA showed low cost and easy production as a commercial kit candidate. Collectively, a simple nanobody-based cELISA for detecting antibodies against ASFV is developed and it provides a new method for monitoring ASFV infection in the pig herds.     

非洲猪瘟病毒C717R蛋白诱导小鼠炎症应答

【目的】通过炎症应答系统筛选,发现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV) C717R蛋白可诱导炎症反应,本研究旨在首次鉴定C717R蛋白功能,通过构建C717R重组慢病毒并感染BALB/c小鼠,探究其对炎症应答产生的影响。【方法】通过炎症小体表达系统筛选出诱导炎症应答的C717R蛋白,并构建C717R重组慢病毒。利用C717R重组慢病毒感染小鼠,使C717R在小鼠组织中表达。经实时荧光定量、蛋白质免疫印迹等方法检测C717R慢病毒包装、蛋白表达以及促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-β的变化。【结果】C717R蛋白在小鼠组织中正常表达。酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测发现,表达C717R蛋白的小鼠,血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-β及IFN-γ分泌水平显著升高。实时荧光定量检测表达C717R蛋白的小鼠组织证实,C717R、TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA转录水平显著上调;蛋白质免疫印迹证实,C717R可诱导小鼠不同组织caspase-1和IL-1β的成熟。组织病理切片结果显示,表达C717R蛋白的BALB/c小鼠和对照组和相比,肝脏、心脏、肺脏等器官炎性细胞浸润程度较对照组更严重。【结论】ASFV的C717R蛋白表达诱导BALB/c小鼠产生炎症应答,为鉴定和阐明C717R蛋白介导的促炎新机制提供了重要依据。     

非洲猪瘟病毒的生物学特性与疫苗研制的难点

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种猪烈性传染病,是全球养猪业的"头号杀手",强毒株引发的超急性和急性感染死率高达100%。2018年8月ASF首次传入我国,截止2019年6月6日,已有32个省份累计暴发137起疫情,给我国社会、经济构成巨大威胁。ASF疫苗的研制始于20世纪60年代,但均以失败而告终,其主要原因是对ASFV生物学特性缺乏深入的研究。有效控制当前ASF疫情扩散、研制安全有效的疫苗将是我国面临的巨大挑战。本文对ASFV形态与基本结构、传播途径、致病机制、基因组及编码蛋白、入侵机制、免疫逃逸等生物学特性进行了概述,并分析了当前疫苗研制面临的难点,以期为我国有效控制ASF疫情及病原研究提供参考。     

非洲猪瘟病毒的免疫逃逸策略

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种猪烈性传染病。目前无商品化的ASF疫苗,一旦发病,仅能依靠快速扑杀进行防控,严重威胁我国养猪及相关行业的健康发展。ASF疫苗研发面临的主要困难是对ASFV的毒力相关基因、致病及其免疫逃逸机制知之甚少。本文对ASFV的免疫逃逸研究进行了总结,探讨了ASFV免疫逃逸基因及其编码蛋白的功能,以便加深对ASFV及其免疫逃逸策略的认知,为致病机制研究和疫苗研发提供借鉴。     

African swine fever virus cysteine protease pS273R inhibits pyroptosis by noncanonically cleaving gasdermin D

African swine fever (ASF) is a viral hemorrhagic disease that affects domestic pigs and wild boar and is caused by the African swine fever virus (ASFV). The ASFV virion contains a long double-stranded DNA genome, which encodes more than 150 proteins. However, the immune escape mechanism and pathogenesis of ASFV remain poorly understood. Here, we report that the pyroptosis execution protein gasdermin D (GSDMD) is a new binding partner of ASFV-encoded protein S273R (pS273R), which belongs to the SUMO-1 cysteine protease family. Further experiments demonstrated that ASFV pS273R-cleaved swine GSDMD in a manner dependent on its protease activity. ASFV pS273R specifically cleaved GSDMD at G107-A108 to produce a shorter N-terminal fragment of GSDMD consisting of residues 1 to 107 (GSDMD-N_1–107). Interestingly, unlike the effect of GSDMD-N_1–279 fragment produced by caspase-1-mediated cleavage, the assay of LDH release, cell viability, and virus replication showed that GSDMD-N_1–107 did not trigger pyroptosis or inhibit ASFV replication. Our findings reveal a previously unrecognized mechanism involved in the inhibition of ASFV infection-induced pyroptosis, which highlights an important function of pS273R in inflammatory responses and ASFV replication.     

非洲猪瘟病毒E248R蛋白抑制cGAS-STING介导的天然免疫

为了探究ASFV E248R蛋白调控cGAS-STING信号通路的机制,利用双荧光素酶报告系统验证ASFV E248R蛋白够剂量依赖性地抑制cGAS-STING和HT-DNA诱导的IFN-β的产生。通过相对定量PCR技术验证,过表达E248R抑制IFNB1、RANTES、IL-6和TNF-αβ基因的转录水平。免疫共沉淀和激光共聚焦试验结果表明,E248R与STING相互作用。通过蛋白印迹试验证实,过表达E248R可抑制STING的表达。研究表明ASFV E248R蛋白通过抑制STING的表达拮抗天然免疫应答。该结果将扩展对ASF免疫逃逸的认知,为疫苗的研制提供新的思路。