小桐子低温诱导查耳酮合酶基因的克隆及其表达分析

为了解查耳酮合酶在小桐子(Jatropha curcas)抗冷性形成中的作用, 基于小桐子低温锻炼转录组和数字基因表达谱数据, 克隆了低温新诱导表达的小桐子查耳酮合酶基因(JcCHS), 并分析了该基因的表达特性和功能。结果表明, JcCHS 基因的cDNA全长为1386 bp, 包含完整开放阅读框(ORF) 1170 bp, 编码389个氨基酸, JcCHS的理论分子量为42.2 kDa、等电点为6.53, 与蓖麻CHS 蛋白序列的相似性高达93.6%, 具有III 型聚酮合酶家族保守的查耳酮合酶/ 对苯乙烯合酶结构域。半定量RTPCR分析表明, JcCHS 在小桐子各组织中都有表达, 其中根的表达量较高。JcCHS 基因的表达能在一定程度上提高重组酵母菌的低温抵抗能力, 这说明JcCHS 基因可能参与了小桐子的抗低温响应。     

刺盘孢菌的蛋白互作预测及侵染早期共表达模块分析

刺盘孢菌是一类重要的植物病原真菌,在全球范围内危害众多单双子叶植物。有许多研究对病菌的侵染模式进行了探索,但仍未阐明其确切的分子机制。本研究在预测病菌蛋白互作的基础上,结合表达谱数据对病菌在活体生存环境下的共表达模块进行挖掘和分析,以期为分子机制的研究提供新的线索。通过同源映射法和结构域法,预测得到刺盘孢菌的4 288个蛋白之间存在41 700个潜在互作,其中39 776个互作发生于异源蛋白之间,1 924个互作发生于同一蛋白内。将蛋白互作数据分别与4个表达谱数据进行整合,构建得到离体I、离体II、活体I和活体II 4个共表达互作组。对离体和活体互作组的共有基因的表达水平进行比较分析,结果表明,与离体互作组相比,活体互作组中与翻译、蛋白代谢等有关的基因表达水平下降,与离子转运、糖物质转运等有关的基因表达水平上升,暗示了物质转运在刺盘孢菌侵染早期的重要作用。进一步对活体互作组进行模块化分析,结果表明,活体I和活体II的特异模块分别与胁迫响应、肌动蛋白纤维长度调控有关,其中胁迫响应子网是以热激蛋白Hsp70为核心的互作簇,可能参与病菌对寄主的识别与对抗;肌动蛋白纤维长度调控子网则可能与病菌菌丝在寄主细胞间的延伸有关。     

小桐子JcCIPK2基因的克隆与表达分析

钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase, CIPK)是一类植物中特有的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,参与多种生物和非生物胁迫响应过程。该实验通过RT-PCR克隆了小桐子(Jatropha curcas L.)JcCIPK2基因cDNA全长序列,采用荧光定量qRT-PCR分析JcCIPK2基因在不同组织及不同处理(12℃和1℃低温、42℃高温、30%PEG、250 mmol/L NaCl、150μmol/L ABA)下的表达模式。结果显示:(1)小桐子JcCIPK2基因开放阅读框全长1 398 bp,编码465个氨基酸,相对分子量为52.95 kD,等电点为8.89。(2)蛋白质结构分析表明,JcCIPK2的N端含有位于第11～265个氨基酸之间的丝氨酸/苏氨酸激酶_蔗糖非发酵-1型相关蛋白激酶3催化域STKc_SnRK3,在激酶结构域内还具有激活环(Activation Loop);C端含有位于第316～430个氨基酸之间的CIPK蛋白激酶调控域CIPK_C,其调控域中含有CIPK家族典型的能与CBL特异性结合的NAF结构域,位于第314～369个氨基酸之间。(3)系统进化分析显示,小桐子JcCIPK2蛋白与同属于大戟科的木薯(Manihot esculenta Crantz.)同源关系最近,序列一致性达87%。(4)qRT-PCR分析表明,JcCIPK2基因在小桐子根、茎、叶中均有表达,经12℃和1℃低温处理后,叶片中JcCIPK2基因的表达都呈现先上调后下调表达的趋势,且都在低温处理24 h的表达量最高,与对照相比分别上调了6.0倍和16.72倍;小桐子JcCIPK2基因在42℃高温、30%PEG、150μmol/L ABA、250 mmol/L NaCl处理下也受到不同程度的诱导表达。研究推测,JcCIPK2基因在小桐子对逆境的响应与适应中起重要作用。     

小桐子糖原合成激酶基因JcGSK的克隆与表达分析

以小桐子(Jatropha curcas L.)cDNA为模版,克隆了JcGSK基因的CDS序列。序列分析表明,JcGSK基因包含1 230bp完全阅读框(ORF),编码409个氨基酸。预测其编码蛋白质的相对分子量为46.33kD,理论等电点为8.58。Blast搜索结果及进化分析结果表明,JcGSK蛋白与巴西橡胶树GSK蛋白的氨基酸序列一致性最高(94%)且亲缘关系最近;JcGSK基因编码的蛋白具有一个蛋白激酶特有的结构域。组织表达结果显示,JcGSK基因在小桐子根、茎、叶、花、果皮和种子中都有表达,且在根中表达量最高。小桐子幼苗在NaCl、ABA、PEG、低温和机械损伤处理后JcGSK基因表达量有不同程度的上调,推测其参与小桐子非生物胁迫响应和信号传导过程。JcGSK基因在种子中也有较高表达,在种子发育过程中表达量的变化与种子生长发育趋势基本一致,推测JcGSK基因也参与调控小桐子种子的生长发育。     

基于蛋白互作网络识别非小细胞肺癌相关基因功能模块

本研究对非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)基因表达数据进行差异表达分析,并与蛋白质相互作用网络(PPIN)数据进行整合,进一步利用Heinz搜索算法识别NSCLC相关的基因功能模块,并对模块中的基因进行功能(GO term)和通路(KEGG)富集分析,旨在探究肺癌发病分子机制。蛋白互作网络分析得到一个包含96个基因和117个相互作用的功能模块,以及8个对NSCLC的发生和发展起到关键作用候选基因标志物。富集分析结果表明,这些基因主要富集于基因转录催化及染色质调控等生物学过程,并在基础转录因子、黏着连接、细胞周期、Wnt信号通路及HTLV-Ⅰ感染等生物学通路中发挥重要作用。本研究对非小细胞肺癌相关的基因和生物学通路进行预测,可用于肺癌的早期诊断和早期治疗,以降低肺癌死亡率。     

复苏植物旋蒴苣苔早期光诱导蛋白的特征分析

随着全球气候变暖,旱胁迫越来越成为粮食生产的严重威胁。探索复苏植物耐受极端旱胁迫的机理,积累抗旱相关基因资源,对于植物适应逆境的基础研究,和农业可持续发展,均有重要的作用。旋蒴苣苔(B. hygrometrica)广泛分布于我国山区,是复苏植物的代表性物种,而且有高质量的全基因组序列可以分析利用。本研究对旋蒴苣苔(B. hygrometrica)基因组中的早期光诱导蛋白(ELIPs)基因家族进行挖掘和分析。旋蒴苣苔(B. hygrometrica)基因组中早期光诱导蛋白(ELIPs)基因的数目远高于其他植物(拟南芥,水稻,辣椒,番茄)。系统发育分析显示,早期光诱导蛋白(ELIPs)基因序列具有很高的植物特异性。这说明,早期光诱导蛋白(ELIPs)基因对不同植物进化和适应各自的生长环境具有重要的作用。对处于不同程度干旱状态的旋蒴苣苔(B. hygrometrica)叶片的基因表达分析,表明一部分早期光诱导蛋白(ELIPs)基因表现出很强的对旱处理的响应。不同的早期光诱导蛋白(ELIPs)基因表现出三种不同的响应模式。这些结果表明,旋蒴苣苔(B. hygrometrica)早期光诱导蛋白(ELIPs)基因参与植株应对旱胁迫,而且有精细的调控机制控制不同早期光诱导蛋白(ELIPs)基因的表达量。     

小桐子非特异性脂质转移蛋白A的基因克隆及其表达和功能分析

基于我们最近获得的小桐子低温驯化转录组和数字基因表达谱数据,本工作研究了低温驯化条件下差异表达变化较大的非特异性脂质转移蛋白A基因JcnsLTPA。克隆到该基因的cDNA序列全长833 bp,开放阅读框长度513 bp,编码170个氨基酸,存在ATT_LTSS典型保守功能基序。其启动子区域中鉴定到了TATA框、CAAT框、CATA框、W框等顺式作用元件以及CRT/DRE低温响应元件。半定量RT-PCR分析表明,该基因在茎、根、叶中都有表达,以茎中表达量最高、且受低温诱导最显著。同时,酵母表达JcnsLTPA也提高了重组酵母菌的抗低温能力。这些结果充分说明了小桐子JcnsLTPA是与抗冷性密切相关的基因,可以用于小桐子的抗冷性遗传改良。     

霍乱弧菌ToxS蛋白间的互作增强ToxR蛋白诱导毒力基因的表达

【目的】阐明霍乱弧菌ToxR蛋白功能调控的分子机制。【方法】利用巯基捕获(thiol-trapping)的方法分析DsbA蛋白对ToxR周质空间结构域半胱氨酸残基的氧化作用;采用定点突变的方法构建ToxR半胱氨酸突变株(ToxR_(C236/293S));利用荧光素酶基因作为报告基因分析ToxR野生型(ToxR_(wt))和半胱氨酸突变体(ToxR_(C236/293S))诱导下游基因表达的活性;通过细菌双杂交系统分析ToxR_(wt)和ToxR_(C236/293S)蛋白之间、ToxR与ToxS之间以及ToxS之间的相互作用。【结果】ToxR周质空间结构域半胱氨酸残基确实可以被DsbA蛋白氧化,且当ToxR与ToxS共表达时,ToxR诱导ctxAB转录表达的活性显著增强,且在dsbA基因缺失突变株中ToxR诱导ctxAB转录表达的活性更高;成功构建株霍乱弧菌ToxR半胱氨酸突变株(ToxR_(C236/293S)),在没有ToxS存在的条件下,ToxR_(C236/293S)诱导毒力基因表达的活性与ToxRwt相当;细菌双杂交系统分析发现当ToxR与ToxS共转录表达时,ToxS极大增强ToxR蛋白之间的互作;在dsbA基因缺失突变株中,ToxS之间的相互作用显著增强。【结论】ToxR蛋白本身的氧还状态对其诱导毒力基因表达的活性没有影响;ToxS通过增强ToxR形成二聚体的能力从而增强其诱导毒力基因的表达,而DsbA对ToxS蛋白之间的相互作用具有抑制作用,DsbA通过影响ToxS的蛋白互作从而影响ToxR蛋白的功能。本文为进一步阐明霍乱弧菌毒力基因表达调控的分子机制提供重要的理论依据。     

小桐子甘油-3-磷酸酰基转移酶（JcGPAT）cDNA的克隆与序列分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶是植物生物合成储存油脂过程中的关键酶,对油料作物种子含油量具有重要的限制作用。本研究以植物甘油-3-磷酸酰基转移酶同源基因的保守区域序列为基础,设计简并引物,结合RACE技术,从能源植物小桐子种子中克隆获得JcGPAT基因的cDNA全长序列（GenBank登录号HQ395225）。JcGPAT cDNA核苷酸序列长度为1672bp,开放阅读框为1125bp,编码375个氨基酸。该基因具有明显的GPAT基因结构域,其编码的氨基酸序列与油桐、蓖麻等植物具有很高的同源性。RT-PCR表达分析表明,该基因在小桐子发育的种子、叶、根尖等多个组织表达。     

CsPPR和CsCPN60-like在茶树白化叶片中的表达分析及互作蛋白验证

本课题组前期通过转录组筛选出2个与‘白鸡冠’茶树（Camellia sinensis）叶片白化相关的基因（CSS0013384和CSS0036305）,为探明CSS0013384和CSS0036305在白化茶树中的表达模式与其互作蛋白,以‘白鸡冠’茶树叶片为材料,克隆CSS0013384和CSS0036305 cDNA全长序列,利用生物信息学、酵母单杂交和酵母双杂交,分析其蛋白理化性质、系统进化树、染色体定位、基因结构、蛋白结构、蛋白调控与互作网络和基因表达模式。生物信息学分析结果表明,CSS0013384和CSS0036305分别属于三角状五肽蛋白（pentatricopeptide repeat protein, PPR）和伴侣蛋白（chaperone, CPN60-like）家族,其蛋白质编码区（coding sequence, CDS）长度为1 893 bp和1 752 bp,编码氨基酸个数为631和575,蛋白质质量为71.87 kD和60.79 kD,等电点为8.93和6.21。亚细胞定位预测结果表明,CSS0013384定位于叶绿体,CSS0036305定位于线粒体。通过...     

麻疯树脂酶全长基因克隆、表达及其蛋白质结构预测

脂酶(Lipase,EC3.1.1.3)是普遍应用于皮革、饲料及生物柴油工业的工业酶制剂,具有广泛的应用价值。目前对植物来源的脂酶研究较少。本研究用在生物柴油中具有应用前景的油料植物——麻疯树(Jatrophacurcas)作为研究对象,克隆了该物种的脂酶基因(JcLIP)。通过多序列比对并结合物种的亲缘关系设计了具有较高特异性的简并引物,通过使用RT-PCR和RACE技术,最终获得了麻疯树脂酶基因的全长序列并成功地在大肠杆菌中表达,酶活测定结果表明,麻疯树脂酶在大肠杆菌中表达在包涵体中,但是能产生具有活力的蛋白质,酶活约为0.8U.mL-1。结构预测和比较表明,JcLIP蛋白质具有脂酶的结构核心和催化活性中心,而在非核心区具有较毛霉脂酶更多的插入和随机卷曲,这可能是决定二者之间酶活差异的重要原因。     

一个麻疯树RING型锌指蛋白基因JcRFP1的克隆及表达

首次从麻疯树胚乳cDNA丈库中克隆得到一个RJNG型锌指蛋白基（GenBank登录号为JF920726）,命名为JcRFP1。该cDNA长度为728bp,包含编码JcRFP1蛋白的完整开放阅读框（516bp）。脚,基因在麻疯树各器官中均检测到表达且表达量依次为：叶〉茎〉花〉果实〉种子〉根。将克隆到的JcRFP1基因的cDNA序列连接到表达载体pET32a（＋）上,导入BL21（DE3）pLysS菌株,成功诱导表达相对分子质量为33．2kDa的可溶性融合蛋白。该融合蛋白免疫新西兰大白兔,得到效价为1：6500的抗血清。研究表明,JcRFP1蛋白具有体外泛素连接酶E3活性,在麻疯树体内可能参与油菜素甾醇信号转导途径。     

麻疯树中ADP核糖基化因子基因的克隆和表达

从麻疯树cDNA文库中筛选到包含完整编码序列的ADP核糖基化因子的cDNA序列,命名为Jc-arf．其长度为887bp,开放阅读框546bp,推测的编码蛋白含181个氨基酸残基,具有典型的GTP结合蛋白家族的特点：P框（GLDAAGKT）、G’框（DVGGQ）和G框（NKQDL）。序列分析显示,Jc-arf矿接近于人类ClassI型arf基因,其蛋白序列与多种植物ARF有很高的同源性。半定量RT-PCR结果显示,Jc-arf的表达具有一定的组织特异性,在花中最丰富。PEG、低温、NaCl胁迫下,Jc-arf的表达受PEG和低温的诱导,而对NaCl胁迫不敏感。     

麻疯树MIPS基因启动子的分离及在烟草原生质体中瞬时表达活性分析

根据麻疯树MIPS基因序列,设计特异性的巢式引物,运用TAIL-PCR法两次步移得到MIPS基因5＇端侧翼序列,序列分析显示含有多个胁迫应答相关元件,如ABRE、HSE等。以该序列为基础,PCR扩增得到5个5＇端不同长度的缺失片段,分别插入pBI221载体置换CaMV35S启动子,构建的表达载体在PEG介导下转入烟草叶片原生质体进行瞬时表达,检测GUS报告基因的活性。经GUS活性荧光定量检测发现,分离到的MIPS基因侧翼序列5＇端不同缺失片段都能启动GUS报告基因表达,启动活性最高的是WQ1区（-565bp）,核心区位于-565～-449bp。在100μmol·L-1ABA诱导下启动活性增强,但不同区段的增长幅度不同。WQ1区增长幅度最大,比未处理时提高41.4%。     

麻疯树核糖体失活蛋白基因的克隆和表达

麻疯树(Jatropha curcas L.)核糖体失活蛋白(curcin)是存在于麻疯树种子中的一种毒性较强的蛋白,它与蓖麻毒蛋白和相思子毒蛋白的性质相似,属Ⅰ型核糖体失活蛋白。从麻疯树种子中分离得到一种分子量为28.2kD的蛋白质,其对无细胞系统中蛋白质合成的抑制活性较强,IC_(50)为(0.19±0.01)nmol/L,具有RNA N-糖苷酶活性。依据curcin的N端部分氨基酸设计简并引物,通过RT-PCR和5′-RACE技术从未成熟种子总RNA中克隆到curcin全长cDNA序列。该cDNA全长由1 173个碱基组成,包含一个编码293个氨基酸的前体蛋白,前42个氨基酸为信号肽。推测的多肽序列与测定的蛋白质N端序列相同,与多种已发表的Ⅰ型核糖体失活蛋白和Ⅱ型核糖体失活蛋白的A链有一定的同源性。将curcin的编码区与表达载体pQE-30相连后,转入大肠杆菌(Escherichia coil)M15菌株中得到了有效的表达。将表达的融合蛋白纯化后发现,它具有抑制无细胞系统蛋白质合成的能力。     

麻疯树核糖体失活蛋白基因的克隆和表达

麻疯树(Jatropha curcas L.)核糖体失活蛋白(curcin)是存在于麻疯树种子中的一种毒性较强的蛋白,它与蓖麻毒蛋白和相思子毒蛋白的性质相似,属Ⅰ型核糖体失活蛋白.从麻疯树种子中分离得到一种分子量为28.2 kD的蛋白质,其对无细胞系统中蛋白质合成的抑制活性较强,IC50为(0.19±0.01)nmol/L,具有RNA N-糖苷酶活性.依据curcin的N端部分氨基酸设计简并引物,通过RT-PCR和5'-RACE技术从未成熟种子总RNA中克隆到curcin全长cDNA序列.该cDNA全长由1 173个碱基组成,包含一个编码293个氨基酸的前体蛋白,前42个氨基酸为信号肽.推测的多肽序列与测定的蛋白质N端序列相同,与多种己发表的Ⅰ型核糖体失活蛋白和Ⅱ型核糖体失活蛋白的A链有一定的同源性.将curcin的编码区与表达载体pQE-30相连后,转入大肠杆菌(Escherichia coil)M15菌株中得到了有效的表达.将表达的融合蛋白纯化后发现,它具有抑制无细胞系统蛋白质合成的能力.     

小桐子半胱氨酸蛋白酶家族和相应miRNAs的鉴定及其对低温锻炼的响应

小桐子(Jatropha curcas)是一种极具潜力的能源植物及冷敏植物,12°C低温锻炼可显著提高其耐冷性。在全基因组水平上对小桐子半胱氨酸蛋白酶家族及靶向其基因的miRNAs进行鉴定、生物信息学分析和表达特性分析,并对该基因家族成员与miRNAs互作参与调控小桐子对低温锻炼的响应进行解析。结果表明,在小桐子基因组...     

小桐子低温诱导型启动子JcDnaJ20p的克隆及烟草转化功能鉴定

低温转录组数据显示,DnaJ20是小桐子低温诱导基因.为鉴定该基因启动子的低温诱导活性,基于PCR技术从小桐子叶片基因组DNA中克隆到DnaJ20基因(JcDna20)启动子序列,命名为JcDnaJ20p,利用重组技术构建了JcDnaJ20p启动子驱动GUS标记基因的植物双元表达载体pCambia1381Z-JcDna...     

蝴蝶兰PhTSJT1基因的克隆及在低温胁迫下的表达分析

本研究从蝴蝶兰叶片中克隆了茎部特异基因Ph TSJT1的全长序列(GenBank登录号为MF797883),并分析了其在不同组织及低温胁迫下的表达特性。结果表明,Ph TSJT1基因全长994 bp,编码239个氨基酸,属于Class-Ⅱ谷氨酰胺酰胺基转移酶超家族成员;同源性分析表明,该蛋白与多种植物的茎部特异蛋白和铝诱导蛋白有较高的同源性,进化上与小兰屿蝴蝶兰的茎部特异蛋白亲缘关系最近;该基因在营养器官中表达水平较高,在花器官中表达水平较低;13℃/8℃(昼/夜)的低温胁迫抑制PhTSJT1基因的转录表达,并随着低温胁迫时间的延长,Ph TSJT1基因的表达水平逐渐降低,在温度恢复正常时其表达水平升高;4℃冷胁迫低温条件下,PhTSJT1基因在处理1 h时,表达水平升高,处理8 h时表达水平最高,16 h后表达水平逐渐降低。由此推测,PhTSJT1参与4℃冷胁迫的分子调控。本研究不但有助于理解热带亚热带植物的耐冷机制,也为蝴蝶兰新品种的遗传改良提供帮助。