香蕉类甜蛋白基因MaTLP1的克隆与表达分析

在香蕉EST文库中,通过RACE技术克隆到1个香蕉类甜蛋白基因的全长序列。该序列最大开放阅读框942 bp,编码313个氨基酸。Blast分析发现,它与其他类甜蛋白相似度为56.10%,含有类甜蛋白（TLPs）特有的保守结构域,命名为MaTLP1。系统进化树表明,MaTLP1基因编码蛋白与海枣的亲缘关系较近,与香蕉的进化模式相似。组织特异性分析表明,MaTLP1在根、球茎、假茎中的表达量高,叶中较弱,花和果实中微量表达。实时荧光定量PCR分析显示,在抗病香蕉品种中,接种尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)枯萎病菌后MaTLP1基因上调表达,在感病香蕉品种接菌2 d后MaTLP1基因受到抑制,虽然在接菌4 d 后上调表达,但是相对于抗病品种上调较小。研究表明,MaTLP1基因可能在香蕉抗枯萎病的过程中起作用。     

一个新高产青蒿倍半萜合酶基因的克隆、表达和分析

用RACE方法从青蒿（Artemisia annua L.)高产株系001中克隆了一个新的1886bp的全长倍半萜合酶cDNA。克隆的倍半萜合酶氨基酸序列与烟草马兜铃烯合酶,莨菪岩兰螺旋二烯合酶,棉花杜松烯合酶的一致性分别为39％,38％和41％;与青蒿柏木脑合酶,紫穗槐二烯合酶和一个推测的倍半萜合酶克隆cASC125的一致性为50％,48％和59％。cDNA编码区序列被克隆进原核表达载体pET-30a,并在大肠杆菌（Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达,但过量表达的蛋白主要是以不溶性蛋白形式存在。Northern blotting分析表明此基因在茎,叶,花中表达,在根中没有表达。     

松墨天牛漆酶基因MaLac1的克隆、原核表达及表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆并鉴定松墨天牛Monochamus alternatus内源漆酶基因MaLac1,分析其在松墨天牛不同发育阶段的表达水平,为进一步明确MaLac1功能提供依据。【方法】基于松墨天牛肠道转录组测序数据,通过RACE克隆松墨天牛MaLac1基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;将该基因与pET-32a载体链接构建表达载体pET-MaLac1,导入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)使其表达;使用qPCR检测MaLac1基因在松墨天牛不同发育阶段(低龄幼虫、老熟幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫)肠道中的表达差异。【结果】克隆获得松墨天牛MaLac1的cDNA全长序列(GenBank登录号:KY073340)。MaLac1开放阅读框全长2 067 bp,编码一个含688个氨基酸的蛋白质,预测分子量为78.34 kD,等电点为5.30。SignalP 4.1 Server预测MaLac1在N端包含一个15个氨基酸的信号肽。序列比对分析表明,MaLac1具有典型的昆虫漆酶基因特征,与赤拟谷盗Tribolium castaneum漆酶基因的氨...     

ENC1的克隆,原核表达与数种细胞系表达谱分析

以人 3月胎脑总RNA为模板 ,用RT PCR的方法得到了ENC1(ectoderm neuralcortex 1)基因的cDNA ,经测序证实该cDNA的长度为 180 0bp ,包含ENC1的完整编码区 .将之克隆入pGEX 4T 1载体构建重组表达质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1表达 ,经Sepharose 4B纯化得到目的蛋白 .通过Northern印迹和RT PCR检验了该基因在数种细胞系中的表达 ,结果表明其在神经胶质母细胞瘤细胞系U2 5 1中有较高的表达 ,而在包括神经母细胞瘤细胞系SH SY5Y的其他数种细胞系中无表达 .与在正常生理状态下神经系统中两种细胞的表达情况相反 .这种分布不同的情况提示了ENC1在这两种不同来源的肿瘤的发生发展中具有不同作用     

几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

解毒酶基因cDNA克隆和高效表达

昆虫抗药性的一个重要机制是其产生的解毒酶可以将大剂量的农药脱去毒性[1] 。酯酶活性升高是库蚊对有机磷杀虫剂抗性的主要机制 ,与酯酶Ｂ1有关的抗性最高[2 ,3] 。酯酶与有机磷杀虫剂有非常强的结合力 ,可以迅速与之形成强结合体[4 ] 。酯酶的解毒作用具有很高的手性专一性 ,在有机磷化合物 ,特别是高毒的有机磷化合物的解毒作用中非常重要[1] 。高效表达解毒酶基因 ,将昆虫解毒酶用于人畜解毒的目的研究还未见报道。本文报道在大肠杆菌中高效表达昆虫解毒酶 ,并将产物用于实验动物有机磷中毒的解毒研究 ,为昆虫抗性相关基因的开发利用提…     

一株Sanguibacter sp.C4产几丁质酶基因的克隆与表达

Chi58是Sanguibacter sp．strain C4产生的一种胞外几丁质酶。通过chiA的特异性PCR引物探测到菌株C4中存在几丁质酶,并将扩增到的几丁质酶基因片段（chiA-F）克隆、测序后,提交GenBank数据库进行同源性搜索。对从GenBank中获得的高同源性序列进行比对,并根据保守区域设计2对PCR引物进行嵌套PCR,扩增出Chi58基因的开放阅读框（ORF）。测序结果表明该酶的ORF由1692个核苷酸组成,编码563个氨基酸,在N端有23个氨基酸的信号肽,其成熟蛋白的分子量应为58．544kDa。对其推导氨基酸的序列分析表明Chi58与沙雷氏菌的几丁质酶（如徂）有高度同源性（88．9％-99．6％）,其结构主要包括信号肽序列、PKD结构域和18家族糖苷水解酶结构域。将该基因克隆到pET32a（＋）载体构建重组质粒pChi58,转入大肠杆菌BL-21（DE3）进行融合表达。经IPTG诱导后,可见分子量约81．1kDa的融合蛋白的表达。     

人钙周期蛋白结合蛋白（hCacyBP）基因的克隆与表达

筛选cDNA文库得到了人的钙周期蛋白结合蛋白基因 ,将此基因的全编码区克隆到原核表达载体pET2 8上 ,诱导目的蛋白质表达以后将重组蛋白质用亲和层析的方法进行纯化 ,得到了纯度很好的重组的目的蛋白质 ,以此作为抗原免疫动物 ,得到抗钙周期蛋白结合蛋白的特异多克隆抗体。Western印迹的结果表明 ,该基因在小鼠多种组织中广泛表达 ;免疫组化的结果表明 ,BT32 5细胞诱导分化后钙周期蛋白结合蛋白分布有变化 ,由分布于胞质中转向分布于胞核和核周胞质     

鲈鱼酰基辅酶A结合蛋白Acbp基因cDNA的克隆和诱导表达

酰基辅酶A结合蛋白(acyl-CoA-binding protein,ACBP)对长链脂酰基辅酶A(long-chainfatty acyl-CoA esters,LCACoA)有很高的亲和力,因而对LCACoA在细胞内的运输和利用过程起重要的作用。本文采用RACE技术从鲈鱼肝脏中克隆了Acbp基因的全长cDNA序列,该基因全长cDNA 679 bp,5'端和3'端的非翻译区分别为83 bp和326 bp,开放阅读框为270 bp。推测编码89个氨基酸,理论等电点为5.44,分子量为10.14 kDa。鲈鱼Acbp与青鳉鱼、银鳕鱼、大西洋鲑和人的同源性分别为87%、84%、78%和68%。用RT-PCR和实时定量PCR检测鲈鱼肌肉、心脏、眼、大脑、消化道、肾脏、脂肪组织、脾脏、鳃和肝脏等10种组织的Acbp基因的表达情况,结果表明,在肾脏和肝脏的表达量高,肌肉、眼睛和大脑中表达低。定量PCR检测表明鲈鱼肝脏Acbp的表达在饥饿时明显下降,胰岛素上调其表达,葡萄糖对其表达则没有影响。     

马铃薯StAP1基因的分子克隆与表达分析

采用RT-PCR方法从马铃薯品种‘Désirée’中克隆了StAP1cDNA序列（GenBank登录号GU220568）。该基因cDNA开放阅读框长度为735bp,编码一个由244个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白分子量为28.57kDa,理论等电点为8.32。StAP1蛋白含有1个高度保守的MADS结构域,与烟草NAP1具有较高一致性。组织表达分析显示,StAP1在马铃薯植株的顶芽、花和叶中有较高水平的转录表达,在块茎中有微量表达。利用反义StCOL转基因马铃薯植株进一步分析表明,StAP1的表达受StCOL的调控。     

一个新的人类睾丸特异基因的cDNA克隆和表达分析

运用“数据库消减杂交”(DigitalDifferentialDisplay)方法筛选人类睾丸特异表达新基因 ,获得了有差异显示的代表新基因的克隆重叠群 ,挑选其中一个克隆重叠群HS .12 9794进行多组织RT PCR ,初步证实该重叠群在人睾丸中有高表达。然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发 ,采用生物信息学的方法快速克隆了一个人类新基因的全长cDNA序列 ,其全长 2 4 30bp ,开放阅读框为 6 76～ 12 4 8bp ,定位于 3p2 1 1,编码由 190个氨基酸组成 ,分子量为 2 0 4 17 8Da ,等电点为 5 2 3的一个偏酸性蛋白质 ,该蛋白与已知蛋白质无明显同源性。克隆实验验证该基因阅读框完全正确 ,半定量RT PCR进一步显示该基因在人不同发育时期的睾丸及精子细胞中有表达 ,推测其可能与精子生成相关 ,暂命名为SRG5 (TestisSpermatogenesisRelatedGene 5 ,SRG5 ) (GenBank登录号 :AY2 2 1117)。SRG5基因的成功克隆表明 ,“数据库消减杂交”与实验验证相结合的技术路线是一种快捷高效的发现更多人类功能新基因的新策略。     

人类PKNOX1基因一种新剪接型全长cDNA的克隆与表达分析

为了寻找新的Down’s综合征相关基因,利用生物信息学分析与实验技术相结合的方法,从定位于Down’s综合征关键区内(21q22．3)的EST(GenBank登录号H77399)出发,从人类睾丸组织cDNA文库内克隆到含同源盒结构域转录因子PKNOX1的一种新剪接型全长cDNA,命名为PKNOX1B,GenBank登陆号AYl42115。PKNOX1B基因跨越58．4kb,全长cDNA约2．8kb,有11个外显子和10个内含子,编码405个氨基酸残基的酸性蛋白质,分子量为44．628kDa,等电点6．28。PKNOX1B与PKNOX1的前9个外显子及9个内含子完全相同,由于PKNOX1B在第10与11外显子之间发生了差异剪接,以致其在3’端cDNA序列被截短约2kb,所编码的蛋白质在C端较PKNOX1短30个氨基酸残基。但PKNOX1B保留了与PKNOX1完全相同的同源盒结构域,因而它可能与其他含同源盒结构域基因家族成员一样参与了发育的遗传调控。RT-PCR结果显示PKNOX1B除骨髓组织外在人体组织广泛表达。在睾丸组织中PKNOX1可见5kb,2．9kb,2kb 3种转录本,而在其他组织中仅发现2个较大的转录本,2kb的转录本在睾丸组织呈现特异性的表达,它有可能参与了精子的发生过程。     

苹果一个锌指蛋白基因的cDNA克隆及其表达特性分析(英文)

A cDNA library was created from stem apex tissue from Jonathan apples (Malus domestica Borkh.), harvested in June to August, during which the plant transitions from vegetative growth to reproductive growth. From this library, we isolated an expressed sequence tag (EST) sequence containing a zinc finger motif, using this sequence, a 779 bp cDNA fragment was obtained by using 5‘ RACE, and a final full-length cDNA encoding an apple zinc finger protein (named MdZF1; GenBank accession number AB116545) was obtained by further PCR. This zinc finger motif of MdZF1 has high homology with INOETERMINATE1 (ID1) gene from maize which seemed to be involved in the transition to flowering. Northern blot and RT-PCR analyses showed that the MdZF1 expressed in the root, stem, leaves, shoot apex and floral organs of the apple, with expression levels higher in root, stem, leaves and floral shoot apex than that in floral organs (sepals, petals, stamens and pistils). Genomic Southern analysis showed that there was a single copy gene in apple genome.     

苹果一个锌指蛋白基因的cDNA克隆及其表达特性分析

采集了处于营养生长向生殖行长转化期(6~8月)的红玉苹果(Malus domestica Borkh.)茎顶,构建了其cDNA文库,并从中分离得到了一个具有锌指结构的EST序列,又通过5`RACE的方法,从cDNA文库中找到了其上游779bp的cDNA片段.最后用PCR的方法获得了苹果锌指蛋白的全长cDNA,并命为MdZF1.该cDNA序列已在GenBank登录,登录号为AB116545.MdZF1的锌指结构域与玉米的开花转换基因ID1有高度同源性.通过对苹果不同组织、器官的Northem和RT-PCR分析表明MdZF1在根、茎、叶、顶芽以及花器官(萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊)中都有表达.Southern分析表明MdZF1的基因组中是以单拷贝存在的.     

睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG1与Mtsarg1的分子克隆及Mtsarg1基因的表达谱分析

从已获得的在隐睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的EST片段（GenBank登录号：BE644538）出发,利用生物信息学和实验技术,克隆了小鼠睾丸生精细胞凋亡相关新基因Mtsarg1及相应的人类新基因TSARG1,Gen-Bank登录号分别为AF399971和AY032925。小鼠Mtsargl与人类TSARGl基因在氨基酸水平有55％的一致性和61％相似性,与其他已知蛋白质无明显同源性。小鼠10种组织的RT-PCR分析结果表明,Mtsargl基因在睾丸中高表达,在附睾中呈微弱表达,在其他组织不表达,提示Mtsargl和TSARGl基因在生精细胞凋亡或精子发生中具有潜在的重要作用。     

人类新基因ANKZF1的克隆与表达研究

心脏发育是一个非常复杂的过程,受一系列基因的精确调控.研究表明,许多锌指蛋白参与心脏的形成和疾病的发生.为了鉴定新的与心脏发育有关的人类锌指基因,运用同源基因克隆法,通过PCR技术扩增获得一个新的人类基因,其cDNA全长2459bp,其编码的蛋白由342个氨基酸残基组成(相对分子质量约为7.45kD).经国际人类基因命名委员会批准被命名为ANKZF1.该基因是哺乳动物物种特有基因.利用RTP-CR技术分析表明,该基因在胚胎的心脏、胃、肾和脑组织中有特异性的表达,提示该基因可能与心脏等组织的发育有关.     

Molecular Cloning and Expression of a Mouse Brain cDNA Encoding a Novel Protein Target of Calcyclin

Abstract: A protein target of mouse calcyclin, p30, which we call calcyclin-binding protein (CacyBP), was identified in mouse brain and Ehrlich ascites tumor (EAT) cells. The amino acid sequence of the CacyBP chymotryptic peptide was used to prepare synthetic oligonucleotides that served as a probe to screen the mouse brain cDNA library. A 1.4-kb positive clone was detected, isolated, and sequenced. The analyzed clone contains an open reading frame encoding a protein of a molecular mass of ～26 kDa. The nucleotide and predicted amino acid sequences indicate that CacyBP is a novel protein. The results obtained from northern blots show that the CacyBP gene is expressed predominantly in mouse brain and EAT cells. Using a pGEX vector the recombinant CacyBP was expressed in Escherichia coli, and its properties were analyzed. The recombinant protein interacts with calcyclin at a physiologically relevant range of Ca²⁺ in solution during affinity chromatography and on blots. Because CacyBP, like calcyclin, is present in the brain, the interaction of these two proteins might be involved in calcium signaling pathways in neuronal tissue.     

鸡akirin同源基因的克隆与组织表达分析

Akirin是最近被发现的,在果蝇和小鼠的免疫炎症反应和调控肌肉 发生再生中起着重要作用的新基因．本实验采用电子克隆技术成功克隆获 得了海兰褐鸡Akirin基因的全长编码序列.利用生物信息学方法对Akirin 基因进行序列分析和预测,并利用半定量RT-PCR技术对雏鸡和成鸡的 Akirin基因进行组织表达谱分析．结果表明,鸡Akirin同源基因可读框长 576 bp,进化保守高,编码蛋白的氨基酸序列存在PFAM、RGS、TOP1Bc、 UTG、HMG和low complexity sequence几种结构域,和蛋白激酶C磷酸化位 点、酪氨酸激酶磷酸化位点和 N端豆蔻酰化位点3个功能位点,同时在鸡 Akirin的3′ 非翻译区预测到1个microRNA靶位点．Akirin在鸡的心、脾、 脑等多种组织中广泛表达,推测鸡Akirin基因是一个可能具有多种功能作 用的新基因．本研究将为深入研究鸡Akirin基因功能作用奠定基础．     

SNF2家族新成员Ercc61的cDNA克隆与表达分析

SNF2家族蛋白在基因组复制、修复与表达中具有重要作用.报道了SNF2家族新成员Ercc61(excision repair crosscomplementing rodent repair deficiency,complementation group 6-like)的cDNA克隆、特性与表达分析.通过表达序列标签(EST)搜索和组装,获得了cDNA全长4002 bp的新基因Ercc6l(GenBank Acc.No AY172688),然后通过RT-PCR在小鼠胚胎心脏成功克隆了该基因.Ercc6l在小鼠基因组中由两个外显子和一个内含子组成,定位于X染色体,最大开放阅读框(ORF)编码一个含l 240个氨基酸的假定蛋白质.该假定蛋白质含有SNF2蛋白的8个保守基序(SNF2结构域).通过与SNF2家族各亚家族的成员进行多重比对,初步确认Ercc6l属于ERCC6亚家族成员.将Ercc6l编码区克隆到pEGFP-C3然后转染HeLa,3T3和B16细胞,融合蛋白主要定位于胞浆.BLAST搜索检索出69条小鼠EST与Erccol同源,这些EST主要来自胚胎和肿瘤组织.对小鼠不同发育时期的多种组织进行RT-PCR,发现Ercc6l在胚胎期强表达,出生产后表达显著下调.这些结果提示Ercc6l在胚胎发育和肿瘤发生中可能具有重要作用.