重组人白介素-10抑制晚期糖基化终产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞和血管新生内膜的增殖

研究观察了重组人白介素10(rhIL-l0)对晚期糖基化终产物(AGE)刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖及对SD大鼠血管损伤后新生内膜增殖的影响。体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,采用MTS／PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态;应用流式细胞术测定细胞周期;利用p44／42磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印迹法测定p44／42 MAPK磷酸化蛋白表达。利用大鼠颈动脉血管损伤模型,观察rhIL—10对新生内膜增殖的影响。结果显示：(1)AGE处理组与对照组相比,AGE对血管平滑肌细胞增殖具有明显的刺激作用(P＜0．05)。rhIL-l0单独应用对血管平滑肌细胞生长没有影响(P＞0．05)。在AGE刺激下,低至100ng／ml的rhIL-l0可抑制血管平滑肌细胞的生长(P＜0．05)。(2)流式细胞术测定的结果显示,rhIL—10可以使AGE作用下的VSMC大部分处于Go／G1期,与对照组相比有明显差异(P＜0．01)。(3)AGE对p44／p42 MAPK磷酸化蛋白表达有显著的增强作用,此作用可被rhIL—10抑制(P＜0．001)。(4)大鼠颈动脉损伤后,rhIL—10治疗组的动脉血管新生内膜/中层面积比低于对照组约45％(P＜0．01)。表明抗炎细胞因子rhIL—10可抑制AGE诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和血管新生内膜的增殖。     

血管内皮生长因子基因对兔髂动脉内膜损伤的组织形态变化过程的影响

探讨血管内皮细胞的特异丝裂原－血管内皮生长因子（VEGF）基因阻止血管内膜损伤后形成再狭窄的组织变化过程。建立球囊拉伤血管内膜的兔髂动脉模型,将携带VEGF目的基因的真核表达载体pcDNA3/VEGF经多聚赖氨酸处理的PTCA球囊导管导入拉伤的血管内膜。VEGF基因组拉伤2周时血管内壁有VEGF mRNA和蛋白的高表达。血管内膜内皮化较快。2周时即有许多血管内皮细胞呈岛状分布。4周时内膜基本恢复光滑。内膜平滑肌细胞增生明显减少,而对照组2周时血管内膜粗糙,基底膜暴露,拉伤后4周仍无内皮细胞再生,最后形成虫蚀样改变。血管中膜平滑肌细胞穿过内弹性膜进入内膜并大量增生,内膜增厚。VEGF基因定位导入血管内壁后。VEGF mRNA和蛋白高表达且发挥其生物学效应,内皮细胞岛状增生,加快内膜内皮化,减轻内膜增厚。     

17-AAG对大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的影响及其作用机制

目的:研究17-丙烯胺-17去甲氧格尔德霉素(17-Allylamino-17-emethoxy-geldanamycin, 17-AAG)对球囊损伤后大鼠颈总动脉内膜增生的影响及可能作用机制。方法:将清洁级雄性SD大鼠36只按照随机数字法分为假手术组(Sham组)12只、球囊损伤组(Balloon injury, BI组)12只及17-AAG治疗组(17-AAG组)12只。采用2F Fogarty球囊建立大鼠颈总动脉球囊损伤组模型,17-AAG治疗组大鼠在建模后腹腔注射17-AGG(20 mg/kg 2d)。各组大鼠于球囊损伤3周后取损伤段颈总动脉,通过HE染色观察血管内膜形态学改变并评估内膜增生情况,免疫组化染色(Immunohistochemical staining,IHS)法检测血管壁增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达,评估血管平滑肌细胞的增殖情况。流式细胞术检测血管平滑肌细胞的凋亡情况。结果:BI组、17-AAG组大鼠球囊损伤后颈总动脉内膜出现不同程度增生,内膜/中膜面积比(Intima area/Membrane area,I/M)均较Sham组显著升高(P0.05);17-AAG组的I/M较BI组明显下降(P0.05)。BI组、17-AAG组颈总动脉PCNA表达水平较Sham组明显升高(P0.05),较BI组显著降低(P0.05)。BI组、17-AAG组大鼠血管平滑肌细胞凋亡率较Sham组显著升高(P0.05);17-AAG组大鼠血管平滑肌细胞凋亡程度较BI组明显升高(P0.05)。结论:17-AAG对球囊损伤后颈总动脉内膜增生存在抑制作用,其机制可能是通过提高血管平滑肌细胞凋亡率影响其增殖程度。     

血管内膜增生过程中核酸代谢相关酶活性变化的研究

目的和方法：应用血管内皮剥脱后再狭窄模型,动态观察胸腹主动脉壁核膜核苷三磷酸酶及核酸代谢和糖代谢相关酶5’—核苷酸酶、腺苷脱氨酶和琥珀酸脱氢酶活性的变化。探讨其与血管平滑肌细胞增生和新生内膜形成的关系。结果：血管内皮剥脱后,胸腹主动脉壁核膜核苷三磷酸酶活性持续升高,与血管内膜增厚程度相平行;血管平滑肌细胞收缩型标志蛋白α-肌动蛋白表达降低及合成型标志蛋白骨桥蛋白表达上调,说明血管平滑肌细胞发生了表型转化,由分化型转变成为去分化型;5’核苷酸酶、腺苷脱氨酶和琥珀酸脱氢酶活性表现为先升后降,三种酶活性均于血管平滑肌细胞增殖旺盛期(术后3～7d)达峰值。结论：细胞内参与mRNA转运及糖、核酸代谢的一系列酶活性的变化是新生内膜形成的生化基础。     

Egr-1的诱骗性寡脱氧核苷酸抑制大鼠颈总动脉损伤后MMP-2的表达

目的观察局部转染早期生长反应因子-1(early growth response factor-1,Egr-1)的特异诱骗寡脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotides,decoy ODNs)对球囊损伤颈总动脉后基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表达的影响及内膜增生的情况,初步探讨Egr-1,decoy ODNs抑制球囊损伤后内膜增生的机制。方法 96只健康雄性Wistar大鼠,随机分为4组,分别为假手术组、对照组、杂码组和诱骗组,每组24只。除假手术组外均应用2F球囊导管行颈总动脉球囊损伤术,术中采用转染试剂FuGENE6介导的Egr-1decoy ODNs转染至损伤后大鼠血管中,与假手术组、对照组、杂码组相比较。术后3、7、14、21d每组处死6只动物。应用HE染色和免疫组织化学方法观察大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生情况和MMP-2蛋白的表达及转染Egr-1decoy ODNs后对它们的影响。结果 (1)、内膜损伤后3d内膜增厚不明显,7d内膜开始增厚,14、21d时内膜明显增厚。(2)、在假手术组近腔面中膜可见MMP-2有少量散在阳性表达;在对照组及杂码组动脉损伤后3d,在近腔面中膜,有少量阳性表达,与假手术组相比,阳性表达指数上升。7d时在新生内膜和靠近新生内膜处中膜表达明显,14d后表达逐渐下降。(3)转染decoy ODNs治疗后,在各个时间点内膜增厚程度减轻,MMP-2蛋白表达减少,与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。结论血管球囊损伤后,内膜7d开始增生,14d、21d增生更明显,而MMP-2在7d时表达明显,之后逐渐下降,Egr-1decoy ODNs能抑制MMP-2的表达,从而减轻血管损伤后内膜的增生。     

兔血管外膜对血管重构及收缩功能影响的初步观察

本文研究血管外膜在血管重塑及功能调控中的作用。实验采用在体去除兔颈动脉外膜的方法,于术后即刻、1周及2周取出动脉作组织学、免疫组织化学染色及血管反应性测定。结果显示：(1)去除颈动脉局部外膜对内皮及中层平滑肌无明显损伤;(2)去除外膜后血管平滑肌细胞增殖,并有新生内膜形成;(3)与对照例比较,去外膜侧血管对去甲肾上腺素的收缩反应在术后即刻及1周时减弱(P＜0．05)。上述研究结果提示：去除动脉外膜可导致血管内膜增殖及血管平滑肌收缩功能的改变,表明外膜可能参与血管重塑及对血管功能的调控。     

E1A 激活基因阻遏子促进人血管平滑肌细胞分化和迁移

为探讨 E1A 激活基因阻遏子 (cellular repressor of E1A-stimulated genes , CREG) 蛋白在人血管平滑肌细胞株 HITASY 分化和迁移中的调控作用,构建了重组逆转录病毒载体 pLNCX₂( ＋ )/CREG 和 pLXSN( － )/CREG. 以带绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein , GFP) 的空载体 pLNCX( ＋ )/GFP 和正常 HITASY 为对照,用磷酸钙共沉淀法将重组逆转录病毒载体转染 293 细胞,包装出完整的逆转录病毒后,感染 HITASY. 经 G418 筛选,获得稳定感染的细胞克隆 . 应用免疫荧光染色、蛋白质印迹等方法检测 CREG 和平滑肌分化标志蛋白α- 肌动蛋白 (SMα -actin) 表达,同时通过刮伤实验、慢速显微摄像技术检测细胞迁移能力以及用明胶酶谱方法分析细胞基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase , MMPs) 的活性 . 结果表明： pLNCX₂( ＋ )/CREG 稳定感染的 HITASY 中 CREG 和 SMα-actin 蛋白表达上调, MMP-2 和 MMP-9 活性升高,细胞迁移速度加快; pLXSN( － )/CREG 稳定感染的 HITASY 中 CREG 和 SMα -actin 蛋白表达下调, MMP-2 和 MMP-9 活性降低,细胞迁移速度减慢 . 上述研究提示 CREG 在诱导血管平滑肌细胞分化的同时促进细胞迁移 .     

卡立泊来德对AGEs所致新内膜形成的抑制作用及相关机制

为了观察Na⁺/H⁺ 交换蛋白1(NHE1)选择性抑制剂卡立泊来德(cariporide)对糖基化终末产物( advanced glycation end products,AGEs)所致大鼠颈动脉球囊损伤后新内膜形成的作用,以球囊损伤大鼠颈总动脉,取标本HE染色后进行形态学观察并计算内膜、中膜面积及内膜/中膜面积比．为探讨相关机制,原代培养大鼠主动脉平滑肌细胞( vascular smooth muscle cell,VSMC),[³H] thymidine 检测 VSMC增殖; RT-PCR及实时RT-PCR检测VSMC基质金属蛋白酶2( matrix metalloproteinases-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinases-9,MMP-9)及环氧酶2(cyclooxygenase-2,COX-2) mRNA水平;Western blot检测核因子κB(NF-κB)的表达及抑制蛋白κBα(I-κBα)的降解．大鼠颈动脉球囊损伤后,cariporide(0.1,10 mg/kg)能显著抑制AGEs所致新内膜增生(P < 0.01)．细胞实验结果显示,cariporide 可以浓度依赖性地抑制AGEs 诱导VSMC中COX-2、MMP-2及MMP-9 mRNA 表达,同时显著抑制I-κBα降解及NF-κB表达．结果表明,cariporide 能显著抑制血管损伤后AGEs所致新内膜的形成,其机制与抑制NHE1活性从而抑制NF-κB活化,下调MMP-2、MMP-9及COX-2 mRNA有关．提示NHE1可能是AGEs致血管损伤信号通路中的重要组成部分．     

血管损伤的新靶点：干扰素调节因子

内膜增生是血管损伤后动脉重塑过程中普遍存在的现象。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的增殖、迁移、表型转换是血管损伤性疾病高血压、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等的共同病理生理学过程。干扰素调节因子（interferon regulatory factors,IRFs）是一类能对干扰素基因表达起到免疫调节作用的转录因子。近来研究发现,其在血管损伤病理过程具有调节作用,其中IRF1与细胞生长、分化和损伤密切相关,IRF3与IRF7可以抑制新生内膜的形成,而IRF8和IRF9则促进VSMCs增殖、迁移及血管内膜增生。本文重点介绍了IRFs的结构特征、信号途径及在血管重塑过程中作为新型调控因子的功能。     

内膜下血管成形术动物模型的构建

目的建立一种稳定可靠的内膜下血管成形术(subintimal angioplasty,SIA)的动物模型,进而探索术后血管壁有关组成成分的变化规律。方法以巴马猪为实验对象,一组(7只)先建立动脉硬化狭窄模型,另一组(9只)为正常动脉,在颈总动脉施行SIA,在术后不同时间观察造模段动脉的通畅率及病理变化等。结果手术操作成功率为93.8%(15/16)。SIA术后总的通畅率为53.3%(8/15)。病理组织学观察发现SIA术后动脉管壁有新内膜形成,中膜增厚,平滑肌细胞数量增多,较多泡沫细胞出现,胶原纤维及弹力纤维染色范围增大、染色密度增加。超微结构观察提示SIA术后中膜层平滑肌细胞的收缩型与合成型同时存在;细胞外基质中胶原纤维和弹力纤维含量异常丰富。结论①首次成功设计、构建内膜下血管成形术的动物模型。②内膜下血管成形术模型构建术后的病理组织学改变与腔内血管成形术后的变化基本一致。