弗氏志贺菌毒力大质粒导入大肠杆菌MG1655

目的:将弗氏2a志贺菌2457T的毒力大质粒pSF导入大肠杆菌MG1655。方法:通过诱动转移技术,将弗氏2a志贺菌2457T的毒力大质粒导入大肠杆菌MG1655。结果:构建了MG1655/pSF:pXL275-virG的毒力大质粒导入突变株,双向电泳初步比较分析表明在重组MG1655中有志贺菌毒力的表达。结论:成功地将弗氏2a志贺菌2457T毒力大质粒pSF导入了大肠杆菌MG1655。     

基因工程

将启动子和结构基因插入质粒,构成表达载体,用之转化受体菌,如大肠杆菌,从而使干扰素得到大规模生产。用仙台病毒诱导BALL一1细胞后,从这些细胞中制备出两种a一干扰素。这两种干扰素也可以从克隆的质粒载体转化     

志贺氏菌福氏2a 301株ipaH4.5突变株的构建及生物学功能分析

利用λ-Red重组系统对福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因进行缺失突变,构建了福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因缺失突变株?ipaH4.5,利用低拷贝质粒构建ipaH4.5缺失突变株的回复突变株△ipaH4.5HF。PCR方法证实了ipaH4.5基因的缺失和回复。对野生株、突变株和回复突变株的生长代谢及细胞侵袭能力进行比较;ELISA方法检测3株菌侵袭鼠J774巨噬细胞后培养上清中炎性因子的水平。生长代谢实验表明缺失和回复ipaH4.5不影响志贺氏菌的生长速度,侵袭实验表明缺失和回复ipaH4.5也不影响志贺氏菌对HeLa细胞和鼠J774巨噬细胞的侵袭能力,表明ipaH4.5基因与志贺氏菌的生长代谢和侵袭能力无关;鼠J774巨噬细胞培养上清中细胞因子水平的改变提示该基因在志贺氏菌侵入细胞后抑制宿主细胞炎症反应。     

稳定、无抗药的痢疾福氏2a和宋内双价菌苗候选株的构建

通过体内外基因重组,将大肠杆菌粘附因子cs3基因定位整合到痢疾杆菌福氏2a疫苗株T32菌染色体的asd基因内,使asd基因灭活;将来内O抗原基因克隆至无抗药性表达载体pXL378,获得重组质粒pXL390,将其转化asd-的T32受体菌,构建成福氏2a和宋内双价苗苗株FS01。实验表明:重组质粒pXL390在不带任何抗菌素基因的情况下,在asd-的T32受体菌内是稳定的。FS01株遗传稳定,能表达两种痢疾菌的PLS-O抗原,无明显毒性作用。动物试验表明,以FS01株皮下免疫的小鼠对福氏2a和宋内有毒株的腹腔攻击有100％的保护。     

关于痢疾菌苗的研究现状(续)

<正>下面讨论志贺氏菌质粒的基因产物。这是Hale的初步工作及志贺氏菌毒株与侵袭性大肠杆菌微细胞的初步应用。由于会出现分裂不完善的突变体,致使其细胞的一部分分裂后不能遗传染色体DNA,细胞发芽部分太小不能包含染色体,只能包含大质粒。微细胞可以从营养细胞中分离到,在这些种群中从新合成蛋白质的是由质粒而不是染色体DNA。来自弱毒亲本的微细胞不能侵入     

驱除痢疾杆菌侵袭大质粒的新方法

用质粒不相容性原理驱除痢疾杆菌福氏 2a 2 4 5 7T和宋内S7的侵袭大质粒 ,先从福氏2a侵袭大质粒分别扩增ori和inc基因 ,将它们克隆至 pMD18 T载体 ,得重组质粒pMDori和 pMDinc ,然后转化 2 4 5 7T和S7,不管是pMDori还是 pMDinc都能竞争驱除痢疾杆菌福氏 2a 2 4 5 7T和宋内S7的侵袭大质粒。     

稳定、无抗药的痢疾福氏2a和宋内双价菌苗候选株的构建

通过体内外基因重组,将大肠杆菌粘附因子cs3基因定位整合到痢疾杆菌福氏2a疫苗株T32菌染色体的asd基因内,使asd基因灭活;将来内O抗原基因克隆至无抗药性表达载体pXL378,获得重组质粒pXL390,将其转化asd^-的T32受体菌,构建成福氏2a和宋内双价苗苗株FS01。实验表明:重组质粒pXL390在不带任何抗菌素基因的情况下,在asd-的T32受体菌内是稳定的。FS01株遗传稳定,能表达两种痢疾菌的PLS-O抗原,无明显毒性作用。动物试验表明,以FS01株皮下免疫的小鼠对福氏2a和宋内有毒株的腹腔攻击有100％的保护。     

立氏立克次体外膜蛋白H 基因片段的克隆表达与免疫原性分析

目的:克隆表达立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)外膜蛋白H基因(ompH)片段并对其进行免疫原性分析。方法:采用PCR技术从立氏立克次体基因组中扩增ompH基因片段,将该基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组原核表达质粒pET32a/ompH;将pET32a/ompH转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因。结果:获得长为327bp的ompH基因片段,SDS-PAGE分析发现pET32a/ompH转化菌表达了大小约27kDa蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫豚鼠血清及斑点热患者血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,经该重组蛋白免疫血清中和后的立氏立克次体感染VERO活力减低。结论:pET32a/ompH转化的大肠杆菌表达了ompH基因片段,所产生的重组蛋白具有良好的免疫反应性及保护性。     

立氏立克次体外膜蛋白H基因片段的克隆表达与免疫原性分析

目的：克隆表达立氏立克次体（Rickettsia rickettsii）外膜蛋白H基因（ompH）片段并对其进行免疫原性分析。方法：采用PCR技术从立氏立克次体基因组中扩增ompH基因片段,将该基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组原核表达质粒pET32a/ompH;将pET32a/ompH转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因。结果：获得长为327bp的ompH基因片段,SDS-PAGE分析发现pET32a/ompH转化菌表达了大小约27kDa蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫豚鼠血清及斑点热患者血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,经该重组蛋白免疫血清中和后的立氏立克次体感染VERO活力减低。结论：pET32a/ompH转化的大肠杆菌表达了ompH基因片段,所产生的重组蛋白具有良好的免疫反应性及保护性。     

植病生防菌成团泛菌电击转化条件的研究*

研究了植病生防菌成团泛菌（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）的电击转化条件。结果表明受体菌固体培养、生长到对数早期时的细胞转化效果最好;质粒ＤＮＡ分子量增加１０培,转化效率降低１００倍;质粒ＤＮＡ浓度在０．０１－１μｇ／μＬ范围内其变化与转化频率呈正比,与转化效率成反比;从成团泛菌中提纯的质粒ＤＮＡ比从大肠杆菌中提纯的相同质粒ＤＮＡ转化成团泛菌的效率高出３０倍;最佳电击条件为场强１５ｋＶ／ｃ     

枯草芽孢杆菌中的分子克隆和单体杂种质粒转化的研究

枯草芽孢杆菌感受态细胞的质粒转化与质粒的分子构型有关。用琼脂糖凝胶电泳法分离纯化的pUB110质粒DNA单体是很少或没有转化活性的。在pUB110质粒DNA上插入一段受体菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体可以转化感受态细胞,但受体菌必须是重组型的。转化效率和插入片段的大小有关,片段愈大转化活性愈高,片段小于0.6kb,就和pUB110DNA单体一样,几乎没有转化活性。在pUB110质粒DNA上插入一段解淀粉芽孢杆菌染色体DNA,这种杂种质粒的单体转化效率都很低。本文还讨论了用鸟枪法在枯草芽孢杆菌中进行分子克隆的一些问题。     

一种简单的哺乳动物细胞附着体质粒CaCl2转化方法

目的:建立一种简单经济的哺乳动物细胞附着体质粒还原实验方法。方法:构建附着体载体,转染中国卵巢仓鼠(CHO)细胞和小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a,利用改良的赫特裂解法提取附着体质粒,CaCl2法转化附着质粒至宿主菌大肠杆菌DH5α,再次从DH5α中提取质粒,将转染前后质粒用KpnⅠ/BamHⅠ双酶切和BamHⅠ单酶切,并将转染前后的质粒进行DNA测序分析。结果:与最初转染的质粒相比,还原质粒双酶切和单酶切后的条带大小一致;DNA测序分析表明,转染前后质粒中的插入序列相同。结论:建立了可用于质粒还原实验的简单的CaCl2转化方法。     

大肠杆菌菌蜕装载质粒DNA实验方法的优化

目的:优化大肠杆菌菌蜕装载质粒的效率,并将装载质粒的菌蜕转染抗原提呈细胞,以提高核酸疫苗的递送水平。方法:将质粒pHH43转化大肠杆菌DH5α,制备大肠杆菌菌蜕;优化菌蜕装载质粒时菌蜕、质粒和膜囊的比例,获得更高的装载效率,通过扫描及透射电镜、流式细胞术观察其形态变化及装载效率;将装载质粒的菌蜕与抗原提呈细胞——巨噬细胞RAW264.7和树突状细胞DC2.4共孵育,观察吞噬效果。结果:优化了大肠杆菌菌蜕装载质粒的效率,当菌蜕、质粒、膜囊的比例为7∶10∶4时效率达到最佳,装载DNA效率达98%以上;抗原提呈细胞吞噬装载了质粒的菌蜕,效率达100%。结论:大肠杆菌菌蜕可高效装载核酸疫苗,且高效被抗原提呈细胞捕获,有助于提高核酸疫苗的递送和免疫效果的提高。     

分离水稻根面细菌作为固氮基因质粒PRDI受体的转化研究

本文描述水稻根面细菌的积聚现象,并鉴定其常见细菌有肠细菌属(Escheriehia)、柠檬细菌属(Citrobac-ter)、拜叶林克氏菌(Beijerinckia)、假单孢菌属(Pseudomonus)、黄单孢菌属(Xanebomonas)、黄杆菌属(Flavobocterium)。分离到的根面细菌对水稻幼苗有良好作用,并选到四环素敏感菌株,可以作为固氮基因质粒 PRDI 受体。用固氮基因质粒 PRDI 转化到水稻根面细菌获得一株转化体。转化体通过再转化、质粒消除试验、琼脂糖凝胶电泳、电镜观察,初步证实受体菌获得固氮基因质粒 PRDI。     

希瓦氏菌(Shewanella marinintestina MCCC 1A01703)二十碳五烯酸生物合成基因簇的钓取及鉴定

希瓦氏菌(Shewanella marinintestina MCCC 1A01703)是从海洋动物肠道分离得到的1株产二十碳五烯酸(Ecicosapentaenoic acid,EPA)的海洋细菌。利用PCR方法、Overlap PCR及Gibson Assemble技术克隆该菌中包含pfaA、pfaB、pfaC和pfaD的EPA生物合成基因簇,全长18.4 kb。序列分析表明所钓取的合成基因簇与来自希瓦氏菌SCRC-2738的EPA合成基因簇有88%的相似度,均编码聚酮合酶。以构建的低拷贝表达载体pACYC-Trc为骨架,通过Gibson Assemble技术构建EPA基因簇表达质粒pLYSCY03。钓取大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)细胞中的entD基因,克隆至表达载体pTrc99a中,构建成为重组质粒pLYSCY01。将两个表达质粒同时导入大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)中,获得产EPA的工程菌株。结果表明,希瓦氏菌中含有EPA聚酮生物合成基因簇,大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)中的entD基因可以替代pfaE基因与钓取的EPA合成基因协同合成EPA。     

鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因的克隆及亚细胞定位研究

鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,为兼性胞内菌。生物信息学分析显示鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因的表达产物为分泌蛋白,且可能定位于宿主细胞的线粒体上。通过构建重组质粒p EGFP-DmpA和pc DNA-DmpA、鰤鱼诺卡氏菌胞外产物鉴定、亚细胞定位、过表达等方法,对鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因进行了克隆、亚细胞定位及初步功能研究。结果表明在鰤鱼诺卡氏菌胞外产物中鉴定到了DmpA蛋白,证实其为分泌蛋白。亚细胞定位研究发现DmpA-GFP融合蛋白均匀地分布在FHM细胞中,与线粒体分布不重合,说明DmpA蛋白并不定位在线粒体上。DmpA-GFP融合蛋白的表达会改变FHM细胞线粒体的分布为团块状。DmpA在细胞中的过量表达对细胞核无明显影响,表明该基因无诱导细胞凋亡的功能。通过对鰤鱼诺卡氏菌DmpA的克隆、亚细胞定位和过表达研究,为进一步研究该基因的功能和深入了解鰤鱼诺卡氏菌的致病机理奠定了基础。     

拟诺卡氏菌线型质粒pNPL1的测序和分析

【目的】检测和分析稀有放线菌中新的线型质粒。【方法】从植物内生菌中分离链霉菌之外的放线菌菌株,检测、测序和分析线型质粒。【结果】从中草药植物紫花前胡的叶片中分离到一株内生放线菌25L-1-1c,经过16S rRNA基因序列比对属于拟诺卡氏菌。从该菌株中检测到一个约25 kb的线型质粒pNPL1。克隆和测序了pNPL1新的端粒,含有多个小的回文序列。测序获得全长为24 621 bp的线型质粒pNPL1,预测编码22个基因,其中2个基因与链霉菌质粒的端粒复制基因同源,1个基因与链霉菌质粒主要的接合转移基因相似,其余19个基因为未知功能。携带pNPL1端粒复制基因的质粒不能转化变铅青链霉菌,暗示需要发展拟诺卡氏菌的遗传操作系统。【结论】这是首次在拟诺卡氏菌中发现和描述线型质粒。     

福氏志贺菌O-抗原磷酸乙醇胺修饰研究进展

福氏志贺菌是发展中国家引起痢疾的主要致病菌。福氏志贺菌O-抗原除噬菌体介导的糖基化和(或)乙酰化外,最近发现一种新的修饰方式磷酸乙醇胺修饰,其机制为由质粒携带的opt基因编码磷酸乙醇胺转移酶在O-抗原的鼠李糖II或(和)鼠李糖III上添加磷酸乙醇胺基团,从而形成血清型Xv、4av和Yv福氏志贺菌,并表达MASF IV-1抗原。人工转化携带opt基因的质粒到无MASF IV-1抗原表达的不同血清型福氏志贺菌中,转化菌株都能表达MASF IV-1抗原。在某些血清型福氏志贺菌中,O-抗原的磷酸乙醇胺修饰与糖基化、乙酰化修饰之间相互作用。现对福氏志贺菌的O-抗原磷酸乙醇胺修饰机制及其与糖基化、乙酰化修饰间的相互作用进行了综述。     

重组质粒在减毒沙门氏菌中的稳定性及其对细菌侵袭力的影响

将含有外源基因的重组真核表达质粒pcDNA3-F和pCI-F转化减毒鼠伤寒门氏菌,探讨质粒类型和插入片段对重组质粒在细菌内的稳定性和细菌侵袭力的影响。结果表明,外源质粒可降低减毒沙门氏菌在体外的增殖能力和侵袭力,也影响细菌在鸡体内的存活力;就质粒类型而言,pCI的影响大于pcDNA3,而以携带外源基因的重组质粒影响较为显著;外源基因插入也影响质粒在宿主菌内的稳定性。提示利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗研究时,要考虑质粒类型与其在宿主菌内稳定性的关系、携带外源基因重组质粒对载体菌侵袭力和存活力的影响等问题。     

宋内氏福氏2a双价志贺氏菌芳香族氨基酸营养缺陷型减毒株的研究:Ⅰ.减毒株的构建

FS54是本室构建的宋内氏福氏2a双价志贺氏菌杂交株,有与志贺氏菌毒株相同的毒力。本研究通过遗传重组技术,给FS54株引入了aroD基因的转座子Tn10插入失活物(aroD∶∶Tn10),构建了FS54株的芳香族氨基酸营养缺陷型减毒株,并进一步去除了Tn10所携带的四环素抗性和宋内氏Ⅰ相大质粒(pSS120∶∶Tn5)上Tn5所携带的卡那霉素抗性,得到了宋内氏福氏2a双价志贺氏菌芳香族氨基酸营养缺陷型减毒株FS54—7b。