分选酶A在pET32a(+)原核表达载体中的表达和鉴定

旨在pET32a(+)原核表达载体中表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的转肽酶分选酶(SrtA)并进行鉴定.以含有pET22-srtA质粒为模板,设计并合成引物,PCR扩增得到SrtA△N24和SrtA△N59基因,经过BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切,克隆入表达载体pET32a(+)中,构建重组载体pET32a-SrtA△N24及pET32a-SrtA△N59,并转化入大肠杆菌BL21(DE3).经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物分别进行分析和鉴定.然后对重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达条件进行了优化.结果显示重组载体pET32a-SrtA△N24和pET32a-SrtA△N59分别表达出相对分子量为约42 kD和37 kD的融合蛋白,经SDS-PAGE和Westem blotting检测显示其分子量与预期的大小相符合.成功构建了重组质粒pET32a-SrtA△N24和pET32a-SrtA△N59,并且在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效融合表达.     

白喉毒素无毒突变体CRM197基因的克隆与表达

目的构建白喉毒素(Diphtheria toxin)无毒突变体CRM197(Cross-reacting materials 197)的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法以白喉杆菌(ATCC39255)基因组DNA为模版,采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增CRM197基因,插入表达载体pET11b中,构建重组原核表达质粒pET11b-CRM197。经双酶切及测序鉴定正确后,重组质粒被转化入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,结果表明与预期一致;表达的重组蛋白相对分子质量约58 000,并可与鼠抗CRM197单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组原核表达载体pET11b-CRM197,重组的CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了表达,为以该重组突变体作蛋白载体制备结合疫苗奠定了基础。     

热玫瑰小双孢菌来源的丙酮酸磷酸双激酶的表达及应用

以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板, 通过PCR扩增得到了编码PPDK的基因, 将此基因片段插入到表达载体pET28a(+)中构建得到了重组表达质粒pET28a(+)-PPDK, 将重组表达质粒pET28a(+)-PPDK转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经过IPTG诱导, 重组菌成功表达了N端带有6-His Tag的重组PPDK。经SDS-PAGE分析, 重组PPDK单体分子量为101 kD。经过镍亲和层析和超滤后, 重组PPDK蛋白基本达到电泳纯, 并被成功应用于焦测序中。     

阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因原核表达质粒的构建及表达

质粒 pMD-18T-ap65-3 经 Xho I 和 BamH I 双酶切, 1.0% 凝胶电泳后纯化回收阴道毛滴虫黏附蛋白 65-3 基因,定向克隆至原核表达载体 pET-32a( ), 构建原核表达质粒 pET32a-ap65-3. 重组质粒转化大肠埃希菌 JM109 感受态细胞中, 筛选阳性克隆, 进行PCR﹑酶切及测序鉴定正确后, 将重组质粒 pET32a-ap65-3 转化于大肠埃希菌 BL21 中,异丙基-β-D硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导重组蛋白表达后利用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和免疫印迹 (Western blot) 对重组蛋白进行分析鉴定. 本实验为研究阴道毛滴虫病的致病机制及蛋白生物学功能奠定了基础.     

热玫瑰小双孢菌来源的丙酮酸磷酸双激酶的表达及应用

以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板, 通过PCR扩增得到了编码PPDK的基因, 将此基因片段插入到表达载体pET28a(+)中构建得到了重组表达质粒pET28a(+)-PPDK, 将重组表达质粒pET28a(+)-PPDK转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经过IPTG诱导, 重组菌成功表达了N端带有6-His Tag的重组PPDK。经SDS-PAGE分析, 重组PPDK单体分子量为101 kD。经过镍亲和层析和超滤后, 重组PPDK蛋白基本达到电泳纯, 并被成功应用于焦测序中。     

人呼吸道合胞病毒融合蛋白(F)片段原核表达、纯化和鉴定

目的克隆并表达人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株的融合蛋白(F)基因片段。方法利用PCR技术扩增HRSV兰州株的融合蛋白基因片段,克隆于原核表达载体pET-42b(+),转化大肠杆菌(Rosetta),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和Western-blot分析重组蛋白的表达及其反应原性。结果 PCR扩增得到951 bp的DNA片段,重组质粒pET42b-F经酶切鉴定和测序分析,表明质粒构建正确。表达的重组蛋白的相对分子质量为68 710,表达的重组蛋白占总菌体蛋白的7%,纯化后蛋白纯度达80%。经Western-blot分析,重组蛋白与抗RSV的单抗呈专一性强阳性反应。结论成功构建了HRSV兰州株F基因片段原核表达载体,并在大肠杆菌Rosetta中获得了表达,表达的重组蛋白具有反应原性和特异性,为HRSV感染引起的疾病血清学诊断以及试剂盒的研发提供了材料。     

大肠杆菌K12苹果酸酶的克隆、表达与纯化

以大肠杆菌K12基因组DNA为模板,PCR扩增得到NAD 依赖型苹果酸酶(NAD-ME)的全长基因,并克隆到载体pET24b( )中,得到表达质粒pET24b-ME。在IPTG诱导下,携带pET24b-ME的大肠杆菌BL21(DE3)高效表达分子量约为65 kDa的可溶性蛋白。重组NAD-ME经镍亲和层析纯化,比活达到100 U/mg以上。以上结果为深入研究苹果酸酶生物催化特性及其与辅酶的相互作用奠定了基础。     

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

通过RT-PCR扩增获得PfDNV结构蛋白基因VP1含磷脂酶A2(PLA2)功能区片段,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了westernblot鉴定,结果表明成功表达PfDNV结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础。     

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

通过RT-PCR扩增获得PfDNV结构蛋白基因VP1含磷脂酶A2(PL A2)功能区片段,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了western blot鉴定,结果表明成功表达PfDNV结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础.     

重组小鼠树突状细胞因子DCF1的原核表达和纯化

目的:克隆小鼠重组树突状细胞因子DCF1蛋白进行原核表达、纯化与鉴定.方法:采用PCR从小鼠脑cDNA克隆dcf1基因,构建DCF1原核表达重组质粒(pET30a-DCF1)并转化E.coli的BL21(DE3)菌株.IPTG诱导重组蛋白表达,并在变性条件下经Ni sepharose FF6亲和层析柱纯化,再通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定.结果:成功克隆到大小为972bp的小鼠源dcf1基因片段并准确插入表达载体pET30a,0.1 mmol/L IPTG诱导转化菌2h可表达大量的DCF1蛋白,并可经Ni Sepharose FF6柱亲和层析得到高度纯化.结论:成功获得纯化的42kDa重组小鼠DCF1蛋白,为后续进行DCF1蛋白功能研究奠定了基础.     

MMP-9-PEX原核表达、纯化及其对结肠癌细胞侵袭能力的影响

用RT-PCR法扩增出基质金属蛋白酶-9(MMP-9)C末端血红素结合蛋白样结构域(PEX),克隆至表达载体pET32a中并转化至E.coilBL21(DE3),经IPTG诱导后在约为42kDa处发现有外源基因的表达,密度扫描显示表达蛋白含量占菌体总蛋白的50%左右。重组蛋白质pET32a/PEX主要以包涵体形式表达,其在上清液中的含量极微。含8mol/L尿素和10mmol/LDTT的裂解缓冲液溶解的包涵体采用金属整合层析有效分离出目标蛋白,纯化后pET32a/PEX蛋白质的纯度大于90%。在Transwell实验中发现复性纯化后的重组蛋白质pET32a/PEX能抑制结肠癌细胞的侵袭,且呈剂量依赖性。     

海南坡鹿CDC42 cDNA的克隆、原核表达及纯化

应用RT-PCR方法对海南坡鹿细胞分裂周期蛋白42(Cell division cycle 42,CDC42)编码区进行扩增,将扩增产物与PET-42a载体连接,重组质粒鉴定正确后,进行生物信息学分析;构建pET42a-hdCDc42表达载体,经IPTG诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE、可溶性分析、纯化及Wes...     

牛分枝杆菌MPB51基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB51成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。通过TA克隆技术,将PCR产物克隆至pGEMT Vector中,成功地构建出克隆质粒pGEMT51。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEMT51和pET28a(+),并将纯化的MPB51基因亚克隆至pET28a (+)中,构建出原核表达质粒pET28a51。将pET28a51转化至感受态E.coli BL21（DE3）中,经IPTG诱导和SDSPAGE分析,可见约30kD外源蛋白带。Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB51的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础。     

HPV16+治疗性无佐剂蛋白疫苗—HPV16Z- Hsp65-E6/E7的构建、表达及纯化工艺研究

目的：研制针对我国宫颈癌高危相关的HPV16型的治疗性无佐剂蛋白疫苗。方法：应用PCR技术自我国山西宫颈癌高发现场分离到的毒株-HPV16z中获得E6/E7转化基因片段,自卡介苗菌株中克隆获得Hsp65基因片段,对E6/E7基因片段定点突变修饰,构建pET28a-Hsp65-E6/E7表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白,并研究重组蛋白的纯化方案和工艺。结果：成功构建pET28a-Hsp65-E6/E7重组表达载体,E6/E7突变位点正确,融合蛋白在亲和层析柱上正确复性和初步纯化,经阴离子交换色谱纯化后蛋白纯度达到95%。结论：该研究为无佐剂治疗性重组蛋白疫苗Hsp65-E6/E7的进一步功能研究奠定了基础。     

重组人TACE的解整合素域对人肺腺癌A549体外增殖、粘附和侵袭的抑制作用

为了解人TACE的解整合素域对肿瘤细胞粘附和侵袭的影响以及其独立于其他结构域发挥作用的能力,从单核细胞系THP1中提取RNA,RT-PCR扩增出TACE全长基因,构建了pMD18T-TACE载体。对pMD18T-TACE质粒进行PCR,分别扩增T300(300bp,编码解整合素域)、T800(800bp,编码酶催化域)及T1300(1300bp,编码胞外域)三个片段,将其分别亚克隆至表达载体pET28a( )。把质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物均以不溶性包涵体形式存在。经过溶解包涵体、BBSTNTA树脂柱亲和层析并透析复性,获得高纯度的三种活性蛋白。MTT法、细胞粘附实验、Transwell小室侵袭实验分别显示TACE解整合素域、胞外域蛋白均能明显抑制A549细胞的增殖,且以剂量依赖性的方式抑制A549细胞与纤维粘连蛋白的粘附,并能抑制Transwell小室中A549细胞对Matrigel模拟的天然基底膜的侵袭,而酶催化域蛋白则无相应的抑制能力。表明重组TACE解整合素域蛋白可独立抑制肿瘤细胞的增殖、粘附和侵袭,为深入研究该区域的作用及TACE在肿瘤发病中的机制提供了新的认识。     

冠状病毒HcoV-229E S1蛋白的原核表达及鉴定

目的克隆表达冠状病毒HcoV-229E S1基因片段,表达S1蛋白。方法合成冠状病毒HcoV-229ES1蛋白特异性基因片段并克隆入pET21a原核表达载体,转化BL21（DE3）菌,经IPTG高效诱导表达得到重组蛋白,用金属螯合亲和层析纯化,并通过Western blot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果获得了主要以包涵体形式存在的目的蛋白,Western blot鉴定其为S1基因片段蛋白。结论成功构建了HcoV-229E S1蛋白的表达载体,并在BL21（DE3）中得到了高效表达,为下一步表达蛋白免疫原性及疫苗抗病毒保护性测定打下了基础。     

人IL-3基因原核表达载体的构建及表达

目的：构建人IL-3基因原核表达载体pET32a-IL-3,并在大肠杆菌中诱导表达。方法：通过佛波酯（TPA）和植物球血凝素（PHA）刺激人T淋巴细胞系Jurkat细胞,增加IL-3mRNA表达水平,提取mRNA,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）获得cDNA,以Jurkat细胞cDNA为模板,通过PCR方法扩增得到人IL-3基因,将其克隆入原核表达载体pET32a（＋）中,将重组质粒转化入大肠杆菌宿主菌株BL21中,以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白表达,并通过改变IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等条件最终实现蛋白的可溶性表达。表达产物用SDS-PAGE检测表达情况。结果：酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体pET32a．IL-3。SDS-PAGE检测结果证明实现了人IL-3基因在大肠杆菌中的可溶性表达。结论：成功构建了人IL-3基因的原核表达载体并在大肠杆菌中获得了良好的表达。     

牛肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

为克隆表达牛肠激酶（enterokinase）轻链(EKL)编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化,从市售北方黄牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT-PCR方法扩增其cDNA片段,将此片段克隆于pUCmT载体中,经过特异性限制性内切酶酶切分析片段正确后,进行全序列分析。结果表明,克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致,得到了编码正确的牛肠激酶轻链基因全序列。随后,将目的基因片段插入pET39b中,构建了融合型表达载体pET39b-EKL,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。所获得的pET39b-EKL经过酶切鉴定和测序,证实其插入方向、读码框架正确,所表达重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子量为65 kDa,表达量达28%,通过镍亲和层析纯化得到融合蛋白DsbA-rEKL的单一条带。该粗酶经脱盐后在适宜的缓冲体系中21℃温育过夜,显示出较高的自催化切割活性,为进一步进行重组牛肠激酶活性的研究及应用奠定了基础。 Abstract:The objective of the study was to obtain the gene of bovine enterokinase light chain,which would be used in the cleavage and purification of fusion proteins．The fragment of bovine enterokinase light chain cDNA was obtained by RT-PCR from a sold bovine′s duodenal mucosa, then cloned into the pUCmT cloning vector and sequenced.Compared with the sequence deposited in GenBank,the cloned gene sequence is correct.Then the interested gene fragment was inserted into the pET39b expression plasmid.The recombinant vector pET39b-EKL was transformed into E.coli BL21(DE3) and induced by IPTG.It was confirmed that the nucleotide sequence was correct on the conjunction site between the recombinant DNA 5′terminal multi-cloning site and recombinant fragment after the analysis of the nucleotide sequence.SDS-PAGE analysis indicated that target product was about 65 kDa which occupied 28% of the total protein.A pure fusion protein was obtained by nickel chelating chromatogram using His*Binding Resin.After desalting and changing buffer,the crude kinase was incubated at 21℃ overnight and demonstrated a high autocatalytic cleavage activity.This investigation would be able to lay a foundation for enterokinase activity research and farther application of expression products on a large scale.