大肠杆菌trpBA和serA基因的串联表达

大肠杆菌trpBA基因编码的色氨酸合成酶(tryptophan synthetase, TSase)是色氨酸合成的关键酶; serA基因编码的磷酸甘油酸脱氢酶(D-3-phosphoglycerate-dehydrogenase, PGDH)为L-丝氨酸合成(色氨酸合成的底物)的关键酶。为了通过基因工程手段来增加色氨酸的产量, 在利用高效的原核表达载体pET22b(+)分别对trpBA和serA基因克隆表达的基础上, 采用PCR方法扩增了抗反馈抑制的serA和trpBA基因, 将两基因串联于pET22b(+)载体上, 共构建了4种方式的串联质粒, 实现了2种蛋白酶在大肠杆菌中的共表达。聚丙烯酰胺电泳分析显示, ABA-Ⅰ重组菌株在37 kD (PGDH)、29 kD(色氨酸合成酶的α亚基)、44 kD(β亚基)处均有明显的蛋白表达带。4种串联表达质粒重组菌的TSase酶活性, 分别比含空载体菌相应酶的活性提高2~4倍, PGDH酶活性分别提高约2.1~3.6倍。经摇瓶发酵实验表明酶活性较高的ABA-I菌株色氨酸合成量亦最高, 约为对照菌株的20.2倍。     

北京棒杆菌芳香族氨基酸转运蛋白基因敲除对L-色氨酸积累的影响

[目的]为了减少北京棒杆菌PD-67(Corynebacterium pekinense PD-67)从细胞外吸收色氨酸,降低细胞内色氨酸库的浓度,从而使色氨酸的反馈控制作用减弱,增加胞外L-色氨酸的积累量,构建北京棒杆菌PD-67的芳香族氨基酸转运蛋白基因aroP敲除的菌株,研究aroP基因敲除对菌株L-色氨酸积累的影响.并进一步研究在aroP敲除菌株中表达邻氨基苯甲酸合成酶(AS)基因对L-色氨酸积累的影响.[方法]运用PCR技术扩增aroP基因,与整合质粒连接后,用限制性内切酶法构建带有内部片段缺失的aroP基因的敲除载体.利用同源重组技术,敲除北京棒杆菌PD-67的aroP基因,构建菌株PD-67 ΔaroP,并用带有aroP基因的表达载体对PD-67ΔaroP进行互补验证.采用PCR技术扩增AS基因,与表达载体连接构建重组质粒.将重组质粒转入菌株PD-67ΔaroP,构建工程菌株PD-67 ΔaroP/pXAS.通过摇瓶发酵研究PD-67 AaroP和PD-67 ΔaroP/pXAS的发酵特性.[结果]经PCR验证获得了aroP基因缺陷的菌株.摇瓶发酵结果表明,与出发菌株相比,PD-67ΔaroP的L-色氨酸的积累量提高了65％.酶活分析结果表明,AS基因在菌株PD-67 △aroP中得到表达.AS基因表达使工程菌单位菌体产酸率提高了25.6％.[结论]北京棒杆菌PD-67中芳香族氨基酸转运蛋白基因arop的敲除能够提高胞外L-色氨酸的积累量.在arop基因敲除菌中表达AS基因,可以进一步提高工程菌的产酸率.     

谷氨酸棒杆菌metX、dapA基因敲除对苏氨酸合成的影响

谷氨酸棒杆菌中metX基因编码蛋氨酸合成途径关键酶高丝氨酸乙酰转移酶,dapA基因编码赖氨酸合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合成酶。为研究这两个基因缺失对苏氨酸积累的影响,以谷氨酸棒杆菌R102(AHVr)为出发菌株,通过重叠延伸PCR及同源重组技术分别构建了metX、dapA单基因缺失突变株R102ΔmetX、R102ΔdapA以及双基因缺失的突变株R102ΔmetXΔdapA。对出发菌以及上述3株重组菌进行初步摇瓶发酵试验,用HPLC法测定发酵液中苏氨酸含量。结果表明,发酵72 h后,3株重组菌的苏氨酸产量分别为2.58、2.38和3.01 g/L,比原始菌株分别提高了42.5%、31.5%和66.3%。     

L-色氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究

以代谢控制发酵理论为指导 ,对L -色氨酸产生菌的定向选育、摇瓶发酵条件、30L发酵罐发酵条件进行了研究。以谷氨酸棒杆菌Tx5 - 32 (Phe- +Tyr- )为出发菌株 ,经硫酸二乙酯 (DES)多次诱变处理 ,定向选育出一株L -色氨酸产生菌TQ2 2 2 3(Phe- +Tyr- +5 -MTr+5 -FTr+SGr+CINr)。以摇瓶分批发酵最优条件为基础 ,对菌株TQ2 2 2 3进行了 30L发酵罐分批发酵试验 ,该菌株发酵 6 4h ,产L -色氨酸 7.2 8g·L- 1 。     

lysC定点突变及lysC、asdA串联表达对谷氨酸棒杆菌L-苏氨酸积累的影响

lysC、asdA基因分别编码的天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)和天冬氨酸半醛脱氢酶(Aspartate semi-aldehyde dehydrogenase,ASD)是L-苏氨酸合成途径中两个关键限速酶基因,其中AK受到代谢产物赖氨酸与苏氨酸的协同抑制。以选育获得的一株谷氨酸棒状杆菌T11(Corynebacterium glutamicum T11)为出发菌株,通过构建lysC-asdA串联表达盒,并对其关键限速酶基因lysC进行定点突变,突变位点为Ala279Thr,获得抗反馈抑制突变型编码基因lysCr-asdA,将其插入含强启动子tac的穿梭表达载体pZ8-1中成功构建串联表达质粒pZ8-1-lysCr-asdA转化出发菌株,筛选获得工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA。摇瓶发酵其L-苏氨酸产量达到7.18 g/L,较出发菌株提高27.8%。进一步的30 L发酵罐补料分批发酵结果显示,发酵60 h L-苏氨酸产量达65.5 g/L,糖酸转化率达到39.5%,较出发菌株分别提高29.5%和33.9%,为后续的进一步构建高产L-苏氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株提供强有力的基础。     

过表达pps基因和aroG~(fbr)基因对北京棒杆菌L-色氨酸合成的影响

【目的】通过增加北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)PD-67芳香族氨基酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的供应,解除终产物对芳香族氨基酸合成途径中第一个酶同时也是关键酶3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶(DS)的反馈抑制并提高抗反馈抑制的DS的活力,使碳流更多地流向芳香族氨基酸合成途径,从而积累更多L-色氨酸。【方法】运用PCR技术扩增北京棒杆菌PD-67磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因pps,与表达载体连接构建重组质粒pXPS;运用重叠PCR技术定点突变大肠杆菌(Escherichia coli)受苯丙氨酸调控的DS基因aroG,使相应的编码氨基酸序列发生突变:Leu175Asp,新的基因命名为aroGfbr,与表达载体连接构建重组质粒pXA;构建pps和aroGfbr的共表达重组质粒pXAPS。将3个重组质粒分别转入菌株PD-67,构建工程菌株PD-67/pXPS、PD-67/pXA和PD-67/pXAPS。通过摇瓶发酵研究工程菌株的发酵特性。【结果】酶活分析结果表明,pps基因和aroGfbr基因在北京棒杆菌PD-67中均实现了表达。工程菌株PD-67/pXA粗酶液DS抗反馈抑制分析表明,AroGfbr已解除酪氨酸和苯丙氨酸的反馈抑制。过表达pps基因和aroGfbr基因分别使工程菌L-色氨酸产量提高12.1%和26.8%,双基因共表达可使工程菌的产酸量提高35.9%。【结论】北京棒杆菌PD-67pps基因的过表达以及大肠杆菌来源的解除反馈抑制的aroGfbr的过表达均有助于增加PD-67 L-色氨酸的合成,而双基因的共表达可以进一步提高L-色氨酸的积累量。     

L-精氨酸高产菌株的选育

以谷氨酸高产菌种LH谷氨酸棒杆菌为出发菌株,用化学试剂亚硝基胍(NTG)诱变,经结构类似物磺胺胍和摇瓶产酸筛选,获得一株产L-精氨酸的菌株LH425,在摇瓶发酵中,培养96h,产酸率38g·L-1。     

谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶编码基因hom的敲除

本研究以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）标准菌株ATCC 13032染色体为模板,设计引物PCR扩增高丝氨酸脱氢酶编码基因（hom）,在hom基因内部插入一段来源于质粒pET28a的卡那霉素抗性基因（Km）,得到基因元件hom::Km;通过电击转化法将hom::Km转入出发菌株替换原菌株的hom,在含卡那霉素的平板上挑取阳性转化子,通过PCR验证得到高丝氨酸脱氢酶缺陷的重组菌。发酵结果表明重组菌C.g- hom::Km -8发酵60小时赖氨酸产量达到4.7 g／L,是出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032（0.7 g／L）的6.7倍。     

耐温性L-谷氨酸发酵菌种的选育

应用基因组改组技术提高,L-谷氨酸生产菌在高温发酵条件下的谷氨酸产量。以天津短杆菌T6—13变异株SW07-1为原始亲株,分别经紫外线（UV）-硫酸二乙酯（DES）和X射线诱变,获得5株耐温性能略有提高的突变菌株。经2轮基因组改组,获得耐高温（能在44℃生长）的L-谷氨酸菌株F2-50。F2—50在38℃下,摇瓶发酵40h,发酵液中L-谷氨酸浓度比原始出发菌株提高了近41％,在41℃高温下,摇瓶发酵40h,L-谷氨酸浓度比原始出发菌株提高了近2倍。     

产L-谷氨酸工程菌株的诱变选育及其发酵效率

以高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌GY1为研究对象,采用ARTP进行全局诱变,进一步提高L-谷氨酸的发酵水平。首先,对谷氨酸棒杆菌GY1原生质体的制备及再生条件进行优化,接着,根据致死率选择最佳的ARTP处理时间,然后,采用96微孔板及摇瓶发酵的方式对突变株进行筛选,最后,对获得的优良突变株进行50 L罐发酵验证。结果显示,溶菌酶浓度为10.0 mg/mL,酶解90 min,原生质体形成率和再生率达到最佳。ARTP最佳处理时间为40 s,致死率达到89.6%,经过初筛与摇瓶复筛,获得突变株YAG117,其摇瓶发酵L-谷氨酸含量达16.3 g/L,较出发菌株提高13.9%,且连续传代五代遗传稳定。50 L补料分批发酵条件下,L-谷氨酸产量在36 h最高,达到216.6 g/L,较出发菌株提高12.9%,糖酸转化率达68.87%,比出发菌株提高了10.2%。ARTP处理GY1菌株原生质体,能够有效积累有利突变,提高突变株发酵生产L-谷氨酸的能力,获得的突变株YAG117也显示了较好的工业化应用潜力。     

一步法生产1,5-戊二胺谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建

1,5-戊二胺是一种重要的化工原料,发酵法生产1,5-戊二胺是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径。以蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)AS1.1009基因组为模板,通过PCR扩增,得到大小约为2.2kb的赖氨酸脱羧酶基因ldc。以大肠杆菌(Escherichia coli)/谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)穿梭质粒pXMJl9为载体,将扩增得到的目的基因片段克隆至谷氨酸棒杆菌C.glutamicum TK260512,获得重组菌株C.glutamicum TK260512/pXMJl9-ldc.在摇瓶发酵水平上,通过IPTG诱导ldc基因的表达,并采用反相高效液相色谱方法测定了发酵液中1,5-戊二胺的含量,结果显示,经36h发酵,工程菌C.glutamicum TK260512/pXMJ19-ldc的1,5-戊二胺产量为0.96g/L。     

谷氨酸棒杆菌NAD激酶的过表达对L-异亮氨酸合成的促进作用

NAD激酶催化辅酶Ⅰ[NAD(H)]发生磷酸化,转变成辅酶Ⅱ[NADP(H)],而还原态辅酶Ⅱ(NADPH)是L-异亮氨酸合成的必要辅因子。为了提高NADPH的供应,首先克隆了谷氨酸棒杆菌NAD激酶基因ppnK,并利用大肠杆菌-棒状杆菌诱导型穿梭表达载体pDXW-8和组成型穿梭表达载体pDXW-9在L-异亮氨酸合成菌——乳糖发酵短杆菌JHI3-156中进行表达。摇瓶发酵后,ppnK诱导表达菌JHI3-156/pDXW-8-ppnK的NAD激酶酶活(4.33±0.74 U/g)比pDXW-8空载菌提高了83.5%,辅酶Ⅱ与辅酶Ⅰ的比例提高了63.8%,L-异亮氨酸产量(3.86±0.12 g/L)提高了82.9%;ppnK组成表达菌JHI3-156/pDXW-9-ppnK的NAD激酶酶活(7.67±0.65 U/g)比pDXW-9空载菌提高了2.20倍,辅酶Ⅱ与辅酶Ⅰ的比例提高了1.34倍,NADPH含量提高了21.7%,L-异亮氨酸产量(2.99±0.18 g/L)提高了41.7%。这说明NAD激酶有助于辅酶Ⅱ的供应和L-异亮氨酸的生物合成,这对于其他氨基酸的生产也有一定的参考依据。     

谷氨酸棒杆菌H+-ATPase基因失活提高谷氨酸产生量

为了证实在谷氨酸棒杆菌中,利用H⁺-ATPase基因失活构建高产谷氨酸基因工程菌的应用可行性,通过重组PCR技术部分缺失H⁺-ATPaseγ亚基基因序列,采用插入失活方法构建H⁺-ATPase失活的谷氨酸棒杆菌。考察了其谷氨酸产生能力及对生长速率的影响。实验结果表明,H⁺-ATPase失活的谷氨酸棒杆菌在含有100g/L的葡萄糖培养基中摇瓶发酵,其谷氨酸最大累积量为51.6g/L, 比野生菌株提高了42.9%。生长速率研究结果表明,H⁺-ATPase失活的谷氨酸棒杆菌生长速率略低于野生谷氨酸棒杆菌。证实了H⁺-ATPase基因失活对提高谷氨酸产量的作用,为利用H⁺-ATPase基因构建高产谷氨酸基因工程菌株提供了科学依据。     

来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶在毕赤酵母和枯草杆菌中的表达

通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-CGT酶基因,将基因片段分别克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K和大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pMA5中,分别转化毕赤酵母KM71和枯草杆菌WB600。结果表明,重组毕赤酵母发酵上清液中α-CGT酶活性仅0.2U/mL,重组枯草杆菌产酶达到1.9U/mL。对重组枯草杆菌发酵条件进行了优化,当以TB为出发培养基,初始pH6.5,温度为37oC时,摇瓶培养24h后α-CGT酶环化活性达到4.5U/mL(水解活性为3200IU/mL),是野生菌株软化芽孢杆菌表达量的9.8倍。     

枯草芽孢杆菌聚谷氨酸合成途径相关基因功能研究

聚谷氨酸(polyglutamic acid, PGA)作为一种天然多功能的聚合物,近年来成为研究的热点。由于很难通过化学方法合成,微生物发酵是目前生产聚谷氨酸的有效途径。【目的】从基因水平探究枯草芽孢杆菌聚谷氨酸合成途径中degS、degQ、degU、swrA、rocA、putM基因的功能,通过分子改造实现对代谢途径的调控。【方法】以枯草芽孢杆菌为出发菌株,通过对代谢途径中相关基因进行敲除或过表达,分别构建degS、degQ和degU基因缺失的重组菌,swrA、rocA和putM基因过表达的重组菌,借助菌株胞外聚谷氨酸积累的变化分析影响途径的关键节点。【结果】在摇瓶发酵条件下,重组菌Bacillus subtilis 168-swrA、Bacillus subtilis 168-rocA、Bacillus subtilis 168-putM的胞外聚谷氨酸含量分别是原始菌株的1.28倍、1.47倍和1.37倍。重组菌Bacillus subtilis 168-ΔdegS、Bacillus subtilis 168-ΔdegQ、Bacillus subtilis 168-ΔdegU的胞外...     

双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD在谷氨酸棒杆菌JNR中的功能

【目的】通过改造谷氨酸棒杆菌JNR中双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD,减弱尿苷酰去除酶的活性,增强NH_4~+的转运和利用,提高L-精氨酸的合成。【方法】本文对来源于谷氨酸棒杆菌的突变菌株JNR中的双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD进行整合突变,采用同源重组的方法将H_(414)和D_(415)位点突变为两个丙氨酸AA,在此菌株的基础上过量表达PII蛋白GlnK,并对其进行尿苷酰化研究,离子色谱检测摇瓶发酵过程中NH4+的浓度,并对最终的改造菌株进行连续流加发酵分析。【结果】该双功能尿苷酰转移/去除酶在谷氨酸棒杆菌中成功进行整合突变,有效减弱了尿苷酰去除酶的活性;同时过表达PII蛋白GlnK,其酰基化程度明显增强。摇瓶发酵结果表明菌株L4消耗NH_4~+增加,L-精氨酸产量为36.2±1.2 g/L,比对照菌株L3高出22.7%。5-L发酵罐实验结果显示改造菌株L4的L-精氨酸的产量为52.2 g/L,较野生型菌株L0提高了25.3%。【结论】谷氨酸棒杆菌合成L-精氨酸的过程中氮源是必不可少的。减弱GlnD尿苷酰去除酶的活性后,胞内尿苷酰化的GlnK-UMP增加,GlnK-UMP与氮转录调控因子AmtR结合,转运至胞内的NH_4~+浓度提高,促使L-精氨酸产量显著提高。     

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的敲除对北京棒杆菌PD-67的生理代谢的影响

【目的】为了优化L-色氨酸合成的前体供应,构建北京棒杆菌PD-67(Corynebacterium pekinense PD-67)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(EC:4.1.1.31,phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPCx)基因ppc敲除的菌株,并研究ppc基因敲除对菌株生理特性的影响。【方法】运用PCR技术扩增ppc基因的上游和下游序列,构建带有目标基因内部缺失的基因整合载体。通过同源重组技术将C.pekinense PD-67的ppc基因敲除,构建ppc基因缺陷突变株C.pekinense PD-67-Δppc。通过摇瓶发酵研究突变株的生理特性,并测定突变株丙酮酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性。【结果】PCR验证和PEPCx活性分析结果表明,筛选到ppc缺陷的突变株。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株相比,突变株的生长速率下降,生物量降低20%,L-色氨酸积累降低62%,丙酮酸激酶活力提高,而丙酮酸羧化酶活力下降。【结论】C.pekinense PD-67的ppc基因敲除以后,对菌株的代谢影响较大。仅通过阻断PEPCx催化的回补途径,减少磷酸烯醇式丙酮酸的分支代谢,不能提高该菌株L-色氨酸的积累。     

解淀粉芽胞杆菌关键酶基因过表达对鸟苷积累的影响

【目的】研究鸟苷生物合成途径中的3个关键酶编码基因(prs,purF,guaB)过表达对解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)发酵生产鸟苷的影响。【方法】利用穿梭表达载体PBE43,构建含有prs、purF和guaB基因的单独表达载体和prs、purF基因的串联表达载体,将它们分别转入鸟苷生产菌B.amyloliquefaciens TA208后,通过实时定量PCR测定各工程菌株内相关基因的转录水平;通过酶活检测分析关键酶基因扩增对肌苷酸脱氢酶活性的影响;通过摇瓶发酵实验考察工程菌株与对照菌株的生长、耗糖和鸟苷积累情况。【结果】转录分析结果表明prs、purF和guaB基因过表达的同时都伴随着自身转录水平的显著上调。与此同时,prs和purF基因单独表达均轻微下调了嘌呤操纵子的转录水平,但是guaB基因的过表达并不影响嘌呤操纵子和prs基因的转录。酶活分析结果表明prs和purF基因扩增并不影响肌苷酸脱氢酶的活性,guaB基因的扩增使其活性提高了126%。摇瓶发酵实验发现prs和purF基因的单独过表达均未促进宿主菌合成鸟苷,而含guaB基因过表达载体的工程菌鸟苷产量较出发菌株提高20.7%。将prs和purF基因串联表达后,鸟苷产量提高14.4%,糖苷转化率增加6.8%。【结论】过表达guaB基因能够大幅提高鸟苷产量,而prs和purF基因只有实现协同表达才能对宿主菌积累鸟苷产生积极影响,为通过代谢工程技术提高鸟苷产量奠定了研究基础。     

proC及putP基因的敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的影响

为了选育精氨酸高产菌株,基于谷氨酸棒杆菌的基因组尺度代谢网络模型的指导,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT-M4为出发菌株,通过基因敲除技术构建了pro C和put P敲除菌株。摇瓶发酵结果表明,pro C敲除菌株精氨酸产量达到9.94g/L,较出发菌株提高了15.90%,葡萄糖转化率提高了26.02%。由于其生长受到明显抑制,因此在发酵液中外源添加24mmol/L的脯氨酸,结果发现其精氨酸产量达到12.22g/L,且菌株恢复生长。put P敲除菌株精氨酸产量达到12.23g/L,较出发菌株提高了42.70%,葡萄糖转化率提高了49.31%。以上结果显示,put P的敲除比pro C的敲除更有利于精氨酸的合成,put P的敲除对菌株的生理代谢基本无影响且无需外添加脯氨酸。     

代谢改造重组谷氨酸棒杆菌C4途径高效合成5-氨基乙酰丙酸

5-氨基乙酰丙酸 (5-aminolevulinic acid,5-ALA) 在医药和农业等领域有着广泛作用,目前主要采用大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌以微生物发酵法合成。为了进一步提高谷氨酸棒杆菌合成5-ALA的能力,对其C4代谢途径进行了系统代谢改造。首先分别在谷氨酸棒杆菌中异源表达荚膜红杆菌和沼泽红假单胞菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶ALAS,选择酶活相对较高的沼泽红假单胞菌的RphemA基因作为关键合成酶基因,并筛选到能显著增强RphemA的酶活性的核糖体结合位点RBS5。重组菌株ALAS的比酶活可达 (221.87±3.10) U/mg,且5-ALA产量提高了14.3%;随后通过敲除α-酮戊二酸脱氢酶抑制蛋白基因 (odhI) 和琥珀酸脱氢酶基因 (sdhA),促进了前体琥珀酰CoA向5-ALA途径的流动;通过sRNA抑制hemB表达减少了5-ALA的降解;并且过表达半胱氨酸/O-乙酰丝氨酸转运蛋白eamA提高了5-ALA的输出效率;使用重组菌株C. glutamicum 13032/?odhI/?sdhA-sRNAhemB-RBS5RphemA-eamA摇瓶发酵,5-ALA最高产量达11.90 g/L,较出发菌株提高了57%。最后,在5 L发酵罐中进行补料分批发酵,48 h内5-ALA的产量达25.05 g/L,为目前以葡萄糖为碳源发酵的最高产量。本研究构建了高产5-ALA重组谷氨酸棒杆菌,具有良好的工业应用前景。