Myostatin基因打靶载体的构建及猪胎儿成纤维细胞Myostatin基因的敲除

目的:用缺口修复等技术构建Myostatin(肌肉生长抑制素,MSTN)基因打靶载体,并对大白猪胎儿成纤维体细胞进行转染,获得基因敲除细胞。方法与结果:首先构建用于MSTN基因同源长臂(LA)的抓捕载体,然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复,从含大白猪MSTN基因座的细菌人工染色体上亚克隆9.9 kb的LA到抓捕载体上,经过部分序列测定,同源性为100%;通过PCR获得1.4 kb的同源短臂(SA);将LA和SA连入载体pLOXP,构建含有neo和tk正负筛选标记基因的MSTN基因打靶载体pLOXP-MSTN-KO;将线性化的pLOXP-MSTN-KO通过电转染整合到大白猪胎儿成纤维细胞基因组中,利用G418和丙氧鸟苷进行药物筛选,获得抗性细胞克隆890个,通过PCR和DNA测序鉴定获得基因敲除的细胞克隆4个。结论:构建了有效的MSTN基因打靶载体,通过转染获得基因敲除细胞,为利用体细胞核移植制备MSTN基因敲除猪奠定了基础。     

BAI1基因敲除打靶载体的快速构建

BAI1(脑血管生成抑制因子1)因其具有抑制血管生成的作用而得名,研究表明肿瘤的发生可能与BAI1的低表达有关.为了进一步探索BAI1的作用机制,运用改良的Red重组系统和低拷贝中间载体,利用50 bp的同源重组序列直接从BAC载体中克隆长片段的小鼠基因组序列;将得到的基因组序列再次通过重组和改造,构建了BAI1基因的完全敲除并带有报告基因的打靶载体,为后续的构建BAI1基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因功能奠定了基础.     

鸡Myostatin基因单核苷酸多态性的群体遗传学分析

肌肉生长抑制素是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子,采用PCR－SSCP和测序的方法发现了5个位于Myostatin基因5′－和3′－调控区的单核苷酸多态性位点,对北京油鸡、白耳鸡、石歧杂、矮小黄鸡、小型黄鸡、惠阳胡须鸡、隐性白羽鸡、海兰、AA鸡等不同鸡种的该单核苷酸多态性分析结果表明：Myostatin基因的5′调控区引物P60／P61扩增片段多态性是由3个核苷酸的改变而产生的[分别是G→A（304位）、A→G（322位）、G→（344位）],引物P93／P94扩增片段的多态性是由G→A（167位）突变造成的,引物P117。P118PC扩增片段多态性是由T→C（177位）造成的。3′调控我引物P80／P81扩增片段多态性是由第7263位A突变为T造成的,引物P76／P77扩增片段多态性是由A→G（6935位）造成的。不同鸡种群体遗传学分析表明,5′－调控区引物60／P61扩增片段多态性片段多态性是由A→G（6935位）造成的。不同鸡种群体遗传学分析表明,5′－调控区引物P60／P61扩增片段多态性位点在北京油鸡的基因型频率分布与其他的品种有很大的差异,其BB型频率为0．700,AA基因型频率仅为0．033,而其他鸡种中以A基因优势;对于引物P93／P94,品种间的基因型频率差异极显著（P＜0．01）,北京油鸡和AA鸡的EE型频率鸡种中以A基因占优势;对于引物P93／P94,品种间的基因型频率差异极显著（P＜0．01）,北京油鸡和AA鸡的EE型频率低于其他品种,白耳鸡和海兰蛋鸡以EE型为主,其频率高于其他品种;3′－调控区引物P80／P81多态怀位点在9个鸡种中都是等位基因C占优势。引物P76／P77,总体上MM型的频率较低,杂合子MN型的频率较高。     

GPR126条件性基因敲除载体的快速构建

基因敲除小鼠模型是在动物体内研究基因功能的重要和可靠的手段之一,而构建用于同源重组的基因敲除载体是构建基因敲除小鼠模型的关键一步.条件性基因敲除技术将针对靶基因的修饰作用限制在小鼠的特定发育时期或特定类型的组织细胞中,通过加入具有位点特异性的重组系统,该修饰作用在时间和空间上均处于可调控的状态;条件性基因敲除技术既可以避免某些具有重要功能基因的敲除所带来的早期胚胎致死问题,还可用于精确分析某些多效基因在不同组织或不同发育阶段的特定功能差异.通过合理利用改良的Red重组系统,将两个LoxP位点快速准确地插入到了目标位置,实现了GPR126条件性基因敲除载体的快速构建,为后续的构建GPR126基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因的功能奠定了基础.     

2型猪链球菌Fbps基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:敲除2型猪链球菌(SS2)强毒株05ZYH33中的Fbps基因,研究该基因敲除对菌株生物活性及毒力的影响,为深入探讨猪链球菌致病机制提供实验基础。方法:从05ZYH33基因组中扩增Fbps基因上、下游同源臂,从pSET1质粒中扩增氯霉素抗性基因Cm,通过重叠PCR的方法将3个片段整合后连接到温敏自杀载体pSET4s上,电转入05ZYH33感受态细胞,通过改变培养温度实现双交换和质粒丢失,最后经抗性筛选获得敲除株05ZYH33ΔFBPS,分析敲除株的生物学性状,以CD1小鼠作为体外感染模型对突变株和野生株进行毒力比较。结果:PCR分析和测序结果均显示Fbps基因敲除成功,动物实验结果显示Fbps基因敲除后05ZYH33的毒力有所下降。结论:与野生株相比,突变株对小鼠的毒力有所降低。     

绵羊Myostatin基因启动子的功能分析

相比于Myostatin基因的作用机制而言, 对Myostatin基因转录和表达的调控机制了解很少. 为了更好地了解Myostatin基因5’调控区的结构和功能, 深入研究Myostatin基因的转录调控机制, 在最近的研究中克隆了绵羊Myostatin基因的启动子(Pro)序列(GenBank 登录号为AY918121). 进一步以EGFP为报告基因, 构建了各种长度的野生型MSTNPro^W-EGFP载体和E-box元件突变型MSTNPro^EM-EGFP载体, 通过转染C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞系或绵羊成纤维细胞后, 对各种情况下EGFP的瞬时或稳定表达进行荧光定量分析而比较不同条件下绵羊Myostatin基因启动子的转录调控活性. 结果表明, 0.3~1.2 kb的绵羊Myostatin基因启动子都能不同程度地驱动EGFP在C2C12细胞中的转录和表达, 其中1.2 kb片段的转录调控活性最高. 然 而, 将绵羊1.2 kb MSTNPro^W-EGFP载体转染绵羊成纤维细胞后并未观察到EGFP的表达, 说明Myostatin基因表达的肌肉特异性源于启动子的转录特异性. 对稳定转染绵羊1.2 kb MSTNPro^W-EGFP载体的C2C12细胞进行荧光分析, 结果表明细胞生长密度的增加可以反馈性抑制Myostatin基因的转录和表达. 在C2C12分化状态下, 1.2 kb野生型绵羊Myostatin基因启动子的活性比成肌状态时显著升高, 而1.2 kb E(3+5+7)突变型Myostatin基因启动子的活性在C2C12分化前后并未表现出差别. 这一结果暗示肌肉调控因子MyoD可能是通过与E-box结合而引起Myostatin基因在C2C12分化和生长状态时转录和表达差异的一个原因.     

进行性肌营养不良患者Myostatin基因的表达分析

进行性肌营养不良是一组以进行性骨骼肌萎缩和无力为特征的肌源性肌病。肌肉抑制素（Myostatin）是最近发现的骨骼肌生长发育抑制因子。为探讨Myostatin基因与进行性肌营养不良病理发生的相关性,采用RTPCR方法克隆了患者的Myostatin基因并测序、分析肌营养不良患者是否存在Myostatin基因突变;然后采用半定量RT-PCR方法检测患者中Myostatin基因的表达水平是否发生改变,同时用Western blot方法分析了肌营养不良患者中Myostatin蛋白的表达情况。结果发现,所研究的肌营养不良患者中没有携带Myostatin基因突变,但一些患者的Myostatin基因转录水平降低,部分患者Myostatin蛋白加工障碍。结果提示,一些类型（亚型）的进行性肌营养不良可能与肌肉抑制素Myostatin基因表达异常、蛋白加工障碍有关。     

酿酒酵母SNF4基因敲除缺失菌株的构建

构建一株酿酒酵母SNF4基因缺失菌株并研究其对乙醇产量的影响。扩增带有SNF4基因上下游同源序列和Kanr筛选标记的SNF4基因敲除组件,转化到酿酒酵母YS2获得阳性克隆子,然后将质粒pSH65转到阳性克隆子中,半乳糖诱导pSH65表达Cre酶切除Kanr筛选标记,获得SNF4等位基因完全缺失菌株YS2-△SNF4。发酵实验结果表明,缺失菌株YS2-△SNF4乙醇产量较出发菌株提高了7.57％。利用Cre-LoxP系统,成功构建了SNF4等位基因完全缺失菌株并提高乙醇产生量。     

猪链球菌2型srtF基因敲除突变株的构建及其毒力

利用同源重组基因敲除方法构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33 srtF同源突变体。组合PCR、交叉酶切、RT-PCR结果均显示srtF突变体构建成功。突变株与强毒株的菌落形态、生长速率以及对小鼠的致病力均无显著性差异。小鼠竞争实验结果提示,突变株在心脏的定殖及感染能力显著减弱。成功构建的srtF突变株为进一步研究srtF的生物学功能奠定了基础。     

靶向DENN-SV基因的shRNA真核表达载体的构建

该研究根据DENN-SV序列及shRNA设计原则,设计四个靶点序列,退火后用DNA重组技术与pRNAi-U6.1/Neo空载体连接,转化到感受态E.coli中。扩增菌株,抽提质粒,进行酶切、DNA测序鉴定。将重组的真核表达载体转染人乳腺癌MCF-7细胞并使用RT-PCR及Western blot检测其抑制DENN-SV mRNA表达的效率,以MTT法绘制生长曲线。测序结果与设计序列相同,并已成功转染进入人乳腺癌MCF-7细胞,可见GFP(绿色荧光蛋白)表达,且都具有抑制作用(P<0.01),DS-1组的抑制效果最好;MTT法绘制生长曲线结果表明,实验组经该载体转染后细胞增殖程度显著减少(P<0.05)。该研究应用RNAi技术成功构建了小干扰RNA重组体,为进一步研究乳腺癌基因治疗奠定了基础。     

人CCL20基因打靶载体的构建与鉴定

目的:构建针对人CC亚族趋化因子配体20(CC chemokine ligand 20,CCL20)基因外显子2的置换型打靶栽体.方法:设计和合成引物,利用长距离聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)从永生化人角质形成细胞系(HaCaT)基因组DNA中克隆出CCL20基因组DNA片段,再以CCL20基因为模板扩增出长度为1969 bp的同源短臂和2356 bp的同源长臂.分别插入pioxP栽体的Neo基因上游和下游,构建针对人CCL20基因外显子2的置换型打靶载体(ploxP-hCCL20).将打靶载体线性化并以电穿孔方法转移入HaCaT,观察克隆的形成.结果:经过PCR、限制性内切酶鉴定及DNA序列测定.证实该载体的两条同源臂包含人CCL20基因的外显子1、3、4及其邻近的部分内含子.结论:ploxP-hCCL20载体构建成功,增加Neo基因下游同源臂长度的策略有可能提高细胞基因敲除的同源重组率.     

神经粘附分子NCAM140基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的：构建有效的小鼠神经粘附分子（NCAMl40）基因的RNA干扰（RNAi）质粒载体,为研究NCAMl40参与的细胞信号通j咯转导、其生物学作用以及以NCAMl40为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi质粒。方法：使用基因序列软件设计、筛选符合公开文献筛选参数的4条靶序列以及1条阴性对照序列,由上海吉玛技术有限公司合成。与载体质粒pGPU6／GFP／Neo重组后．分别命名为pSi—ncal、pSi—nca2、pSi-nca3、pSi—nca4和pSi—control。转染大肠杆菌感受态细胞。选择阳性克隆进行DNA测序鉴定,、qCestemblot方法进行干扰靶点的筛选。选取干扰效率最高的质粒转染MN9D细胞,普通光学显微镜分别计数同一视野细胞总数及GFP阳性细胞数,计算转染效率。结果：酶切和DNA测序结果证实shRNA正确插入pGPU6／GFP／Neo质粒;Westernblot结果显示与空质粒对照组比较,pSi—nca4组细胞NCAMl40表达明显下调,细胞转染效率为62％。结论：成功构建靶向小鼠NCAMl40基因的RNAi质粒,为NCAMl40参与的细胞信号通路的研究以及以NCAMl40为靶点的基因治疗提供了稳定转染：细胞的干扰质粒,为研究其生物学作用奠定了分子生物学基础。     

Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的:构建干扰载体pSilencer 3.1-spl,并初步研究其对Spl基因的干扰作用.方法:根据Spl cDNA编码序列,设计并合成针对Spl基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer 3.1-Hl neo干扰载体中,构建Spl基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体pSilencer 3.1-Spl;分别将阴性对照载体pSilencer 3.1与重组载体pSilencer 3.1-Spl经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Spl基因的转录与表达水平.结果:构建了Spl基因siRNA真核表达载体pSilencer 3.1-Spl,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果.结论:特异性siRNA能明显抑制Spl基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Spl的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.     

小鼠MPI基因的打靶载体的构建和筛选

目的　构建小鼠MPI基因的基因打靶载体转染ES细胞 ,构建用于同源重组筛选的对照载体。方法根据计算机分析小鼠MPI基因的基因组序列 ,构建用于同源重组载体的长臂和短臂并且转染小鼠ES细胞 ,经抗性筛选后得到阳性克隆 ,抽提基因组DNA后用PCR的方法进行重组子的初步筛选。结果　成功构建了MPI基因的基因打靶载体并且摸索了用PCR的方法进行重组细胞初步筛选的方法。结论　这个载体的构建为MPI基因功能的研究打下了基础 ,同时用PCR方法进行初步筛选大大减少了Southern杂交的工作量 ;利用实验小鼠来研究印迹基因是非常有效的方法 ,它不仅能了解印迹基因在小鼠生长发育过程中的功能 ,而且进而有助于研究人的相应印迹区。     

核磷蛋白NPM1的RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定简

目的：构建高效抑制核磷蛋白NPMl基因的短发夹RNA（shRNA）干扰载体。方法：以人NPM1基因为靶序列,设计并合成shRNA序列,将其连入RNA干扰慢病毒载体p113．7;酶切鉴定插入shRNA序列片段的质粒,经测序正确后转染293T细胞;Western印迹检测得到抑制效果好的载体pll-shRNA,将其-9慢病毒载体共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染HTl080细胞,通过RT-PCR、Western印迹等方法验证其抑制效果。结果：酶切证实构建的载体pll-shRNA中已插入外源基因片段,转染293T细胞后都有抑制效果,其中pll-shRNA2的抑制效果最好;用pll-shRNA2病毒感染HTl080细胞,RT-PCR和Western印迹检测分别在RNA和蛋白质水平证实NPMl的表达显著降低。结论：构建的RNA干扰载体pll-shRNA2能有效抑制NPMl的表达,为NPMl功能的研究提供了有力工具。     

神经粘附分子NCAM140 基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

摘要目的：构建有效的小鼠神经粘附分子（NCAM140）基因的RNA 干扰（RNAi）质粒载体,为研究NCAM140参与的细胞信号通 路转导、其生物学作用以及以NCAM140 为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi 质粒。方法：使用基因序列软件设计、筛选符 合公开文献筛选参数的4 条靶序列以及1条阴性对照序列,由上海吉玛技术有限公司合成。与载体质粒pGPU6/GFP/Neo 重组后, 分别命名为pSi-nca1、pSi-nca2、pSi-nca3、pSi-nca4和pSi-control。转染大肠杆菌感受态细胞。选择阳性克隆进行DNA 测序鉴定, Western blot方法进行干扰靶点的筛选。选取干扰效率最高的质粒转染MN9D 细胞,普通光学显微镜分别计数同一视野细胞总数 及GFP阳性细胞数,计算转染效率。结果：酶切和DNA 测序结果证实shRNA正确插入pGPU6/GFP/Neo 质粒;Western blot结果 显示与空质粒对照组比较,pSi-nca4 组细胞NCAM140 表达明显下调,细胞转染效率为62 %。结论：成功构建靶向小鼠 NCAM140 基因的RNAi 质粒,为NCAM140 参与的细胞信号通路的研究以及以NCAM140为靶点的基因治疗提供了稳定转染 细胞的干扰质粒,为研究其生物学作用奠定了分子生物学基础。     

KLF4siRNA慢病毒载体构建和鉴定

目的:构建上皮锌指蛋白4(Krüppel-like factor 4,KLF4)siRNA慢病毒载体并进行初步鉴定,为研究KLF4在宫颈细胞癌中的分子机制奠定基础。方法:利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则,设计4个RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的单链DNA oligo,然后退火配对产生双链,再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性重组子后,送测序验证,测序结果经比对确认正确的克隆,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定并标定病毒滴度。收集上清液感染宫颈癌He La细胞,通过q RT-PCR及Western Blot鉴定KLF4 siRNA慢病毒干扰效果。结果:成功构建KLF4 siRNA慢病毒载体。KLF4 siRNA慢病毒感染He La细胞后,q RT-PCR及Western Blot测定结果显示,KLF4表达明显降低。结论:KLF4 siRNA慢病毒载体构建及包装成功,可有效抑制KLF4表达,为研究KLF4生物学功能奠定基础。     

通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定

为了构建适合大多数基因座位点打靶的通用型基因打靶载体及打靶成功后去除正选择标记基因,以克隆载体pGEM-3Z为骨架,插入了一个正选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因(neo).两个相同的负选择标记基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk1和HSV-tk2,并在neo的两侧各添加了一个方向相同的LoxP(10cus of crossing-over(X)in P1)序列及两个不同的多克隆位点序列,从而构建了载体pA2T.插入的两个不同的多克隆位点序列中,neo和HSV-tk1之间的多克隆位点序列有8个稀少的酶切位点、neo和HSV-tk2之间的多克隆位点序列有5个稀少的酶切位点,neo、HSV-tk1和HSV-tk2有各自独立的转录单元.脂质体法转染山羊成纤维细胞,用遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GAC)进行正负筛选,验证了正负选择标记基因的生物活性,证明通用型基因打靶载体pA2T构建成功.栽体pA2T转化组成性表达Cre重组醇(Cyclization recombination protein)的大肠杆菌BM25.8,检测到LoxP序列的生物活性,结果表明pA2T中的正选基因可以被Cre重组酶去除.因此,本研究所构建的通用型基因打靶载体pA2T,根据不同的基因座设计同源臂后,插入到MCS中可直接用于不同基因座位点的打靶,并能够在打靶成功后用Cre重组酶去除基因组中插入的neo基因,为用基因打靶的方法制作转基因动物提供了便利.