果胶酶基因片段的克隆及其序列分析

根据Genbank上登录的果胶酶基因序列设计三对不同果胶酶片段的引物,从本实验室已筛选的一株具有降解果胶质功能的细菌(暂编号为:C105)中克隆到了果胶裂解酶(PL)和果胶甲酯酶(PE)基因片段。通过分析,PL基因片段与PE基因片段均与来源Erwiniachrysanthemi的果胶裂解酶和果胶甲酯酶基因的同源性很高,达到90%以上。     

地衣芽孢杆菌碱性果胶酶基因PelA的克隆与原核表达

通过PCR扩增的方法,从本实验室筛选保存的Bacillus licheniformis DG-3 菌株中扩增出碱性果胶酶的结构基因pelA , 序列分析表明,所获PelA 基因与已报道的B.licheniformis 14A菌株的pelA基因的同源性为100%. 将pelA 基因在大肠杆菌中表达,发酵液菌体的碱性果胶酶酶活为12U/mL. 4～8 mmol/L的Ca2 对碱性果胶酶具有显著的激活作用.     

耐热碱性果胶酶产生菌的筛选及鉴定

本文以果胶为唯一碳源,在55℃下,从土壤中筛选出耐热碱性果胶酶产生菌20 株.进一步建立了果胶酶活性的定量测定方法:还原糖测定法和紫外测定法.经酶活力测定发现,4 株菌有较强碱性果胶酶活性,酶活力分别为3493、2983、2572、2561U/mL.4 株菌均为革兰阳性菌.对自行筛选的碱性果胶酶产生菌进行鉴定,其中活性最高的菌株M29 的16S rDNA 的序列分析表明与菌株Bacillus halodurans 的同源性高达99%,通过生理生化试验以及16S rDNA 的序列分析,鉴定碱性果胶酶产生菌为Bacillus halodurans M29.     

一株耐碱Mn-SOD高产细菌的分离、基因克隆及序列分析

首次从长白山温泉土中筛选得到了一株高产耐碱SOD的细菌,通过抑制剂试验确定了该菌所产SOD类型为Mn-SOD。通过形态特征、生理生化特征及16SrDNA基因序列分析,与芽孢杆菌Bacillus sp.MO6同源性高达100%,与地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis同源性为99%。根据地衣芽孢杆菌Mn-SOD序列,并结合GenBank中已发表的多种细菌Mn-SOD基因保守区,分别设计引物,PCR扩增获得600bp的Mn-SOD全基因序列和430bp的核心片段,克隆sodA全基因序列,构建重组质粒pMD18-SOD。     

枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的克隆和表达

目的:获得碱性蛋白酶基因。方法:用PCR的方法从枯草芽孢杆菌A-109中扩增碱性蛋白酶基因(apr),并进行测序分析,构建表达载体,最后转化大肠杆菌BL21,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测该基因的表达情况。结果:apr基因片段含1092个碱基对。该基因片段核苷酸序列与Bacillus amyloliquefaciens subtilisin DFE precursor有99%的同源性,对应的氨基酸序列与Bacillussp.DJ-4有99%的同源性。apr基因在大肠杆菌BL21中获得表达,并表现出蛋白酶活性。结论:获得了具有活性的新的碱性蛋白酶基因。     

双启动子对重组溶源性枯草杆菌中外源蛋白表达的增强作用

探讨了双启动子对基于溶源性噬菌体构建的重组枯草杆菌中外源蛋白表达的影响。分别将不含或含有本身启动子的α-淀粉酶基因(来源于Bacillus amyloliquefaciens)和青霉素酰化酶基因(来源于Bacillus megaterium)克隆到溶源性枯草杆菌中,得到重组菌B.subtilisAMY1,B.subtilisAMY2,B.subtilisPA1以及B.subtilisPA2。由于同源重组,所克隆的片段整合到溶源性枯草杆菌中的噬菌体基因组上,并处于噬菌体强启动子的下游。在重组菌AMY1和PA1中,在热诱导的情况下外源基因的转录只受到噬菌体启动子的作用,而在重组菌AMY2和PA2中,在热诱导下外源基因的转录同时受到噬菌体启动子和基因本身所带启动子的作用。双启动子的应用使重组α-淀粉酶的表达量提高了133%,使重组青霉素酰化酶的表达量提高了113%。     

高效产氢菌B49菌株adh和L-ldh基因克隆及序列分析

设计细菌adh基因和L-ldh基因简并引物,采用降落PCR并结合Cassette PCR方法从高效产氢菌B49中扩增全长基因.共获得两段基因组DNA片段.其中一段序列长1902 bp.包括adh基因开放阅读框 1101 bp,共编码366个氨基酸,编码产物分子量为 39.71 kD,理论等电点为pH5.93.该基因与Clostridium thermocellum ATCC 27405的adh位点序列一致性为73%.另一段序列长2490bp,包括L-ldh基因开放阅读框951 bp,共编码316个氨基酸,编码产物分子量为34.23 kD,理论等电点为pH 6.09.该基因与Bacillus megaterium的L-ldh位点一致性为74%.试验结果表明,采用CodeHop和Genefisher程序化设计的简并引物可信性强,阳性率高,CodeHop设计简并引物效果要好于Genefisher.adh和L-ldh的成功克隆为通过代谢工程手段敲除adh和L-ldh基因提供了科学依据,从而为进一步提高B49产氢能力的代谢工程研究奠定基础.     

锰氧化菌Bacillus sp. MK3-1的Mn(Ⅱ)氧化特性和除锰能力研究

锰氧化微生物能够将可溶的Mn(II)氧化为不溶的锰氧化物沉淀, 因此在生物除锰研究上具有重要的应用价值。本研究从锰污染土壤中分离到一株锰氧化菌Bacillus sp. MK3-1, 该菌对MnCl2有较高抗性, 其最低抑制浓度(Minimal inhibitory concentration, MIC)为20 mmol/L。实验表明该菌在培养基中Mn(Ⅱ)的去除率高达96%, 同时将其制成固体包埋菌剂应用于含0.15 mmol/L的MnCl2水溶液实验, 结果表明其仍然具有稳定的除锰能力, 去除率为87.12%, 使溶液的终锰浓度符合国家排放标准。扫描电子显微镜观察和能谱分析实验表明, 实验产生的锰氧化物均匀地分布在Bacillus sp. MK3-1的细胞表面, 细胞表面含锰量为19.60% (W/W)。用简并引物扩增目前被认为催化锰氧化的多铜氧化酶基因mnxG, 获得了903 bp的基因片段, 其基因产物与已报道的多铜氧化酶具有86%的同源性。     

解淀粉芽孢杆菌内源启动子的筛选及表达碱性果胶酶的应用研究

【目的】通过检测目的基因的转录水平和表达强度,筛选来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的内源启动子,确定适合碱性果胶酶基因表达的强启动子,并进一步对选用的强启动子进行分析。【方法】通过生物信息学手段对启动子片段进行预测与筛选,采用相对荧光强度、酶活力等表征手段进行分析,同时采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技术检测不同启动子的转录水平。【结果】启动子PrapA、PmetE-1、Phin-1表达碱性果胶酶的活力分别是P43启动子的9.8倍、4.8倍、3.0倍,筛选出的这3个强启动子为其他异源基因在解淀粉芽孢杆菌中的表达奠定了基础。【结论】通过生物信息学手段预测及筛选启动子,筛选得到比较强的启动子PrapA、PmetE-1和Phin-1,有效提高了碱性果胶酶的表达量。     

采用RT-PCR扩增方法从犁苞滨藜中扩增NHX基因

采用RT-PCR扩增的方法,从新疆野生植物犁苞滨藜中克隆获得1.7 kb的cDNA片段,测序和序列分析表明该基因片段包含NHX基因完整的读码框架.序列同源性分析结果显示犁苞滨藜NHX基因与滨藜NHX基因同源性高达95%,与碱蓬同源性达到86%,与柑桔同源性为88%,与拟南芥同源性为84%,表明它是植物中高度保守的一种基因,同时说明野生植物犁苞滨藜中也存在与拟南芥相似的植物耐盐相关基因.