分子标记技术在水杉研究中的应用

简述同工酶,RELP和以PCR为基础的RAPD,SCAR,SSR这几种分子标记在水杉的研究中应用现状,着重分析将分子标记应用于水杉（属）系统分类研究中的前景。     

大麻性别的RAPD和SCAR分子标记

利用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术获得与大麻性别连锁的分子标记,将10株雄性大麻或10株雌性麻的单个DNA样品等量混合分别组成雄性或雌性DNA池（DNApool),以提供具有相同遗传背景的雄,雄性DNA样品。每个随机引物分别用三个不同的循环程序进行PCR扩增,在30个随机引物中,用引物S401扩增得到一条约2．5kb雄性多态性片段,对该片段进行了克隆和序列分析 ,并根据序列分析结果将上述RAPD分子标记转化为重复性和特异性更好的SCAR（Sequence characterized amplified regions)分子标记。     

大麻性别的RAPD和SCAR分子标记

利用随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术获得与大麻性别连锁的分子标记.将10株雄性大麻或10株雌性大麻的单个DNA样品等量混合分别组成雄性或雌性DNA池(DNApool),以提供具有相同遗传背景的雌、雄性DNA样品.每个随机引物分别用三个不同的循环程序进行PCR扩增.在30个随机引物中,用引物401扩增得到一条约2.5kb雄性多态性片段.对该片段进行了克隆和序列分析,并根据序列分析结果将上述RAPD分子标记转化为重复性和特异性更好的SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregions)分子标记.     

谭清苏铁性别连锁的RAPD和SCAR分子标记

利用RAPD(Random amplified polymorphic DNA)分子标记技术,寻找谭清苏铁（Cycas tanqingii）中与性别相关的分子标记,筛选了160个10bp的随机引物,产生了2500多个RAPD条带。只有引物S0465 (CCCCGGTAAC)产生了一条大约500bp的雌性特异RAPD标记,该分子标记出现在所有的供试雌性植株中,而所有的供试雄性植株都不具有该标记。对该特异片段进行了克隆和序列测定,并根据序列分析结果将RAPD标记转化为重复性和特异性更好的特异特征序列扩增区域（SCAR）分子标记,并命名为STQC-S465-483。分子标记的建立可用于谭清苏铁幼苗性别的早期鉴定,为谭清苏铁就地保护和迁地保护提供技术支持。     

小尾寒羊微卫星与RAPD标记的研究

小尾寒羊是世界上具有非季节性发情和多胎特性的高繁殖率绵羊品种之一。选择4个位于绵羊6号染色体上且与FecB基因紧密连锁的微卫星标记,对小尾寒羊基因组进行PCR扩增后,采用最小二乘法估计各等位基因片段对产羔数的影响。分析结果表明,等位基因OarJIA-5、OarJIA-10、BM143-12和OarHH55-11可以作为小尾寒羊多胎位点的分子标记。从100条随机引物中筛选出18条引物,对小尾寒羊、大尾寒羊、洼地绵羊、滩羊等4个绵羊品种和鲁北山羊的基因组进行扩增,共扩增出146条带,其中94条表现出多态性,占64．60%,同时扩增出每个品种的特异性条带。采用Nei氏标准距离和NJ聚类分析对不同品种的遗传关系进行分析,结果表明,4个绵羊品种亲缘关系很近,提示它们可能起源于共同的原始祖先。     

可用于黑刺粉虱快速鉴定的SCAR分子标记技术

针对粉虱类害虫难以准确快速地进行形态鉴别的问题, 以局部发生的黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus (Quaintance)为对象, 采用特征序列扩增区域 (SCAR) 标记法, 研究其快速分子检测技术。利用SCAR标记技术获得了长度为987 bp的黑刺粉虱特异性片段 (GenBank登录号为FJ613323), 根据此片段的碱基序列设计黑刺粉虱特异性引物1对(AS-F518/AS-R938), 其扩增片段为421 bp。种特异性检验结果显示, 该对引物只对黑刺粉虱的基因组具有扩增能力, 对同域发生的桔绿粉虱 Dialeurodes citri (Ashmead)以及其他种类的粉虱如烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius) B型、Q型、ZHJ-1型和ZHJ-2型, 温室粉虱Trialeurodes vaporariorum (Westwood)以及螺旋粉虱Aleurodicus disperses (Russell)等的基因组不具有扩增效果。该引物不仅对成虫具有良好的扩增效能, 对卵、2龄若虫和拟蛹等亦具有同样的扩增能力, 其最低检出限为1/1 920头成虫。该技术体系的建立在茶树和柑桔苗木调运的害虫检疫和监测/检测中具有重要意义。     

应用RAPD分子标记技术研究苜蓿根瘤菌的田间竞争结瘤能力

以在温室条件筛选出与 Vector苜蓿品中匹配较好的根瘤菌系 CCBAU30 1 38和 Vector为材料 ,应用 RAPD技术研究CCBAU30 1 38田间竞争结瘤能力。结果显示 ,利用冻融法处理的根瘤、菌体提取的 DNA可以直接作为 PCR扩增的模板 ,扩增结果与以类菌体 DNA及总 DNA作为模板处理的结果相同 ;以根瘤处理物作为 PCR扩增的模板 ,应用 RAPD分子标记技术对接种菌 CCBAU30 1 38田间竞争结瘤能力进行研究 ,接种 1 4 0 d后 ,CCBAU30 1 38田间占瘤率为 4 7.7% ,表明该菌具有较强竞争结瘤能力和持久力。试验结果还说明 ,在接种菌与土著菌有差异的条件下 ,应用 RAPD技术开展竞争结瘤能力研究 ,可以直接以根瘤处理物作为 PCR扩增的模板 ,具有简易、快速、准确等优点     

基于特定引物PCR的DNA分子标记技术研究进展

SSR、SCAR、SRAP和TRAP是4种最新发展的基于特定引物PCR的新型DNA分子标记技术,具有简便、高效、重复性好等优点,已在遗传育种和种质资源研究等各个方面得到广泛应用。介绍了这4种分子标记的基本原理和特点,综述了它们在分子生物学研究中的应用。     

南蛇藤雌性性别相关的RAPD和SCAR标记

南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb)属卫矛科南蛇藤属落叶藤本植物,是中国传统中药材,雌雄异株,少量雄全同株。由于目前在分子水平上对南蛇藤性别差异的研究较少,极大地限制了对其的开发利用。本研究利用RAPD分子标记对南蛇藤雌株、雄株和雄全同株进行了差异比较。100个引物中有5个引物(S127、S140、S148、S174及S111)在不同性别南蛇藤的基因组DNA中扩增到存在明显差异的条带。根据序列分析的结果将RAPD引物转化成特异性较强的SCAR引物后,仅引物S111扩增出一条雌性特异性条带。序列分析发现,该片段包含两个超过100个氨基酸的开放阅读框,其功能有待进一步的研究。     

DNA分子标记技术在生态学研究中的应用

分子生物学几种常见的分子标记技术如RFLP,RAPD,微卫星法,DNA序列分析使生态学研究从宏观步入了微观领域,极大的推动了生态学的发展,对这几种分子标记技术在生态学中的应用及其进展进行了综述,并比较了这些分子生物学技术各自的优缺点.     

采用随机引物组合对绞股蓝作RAPD分析及SCAR鉴定

为寻找简单、可重复的分子鉴定方法,对绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum（Thunb．）Makino）新鲜品、药材干品及其混淆品乌蔹莓（Cayratia japonica（Thunb．）Gagnep）进行了鉴定。首先从2000余条10碱基的随机引物中筛选出20条,并以5条为1组随机分成4组,然后采用RAPD方法对7份不同来源的绞股蓝新鲜品进行扩增,对扩增得到的绞股蓝特征条带进行基因克隆、测序,分析序列特征,再设计特异性引物,最后．用绞股蓝新鲜品、药材干品及其混淆品乌蔹莓等样品进行PCR验证。结果显示：RAPD扩增能够得到7份绞股蓝新鲜品重复的共有特征条带;经基因克隆、测序并设计特异性引物后进行PCR验证,获得了绞股蓝特异序列扩增区域标志（Sequence—characterized amplified region maker,SCAR）。初步建立了区分绞股蓝及其混淆品乌蔹莓的分子鉴定标准,并首次将SCAR应用于绞股蓝分子鉴定中。     

一条卡瓦胡椒特异RAPD带转化成SCAR标记的研究

采用27份不同来源的胡椒属(Piper)材料和1份不同属的草胡椒(Peperomia pellucida)材料用引物OPQ-03扩增得到一条约400碱基对(bp)卡瓦胡椒特异片段。对该片段进行了克隆和序列分析,并根据序列分析结果将上述RAPD分子标记转化为重复性和特异性更好的SCAR(sequence characterized amplifiedre-gions,序列特征化扩增区)分子标记。本研究设计出了1对卡瓦胡椒特异SCAR引物P7.1(5′-GGT CAC CTC ACC GCA GCA GGA TGA ACG-3′)和P7.2(5′-GGT CAC CTC AAT GAC ATG GGA TGA ATC-3′),用这对特异引物对本次试验的28份材料进行PCR扩增,结果只有不同属的草胡椒材料无任何扩增,其它材料均扩增出了预期大小440bp的特异带。     

葎草雄性连锁的RAPD标记的克隆与SCAR标记的建立

应用随机扩增的DNA多态性（RAPD）技术可以快速简便获得雌雄异株植物雌雄株间的基因组差异信息,本文采用该技术对律草雌雄混合基因池进行了扩增,在选用的100条10bD的随机引物中,引物S1519和S2142分别扩增出长度为1207bp和762bp的雄性连锁标记,对其进行回收克隆和测序后发现这两个片段富含AT序列,AT含量分别为64％、54．7％,经核苷酸数据库BLAST检索未发现其同源序列。根据测序结果设计的SCAR引物可以将这两个雄性连锁的RAPD标记转化为稳定性和特异性更好的SCAR标记。     

谭清苏铁性别连锁的RAPD和SCAR分子标记

利用RAPD(Random amplified polymorphicDNA)分子标记技术,寻找谭清苏铁(Cycas tanqingii)中与性别相关的分子标记,筛选了160个10bp的随机引物,产生了2500多个RAPD条带。只有引物S0465(CCCCGGTAAC)产生了一条大约500bp的雌性特异RAPD标记,该分子标记出现在所有的供试雌性植株中,而所有的供试雄性植株都不具有该标记。对该特异片段进行了克隆和序列测定,并根据序列分析结果将RAPD标记转化为重复性和特异性更好的特异特征序列扩增区域(SCAR)分子标记,并命名为STQC-S465-483。分子标记的建立可用于谭清苏铁幼苗性别的早期鉴定,为谭清苏铁就地保护和迁地保护提供技术支持。     

基于RAPD标记的薄荷属(Mentha L.)植物亲缘关系分析

应用RAPD标记方法分析了薄荷属(Mentha L. )7个种38个种源间的遗传多样性,并采用UPGMA聚类分析方法探讨了38个种源间的亲缘关系.结果表明,用20条随机引物从38个种源的总DNA中共扩增出111条带,其中多态性条带91条,多态性条带百分率达81.98%,表明薄荷属植物种间和种内存在丰富的遗传多样性.聚类分析结果表明,在遗传相似系数0.43 处,供试的38个种源被分为2大类,其中第1大类包含日本薄荷(M. arvensis L. )、灰薄荷(M. vagans Boriss. )、留兰香(M. spicata L. )、皱叶留兰香(M. crispata Schrad. ex Willd. )、椒样薄荷(M.×piperita L. )和薄荷(M. haplocalyx Briq. )的37个种源,第2大类仅包含唇萼薄荷(M. pulegium L. )1个种源.在遗传相似系数0.74处,38个种源被分为6组:A组仅包含日本薄荷1个种源;B组包含灰薄荷的4个种源;C组包含留兰香的2个种源和皱叶留兰香的6个种源;D组包含椒样薄荷的5个种源和留兰香的2个种源;E组包含薄荷的17个种源;F组仅包含唇萼薄荷1个种源.在遗传相似系数0.83处,B组、C组、D组和E组可各自进一步划分为不同的亚组.研究结果显示,基于RAPD标记分析的聚类分析结果与传统形态学分类结果基本相吻合;同一种类来源相同或相近的种源聚在一起,说明薄荷属植物种内的遗传关系与地理分布和环境差异有一定的相关性.     

芽孢杆菌TS02特异RAPD标记的SCAR标记转化和验证

利用自主分离的蜡状芽孢杆菌菌株TS02, 采用RAPD方法对TS02及其同源性相近的5株芽孢杆菌(地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌) 进行了RAPD条带特异性分析, 从TS02基因组中筛选获得了一个533 bp的特异RAPD标记TSR1。TSR1克隆、测序后, 根据其序列设计出一对特异引物P1/P2进行扩增, 结果只在TS02中扩增得到目的片段, 而其余对照菌株扩增为阴性, 从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异SCAR标记。     

芽孢杆菌TS02特异RAPD标记的SCAR标记转化和验证

利用自主分离的蜡状芽孢杆菌菌株TS02,采用RAPD 方法对TS02及其同源性相近的5株芽孢杆菌(地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌)进行了RAPD条带特异性分析,从TS02基因组中筛选获得了一个533 bp的特异RAPD标记TSR1.TSR1克隆、测序后,根据其序列设计出一对特异引物P1/P2进行扩增,结果只在TS02中扩增得到目的片段,而其余对照菌株扩增为阴性,从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异SCAR标记.     

辣椒胞质雄性不育保持基因的分子标记

利用RAPD标记技术,以辣椒胞质雄性不育系8A及其同型保持系8B为材料,对辣椒胞质雄性不育基因和保持基因进行比较分析.结果表明:引物H7只在保持基因池有1条稳定的特异扩增带,在不育基因池未扩增出此条带,该标记可能与辣椒胞质雄性不育保持基因相连锁,命名为H7-F850.序列分析结果表明,标记H7-F850序列全长857 bp,GenBank登录号为GU208822.1.核酸序列比对结果显示,H7-F850与其具有部分同源性的片段大小均小于340 bp,未发现与其具有较高同源性的DNA序列.该RAPD标记H7-F850已成功转化为SCAR标记SF640.     

Characterization of a RAPD fragment unique to species with hairy fruit skin in the genus<Emphasis Type="Italic">Actinidia</Emphasis>

To develop a SCAR primer related to the hairy-fruit trait in the genusActinidia, we took a PCR-RAPD approach using arbitrary 10-mer primers. PCR with the UBC 376 primer generated specific fragments from three species with hairy fruit skin. Those fragments were then cloned to determine their nucleotide sequences. Two SCAR primers were designed from the UBC 376 primer and nucleotide sequences were obtained from the PCR fragments. A SCAR primer, OKC385, specifically amplified a 385-bp fragment from one clone ofActinidia eriantha, four ofActinidia chinensis, and four ofActinidia deliciosa. Deduced amino acid sequences of this fragment showed high sequence homology with plant cellulose synthases, which are involved in the biosynthesis of cellulose, a major cell wall component. The 385-bp fragment was specifically detected only in the seriesPerfectae C.F. Liang of sectionStellatae Li. This type has many hairs on the leaves, fruits, and stems, suggesting that the gene containing the PCR fragment is involved in hair formation in this phylogenetic group. Taken together, our results suggest that the SCAR primer, OKC385, can be used as a specific primer for early selection of the non-hair trait in breeding of the genusActinidia.