细极链格孢菌peaT2基因在毕赤酵母中的表达及蛋白功能确定

从细极链格孢菌表达文库获得阳性克隆子,序列分析表明,克隆的DNA片段中含有完整的开放阅读框架,将该基因命名为peaT2(GenBank登录号为EF212880)。用PCR法扩增peaT2基因的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/peaT2。重组质粒经SacⅠ线性化后用电穿孔法导入到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法筛选Mut 表型,获得了分泌表达的重组毕赤酵母。随机挑取一菌株作为表达菌,用甲醇诱导PeaT2蛋白表达。SDS-PAGE及Western blot检测结果均表明PeaT2在毕赤酵母中成功地分泌表达。用peaT2基因的表达蛋白处理小麦种子,生物测定表明,表达蛋白能明显促进小麦的生长,具有蛋白激发子作用。     

极细链格孢菌peaT1基因在毕赤酵母中的表达与功能 分析

建立了在毕赤酵母(Pichiapastoris)中分泌表达PeaT1蛋白的技术。将来源于极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)的基因peaT1亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K,构建了重组表达载体pPIC9K-peaT1,分别用SalI或BglII酶切线性化后电击转入毕赤酵母GS115菌株中,经MD平板筛选、PCR鉴定获得整合有外源基因的重组菌株。在α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,PeaT1在酵母中大量表达并分泌到胞外,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的表观分子量约为35kD。表达蛋白上清稀释液能诱导烟草产生对TMV的抗性,其枯斑数抑制率可达到30.37%。每升表达上清液经超滤浓缩和离子交换层析可纯化目的蛋白16.13mg,该纯化蛋白能显著地促进小麦幼苗的生长。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因 (BGL1),长度为2596 bp,连接到pGEMT载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株。重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4。培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL。     

西瓜花叶病毒HC-Pro基因在毕赤酵母中的分泌表达与功能研究

利用RT-PCR方法扩增出西瓜花叶病毒HC-Pro的基因,长度为1371bp,并构建了真核表达质粒pPIC9K-WHC。将重组质粒经SalⅠ单酶切后电转化Pichia pastoris GS115菌株,经PCR鉴定与G418、MD和MM培养基筛选,获得Mut⁺/His⁺表型高拷贝转化子。经1%甲醇诱导5d后,SDS-PAGE检测发酵液上清,在66kD处有一特异蛋白条带表达。Western blot 鉴定表明,表达蛋白可以和HC-Pro蛋白抗血清发生结合反应。Far-Western blot 证明该蛋白能与西瓜花叶病毒CP蛋白结合,支持了HC-Pro蛋白协助传毒的“桥梁”学说。     

TIMP-2在毕赤酵母中的克隆与表达

为了克隆人基质金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2）基因,并在Pichia pastoris中表达,根据GenBank上的TIMP-2的氨基酸序列和毕赤酵母偏爱密码子,通过化学合成和PCR相结合的方法获得了人的TIMP-2基因全长序列,构建了pPIC9-T2表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,并对表达产物进行了分离纯化和生物学活性分析。     

Bm-TFF2在毕赤酵母中的表达及鉴定

Bm-TFF2,一种从大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的两栖类三叶因子,具有比人三叶因子更强的生物学活性。该研究以Bm-TFF2的cDNA为模板,利用PCR方法扩增Bm-TFF2基因,然后插到含有AOX1启动子和α-因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中,采用毕赤酵母表达系统进行分泌表达,并用G418筛选高拷贝整合转化子。SDS-PAGE和Western blotting都检测到Bm-TFF2被分泌性表达于酵母上清。在1%的甲醇诱导表达不同时间后,重组蛋白在72h的表达量最大,可达50mg/L;而不同浓度的饱和硫酸铵沉淀菌液上清时,80%的饱和硫酸铵沉淀量最大。这些结果表明,重组质粒Bm-TFF2-pPIC9K成功构建并在真核细胞中高效表达,这为进一步研究Bm-TFF2的生物学活性及其结构与功能关系奠定了基础。     

西瓜花叶病毒HC-Pro基因在毕赤酵母中的分泌表达与功能研究

利用RT-PCR方法扩增出西瓜花叶病毒HC-Pro的基因,长度为1371bp,并构建了真核表达质粒pPIC9K-WHC。将重组质粒经SalⅠ单酶切后电转化Pichia pastoris GS115菌株,经PCR鉴定与G418、MD和MM培养基筛选,获得Mut⁺/His⁺表型高拷贝转化子。经1%甲醇诱导5d后,SDS-PAGE检测发酵液上清,在66kD处有一特异蛋白条带表达。Western blot 鉴定表明,表达蛋白可以和HC-Pro蛋白抗血清发生结合反应。Far-Western blot 证明该蛋白能与西瓜花叶病毒CP蛋白结合,支持了HC-Pro蛋白协助传毒的“桥梁”学说。     

虎源猫瘟热病毒VP2蛋白基因在毕赤酵母中的表达

克隆了虎源猫瘟热病毒VP 2蛋白基因并首次在Pichia pastoris酵母中进行了分泌表达。用特异性引物从虎源FPV中扩增出VP 2基因,将其克隆到pGEM-T载体中,得到重组质粒pTVP 2进行测序。用EcoR I和NotI双酶切pTVP 2,回收目的基因VP 2片段将其定向克隆到pPICZαA中,构建出重组质粒pPICZαAVP 2。将pPICZαAVP 2用SacI内切酶线性化后,电转化毕赤酵母细胞GS115,PCR法筛选阳性重组酵母,并用1%甲醇诱导表达。结果在重组酵母菌培养物上清中经SDS-PAGE检测到相对分子量约为32 kD的重组蛋白,W estern-b lotting证实该重组蛋白可以与FPV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明重组VP 2蛋白具有正确的空间构象,有望作为虎FPV感染的诊断和免疫预防用抗原。     

嗜热绿色糖单孢菌木聚糖酶XyN10A基因在毕赤酵母中的分泌表达及其酶学性质研究

木聚糖酶(Xylanase)可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素,由于其在饲料、食品、造纸等领域的广泛应用,越来越受到人们的关注。利用分子生物学技术首次成功构建了一株高效表达嗜热绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis)木聚糖酶SviXyN10A的重组工程菌,建立了SviXyN10A的毕赤酵母表达体系,实现了SviXyN10A在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达,并对表达产物进行了诱导表达及纯化,以及酶学性质的研究。结果表明,重组木聚糖酶SviXyn10A用甲醇诱导2 d后酶活即达到7.53IU/mL,最适反应温度为70℃,pH7.0。pH作用范围较广(pH5.0-9.0),具有较强的热稳定性和耐碱性,几乎没有纤维素酶活性,故可以应用在很多工业领域,尤其是在纸浆造纸行业具有很大的潜在应用价值。     

毕赤酵母蛋白表达系统研究进展

选择合适的蛋白表达系统是外源基因能否成功表达的关键.毕赤酵母(Pichia pastoris)蛋白表达系统是近些年来发展起来的一种真核表达系统,与其他表达系统相比,该系统所具有的诸多优势使其研究价值和应用价值越来越广泛,已经成功表达了多种蛋白质.简要综述其特点、表达宿主菌、表达载体以及其元件、外源蛋白的表达及其影响因素等方面的基础研究和最新进展.     

用于异源基因表达的毕赤酵母启动子研究进展

甲醇营养型毕赤酵母是一个广泛使用的蛋白表达宿主系统,易于高密度发酵、具有真核细胞翻译后加工修饰特点,适于异源蛋白分泌表达。转录调控是控制蛋白高效表达的关键环节,启动子是其中重要的元件。毕赤酵母表达系统中应用最为广泛的是甲醇诱导型AOX1启动子和组成型的GAP启动子,已成功用于一些异源蛋白的表达。近年来,发现了其他一些可供利用的启动子,包括来自管家基因的启动子如TEF、PGK1,以及具有特殊调控机制的启动子如FLD、PHO89等。此外,通过对启动子进行序列改造,构建启动子文库,实现了对启动子的精细调控。不同的启动子具有各自独特的调控机制与特点,就毕赤酵母启动子在异源蛋白表达应用中的相关研究进展进行综述。     

巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母是一种近年来广泛使用的基因表达系统,它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等许多优点.综述了该系统在载体类型、载体元件（包括启动子、选择标记和信号肽序列）、受体类型、以及提高整合拷贝数等方面的进展.     

Hepcidin的基因克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

根据已知hepcidin氨基酸序列,参照毕赤氏巴斯德酵母( Pichia pastoris) 密码子偏好性,设计合成了hepcidin目的基因。所合成的hepcidin基因全长96bp,其5′ 端引入KEX2基因产物（Kex2）的特异性识别位点序列,以保证表达产物具有天然N端。通过基因重组的方法将hepcidin基因克隆到pPicZαA 载体中,构建了分泌型重组酵母表达载体pPICZαA_Hepc,经电转至毕赤酵母GS115中表达。使用浓度高达1500 μg/mL的Zeocin 筛选得到高拷贝插入GS115菌株,经摇瓶发酵和甲醇诱导,上清液有明显的hepcidin表达,表达量达到100 mg/L。初步抗菌特性研究表明,该表达产物对枯草芽孢杆菌有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑菌效果不明显。     

High-Yield Expression and Purification of Human Interferon α-1 in Pichia pastoris

For several years, interferon α-1, also known as interferon α-D, has been studied for treatment of various viral diseases, such as hepatic fibrosis caused by hepatitis B, herpes simplex virus keratitis, and bovine respiratory diseases in calves. Currently, recombinant human interferon α-D (rHuIFNαD) is expressed intracellularly in Escherichia coli or secreted by Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae. In this report, we describe the process of obtaining a relatively high-yield secretion of biologically active recombinant rHuIFNαD using the Pichia pastoris system. The process produced as high as 0.7 mg of purified protein per 20 ml of shake culture of rHuIFNαD with better bioactivity than the commercially available rHuIFNαD molecule produced in E. coli.     

牛乳铁蛋白N-叶在毕赤氏酵母中的高效表达及抑菌性

[目的]本研究将牛乳铁蛋白的N-叶(BLF-N)克隆至毕赤氏酵母菌基因组中,通过密码子优化和发酵条件优化,实现BLF-N的异源高效表达,研究重组BLF-N的抑菌功能.[方法]本文以BLF基因为模板,按照毕赤氏酵母的密码子偏好性进行密码子优化,构建重组表达载体pPIC9K-UBLF-N,电击转化到 Pichia past...     

卡氏德巴利酵母植酸酶在毕赤酵母中的异源表达及优化

【背景】植酸是一种能螯合金属离子和蛋白质的有机磷类化合物,广泛存在于植物组织中,影响动物对营养元素的吸收。在饲料中加入植酸酶可有效降解植酸。【目的】构建毕赤酵母异源表达卡氏德巴利酵母(Debaryomyces castellii,D. castellii)植酸酶的菌株,促进卡氏德巴利酵母植酸酶的研究及工业应用。【方法】将卡氏德巴利酵母植酸酶基因进行密码子优化后转入毕赤酵母GS115中,通过筛选多拷贝、敲除蛋白酶、过表达分子伴侣及转运蛋白的方法获取优势菌株。【结果】所得重组菌株GS115/DCphy(ΔPep4)(BFR2)的产酶酶活是低拷贝菌株的7倍。【结论】研究结果为卡氏德巴利酵母植酸酶的异源表达及潜在工业应用提供了一定的指导。     

Synthesis of Drosophila melanogaster acetylcholinesterase gene using yeast preferred codons and its expression in Pichia pastoris

To improve the expression level of recombinant Drosophila melanogaster AChE (R-DmAChE) in Pichia pastoris, the cDNA of DmAChE was first optimized and synthesized based on the preferred codon usage of P. pastoris. The synthesized AChE cDNA without glycosylphosphatidylinositol (GPI) signal peptide sequence was then ligated to the P. pastoris expression vector, generating the plasmid pPIC9K/DmAChE. The linearized plasmid was homologously integrated into the genome of P. pastoris GS115 via electrotransformation. Finally seven transformants with high expression level of R-DmAChE activity were obtained. The highest production of R-DmAChE in shake-flask culture after 5-day induction by methanol was 718.50 units/mL, which was about three times higher than our previous expression level of native DmAChE gene in P. pastoris. Thus, these new strains with the ability to secret R-DmAChE in the medium could be used for production of R-DmAChE to decrease the cost of the enzyme expense for rapid detection of organophosphate and carbamate insecticide residues.     

Comparison of two expression platforms in respect to protein yield and quality: Pichia pastoris versus Pichia angusta

The methylotrophic yeasts Pichia pastoris and Pichia angusta (Hansenula polymorpha) were used for the comparative heterologous production of two model mammalian proteins of pharmaceutical interest, the NK1-fragment (22 kDa) of human hepatocyte growth factor and the extracellular domain (28 kDa) of mouse tissue factor (MTF). Both recombinant proteins were engineered to contain an N-terminal Strep- (WSHPQFEK) and a C-terminal His₆-tag. In addition, both proteins contained the pre-pro-sequence of Saccharomyces cerevisiae mating factor alpha to allow secretion. Following vector construction, transformation and zeocin amplification, the best Pichia producers were identified in a screening procedure using Western blot and a Luminex xMAP™ based high-throughput method. Recombinant NK1-fragment and MTF were purified from culture supernatants of the best producers by affinity chromatography (Ni–nitrilotriacetic acid columns). Using P. pastoris as a host for the synthesis of NK1-fragment a protein yield of 5.7 mg/l was achieved. In comparable expression experiments P. angusta yielded 1.6 mg/l of NK1-fragment. NK1-fragment apparently was not glycosylated in either system. For the production of MTF, P. pastoris was also the superior host yielding 1.2 mg/l glycosylated recombinant protein whereas P. angusta was clearly less efficient (<0.2 mg/l MTF). For both expression systems no correlation between the amount of recombinant protein and the copy number of the chromosomally integrated heterologous genes was found. In P. pastoris strains less degradation of the two model recombinant proteins was observed. Altogether, this paper provides a structured protocol for rapidly identifying productive Pichia strains for the synthesis of full-length recombinant proteins.