K55R与ep8叠加突变对扩展青霉脂肪酶热稳定性的改善

利用重叠延伸PCR对扩展青霉脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,构建了K55R与随机突变体ep8叠加突变的重组质粒pAO815-ep8-K55R。将该质粒电转化引入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,进行异源表达。实验结果表明:该叠加突变体在毕赤酵母中获得了活性表达,得到表达产物脂肪酶PEL-ep8-K55R-GS。其表达量为508u/mL,分别约为野生型脂肪酶PEL-GS(627u/mL)的81%,随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS(924u/mL)的55%;其比活力为2309.1u/mg,与随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS和野生型脂肪酶PEL-GS的相仿。叠加突变脂肪酶PEL-ep8-K55R-GS的最适作用温度为37℃,与野生型脂肪酶PEL-GS和随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS一致;其Tm值为41.0℃,比野生型脂肪酶PEL-GS提高了2.3℃,比随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS提高了0.8℃。表明叠加突变脂肪酶PEL-ep8-K55R-GS的热稳定性有了进一步的提高。     

K55R与ep8叠加突变对扩展青霉脂肪酶热稳定性的改善

利用重叠延伸PCR对扩展青霉脂肪酶（PEL）基因进行体外定点突变,构建了K55R与随机突变体ep8叠加突变的重组质粒pAO815-ep8-K55R。将该质粒电转化引入毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115,进行异源表达。实验结果表明：该叠加突变体在毕赤酵母中获得了活性表达,得到表达产物脂肪酶PEL-ep8-K55R-GS。其表达量为508u/mL,分别约为野生型脂肪酶PEL-GS（627u/mL）的81％,随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS（924u/mL）的55%;其比活力为2309.1u/mg,与随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS和野生型脂肪酶PEL-GS的相仿。叠加突变脂肪酶PEL-ep8-K55R-GS的最适作用温度为37℃,与野生型脂肪酶PEL-GS和随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS一致;其T_m值为41.0℃,比野生型脂肪酶PEL-GS提高了2.3℃,比随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS提高了0.8℃。表明叠加突变脂肪酶PEL-ep8-K55R-GS的热稳定性有了进一步的提高。     

K202A突变对扩展青霉脂肪酶热稳定性的影响

利用易错PCR定向进化扩展青霉脂肪酶（PEL）,获得了一株热稳定性有所提高的随机突变体（ep8）,ep8包含有一个氨基酸的改变。为进一步提高其热稳定性,作者利用重叠延伸PCR法,以ep8基因为模板,将第202位赖氨酸突变为丙氨酸（K202A）,构建表达质粒pAO815-ep8-K202A。并将其引入毕赤酵母GS115构建叠加突变体(PEL-ep8-K202A)。同时以野生型lip07为模板构建单点突变体:PEL-lip07-K202A。15% SDS-PAGE 结果分析表明突变体分子量与野生型一致,约为28KD. 表达产物热稳定性分析结果表明: 野生型（PEL）的Tm值为39.03℃,而以野生型为模板进行定点突变得到的单点突变酶（PEL-lip07-K202A）,其Tm却降低了2℃,为37.08℃。叠加突变酶(PEL-ep8-K202A)的Tm为41.66℃, 比野生型酶提高2.63℃,比随机突变体ep8生产的酶（PEL-ep8）的Tm提高了1.21℃。     

P197E与ep8叠加突变对扩展青霉脂肪酶热稳定性的影响

为提高脂肪酶的热稳定性,作者利用重叠延伸PCR对扩展青霉脂肪酶(PEL)基因进行了体外定点突变,构建了P197E(即将第197位的脯氨酸突变为谷氨酸)与随机突变体ep8叠加突变的重组质粒pPIC3.5K-ep8-P197E。将该质粒电转化至毕赤酵母Pichiapastoris GS115中,进行异源表达。与野生型酶和单点突变酶PEL-ep8的酶学性质比较,结果表明:叠加突变体PEL-ep8-P197E在40°C温育处理30min后,残余酶活分别比野生型PEL和随机突变体PEL-ep8提高了42.13%和37.3%。叠加突变体PEL-ep8-P197E的Tm值为41.51°C,比野生型酶PEL提高了2.81°C,比随机突变体脂肪酶PEL-ep8提高了2.25°C。通过对脂肪酶PEL的叠加突变,提高了该酶的热稳定性,并为结构与功能的进一步研究提供了材料。     

扩展青霉脂肪酶ep8与R182K叠加突变体的构建

利用重叠延伸PCR法对扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,并将含突变基因的重组质粒pAO815-ep8-R182K在毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中进行表达。叠加突变体PEL-ep8-R182K表达产物与野生型PEL、PEL-ep8比较实验表明:叠加突变体表达蛋白PEL-ep8-R182K最适反应温度与野生型PEL、PEL-ep8一致,均为40℃;热稳定性与野生型相似,比PEL-ep8降低2.25℃。但是,在比活上,PEL-ep8-R182K与PEL-ep8、野生型PEL相比,其比酶活分别提高了14.03%和3.86%。     

定点突变引入二硫键提高华根霉脂肪酶热稳定性的研究

拟对来源于华根霉(Rhizopus chinensis)的脂肪酶r27RCL进行二硫键的构建,从而提高该酶的热稳定性。利用二硫键构建软件Disulfide by Design 2. 0预测突变位点(T201),对野生型脂肪酶r27RCL进行定点突变。借助于毕赤酵母表达系统,对脂肪酶野生型r27RCL及突变体r27RCLT201C进行异源表达,并对其酶学性质进行研究和比较。热稳定性实验显示突变体r27RCL-T201C在60℃处理25 min后剩余酶活较野生型提高了17. 6%。此外,突变体的pH稳定性也较野生型有所提高。对脂肪酶r27RCL进行二硫键的构建有助于提高该酶热稳定性,使其能更有效地应用于工业生产。     

基于易错PCR定向进化扩展青霉 Penicillium expansum FS1884碱性脂肪酶

为改善扩展青霉FS1884碱性脂肪酶的活性及酶学性质,利用连续两轮易错PCR对扩展青霉FS1884脂肪酶基因PEL进行随机突变,在大肠杆菌JM109中构建突变文库。含突变脂肪酶基因的重组质粒电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,经过YPOM板初筛和橄榄油检验板复筛,获得一株酶活性提高的脂肪酶突变体:PEL-ep25-GS。与野生型脂肪酶PEL-GS相比,在最适温度40℃、pH9.4时突变体的酶活力是野生型酶的1.3倍。测序结果表明:该突变体第253位氨基酸发生了突变,由赖氨酸变成蛋氨酸。     

D92P点突变对扩展青霉碱性脂肪酶最适作用温度的改善

利用重叠延伸PCR法对扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,并构建了含突变基因的重组质粒pPIC3．5K—lip-D92P。将该质粒在毕赤酵母GS115菌株中表达。与野生型表达产物PEL-GS相比较,突变体表达产物PELD92P—GS最适作用温度为45℃,比野生型提高了5℃;其热稳定性与野生型相当;突变体在40℃下的表达量为109U／mL,约为野生型的29％。结果分析表明,Pro替代Asp^92后,可能是由于Pro一级结构的特点,使酶结构更加稳定,在高温下更适于与底物结合。     

基于易错PCR技术的黏质沙雷氏菌脂肪酶基因LipA的定向进化

利用易错PCR技术对黏质沙雷氏菌脂肪酶基因LipA进行定向进化,经过筛选最终获得一个比活力比野生酶提高了425 U/mg的突变体ep1,测序分析ep1有5个氨基酸发生了突变,与野生酶相比ep1的最适pH值由原来的8.5降低为7.5,Tm值提高3℃,Km值由原来的40 mg/mL降低为12.5 mg/mL.对其三维结构进行分析,推测酶学性质的改变可能与处在活性中心右前方双螺旋发卡结构上的158A、和处在下部β卷曲折叠拐角处的S375G的突变有关.     

E83V对扩展青霉脂肪酶最适作用温度的影响*

利用重叠延伸PCR法对扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)基因作了体外定点突变,获得了最适作用温度有所提高的突变体。含突变基因的重组质粒pPIC3.5K-lip-E83V在Pichiapastoris GS115中表达。对突变体表达产物PEL-E83V-GS与野生型表达产物PELGS作了比较:前者最适作用温度为45℃,比野生型提高了5℃;其热稳定性基本不变;突变体在37℃下的表达量为188U/mL,约为野生型的80%。最适作用温度的提高可能是由于83位亲水性的Glu用疏水性的Val取代,增加了脂肪酶