影响紫云英根瘤菌入侵和根瘤发育的exo基因的克隆及分析

紫云英根瘤菌菌株１０７的３个胞外多糖缺陷突变株ＮＡ－０１、０２、０４不具备诱导宿主植物紫云英结瘤的能力。以ＮＡ－０１突变位点的ＤＮＡ面为探针,从可互补这３个变种的ｅｘｏＲ’－１１质粒上亚克隆到２．６ｋｂ的ＤＮＡ片段。互补试验表明,２．６ｋｂ的片段不仅可纠正突变株的胞外多糖缺陷表型,而且使变种恢复诱导宿主植物形成有效根瘤的能力,２．６ｋｂ片段经Ｔｎ５定位突变后丧失这种恢复能力,表明该片段带有对应于３     

紫云英根瘤菌菌株107exo基因簇的遗传互补分析

紫云英根瘤菌菌株１０７经Ｔｎ５插入诱变,得到１２株胞外多糖缺陷型变种,以质粒ｐＭＮ２为载体,从其中７株ＥＰＳ＾－变种内分别构建了７个Ｒ－ｐｒｉｍｅ质粒（ｅｘｏＲ）大部分变种的ＥＰＳ＾－表型可被ｅｘｏＰ互补,恢复野生型表型（ＥＰＳ＾＋）。互补表明,１２株ＥＰＳ＾－变种可分为６个不同的互补群,其中５个在遗传上连锁,ｅｘｏＰ酶切分析,除ｅｘｏＲ－０２,ｅｘｏＲ－０４外,其余５只的外源片段均整合于ｐＭＮ２     

利用Tn5定位诱变筛选紫云英根瘤菌Exo^—变种

利用Ｔｎ５定位诱变方法,对质粒ｐＪＢＢ５进行Ｔｎ５插入诱变,得到１０个Ｔｎ５在５９ｋｂＢ５外源片段上有不同插入位点的质粒ＴＮ１１,ＴＮ１１２,ＴＮ２２,ＴＮ２３,ＴＮ３１,ＴＮ４１,ＴＮ９１,ＴＮ１０１,ＴＮ１３１,ＴＮ１４１。将Ｔｎ１１等分别转移到已经含有不相容质粒ｐＰＨ１ＪＩ的紫云英根瘤菌１０７菌株中,使之发生同源变换。通过抗性选择及表型鉴别,筛选到３株菌落表型干燥（Ｍｕｃ－）的酸性胞外多糖（ＥＰＳ）合成缺陷菌株（Ｅｘｏ－）１０７（ＴＮ２２）,１０７（ＴＮ１０１）,１０７（ＴＮ１３１）。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析证明这３株变种的Ｔｎ５插入确实是同源交换而不是转座产生,表明经过适当改良的Ｔｎ５定位诱变法可以应用于紫云英根瘤菌Ｅｘｏ－变种的筛选。     

紫云英根瘤菌菌株107exo基因簇的遗传互补分析

紫云英根瘤菌菌株１０７经Ｔｎ５插入诱变,得到１２株胞外多糖缺陷型变种,以质粒ｐＭＮ２为载体,从其中７株ＥＰＳ－变种内分别构建了７个Ｒ－Ｐｒｉｍｅ质粒（ｅｘｏＲ＇）,大部分变种的ＥＰＳ－表型可被ｅｘｏＲ＇互补,恢复野生型表型（ＥＰＳ＋）。互补表明,１２株ＥＰＳ－变种可分为６个不同的互补群,其中５个在遗传上连锁。ｅｘｏＲ＇酶切分析,除ｅｘｏＲ＇－０２,ｅｘｏＲ＇－０４外,其余５只的外源片段均整合于ＰＭＮ２的两同向重复序列ＩＳ２１之间。     

紫云英根瘤菌107菌株exo基因簇非连锁突变位点的克隆

用鸟枪法从3株紫云英根瘤菌107菌株的胞外多糖合成缺陷变种（Exo-）NA－05、NA－07和NA－08中克隆获得含有107菌株exo基因及Tn5的exo::Tn5片段。以pRK415为载体构建107菌株EcoRI酶切后DNA片段的部分基因库,用exo::Tn5做探针原位杂交得到一个阳性克隆。该克隆的外源片段4．2kb能恢复3个变种的多糖表型及结瘤固氮能力。酶切分析和Southern杂交表明,3株变种中Tn5插入位点相近。     

紫云英根瘤菌Exo^—变种的生理遗传及胞外多糖组分分析

从质粒ｐＪＢ１１－Ｂ６的８．５ｋｂ野生型ＤＮＡ片段中克隆到５．８ｋｂ和２．６ｋｂ的ＤＮＡ片段,其中５．８ｋｂ的片段互补紫云英根瘤菌１０７菌株的胞外多糖（ＥＰＳ）缺陷型变种ＮＡ０６和ＮＡ１２,２,２．６ｋｂ的片段只能互补变种ＮＡ１２。回接实验和电镜切片显示,这种个变种的根瘤与野生型显著不同,无固氮活性,根瘤内基本不含类菌体;它们的Ｅｘｏ＾＋回复子的根瘤与野生型根瘤相似,多数细胞胞含有类菌体,但仍无固     

紫云英根瘤菌糖基转移酶基因exoL的定位突变及序列分析

利用转座子Ｔｎ５对质粒ｐＪＢ－Ｂ６定位诱变,经同源变换,筛选获得一株Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｈｕａｋｕｉｉ１０７胞外多糖合成缺陷变种ＲＨ９８３。三亲本杂交实验显示,ｐＪＢ－Ｂ６及其亚克隆ｐＪＢ－Ｂ６０均可纠正变种ＲＨ９８３的胞多多糖合成缺陷。     

紫云英根瘤菌107菌株酸性胞外多糖的分离纯化及结构分析

用化学沉淀法和柱层析法,分离纯化了紫云英根瘤菌野生型１０７菌株,胞外多糖合成缺陷型变种ＮＡ０２及其回复子ＮＡ０２（Ｒ‘－１１）产生的酸性胞外多糖（ＥＰＳ）。结构组成分析表明：菌株１０７与ＮＡ０２（Ｒ’－１１）产生的ＥＰＳ糖组分均由葡萄糖、半乳糖、核糖和葡萄糖醛酸构成,而变种ＮＡ０２产生的ＥＰＳ只含葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸,与野生型显著不同。３个菌株的ＥＰＳ均有乙酰基取代,而无其它形式的取代基。Ｅ     

紫云英根瘤菌糖基转移酶基因exoA的克隆及序列分析

从可互补紫云奶瘤菌胞外多糖合成缺陷变种ＮＡ０３和ＮＡ１０的ｅｘｏＲ‘－１１上亚克隆获得２．０ｋｂ的ＢｇｌＩ酶切片段,命名为ｐＪＢ－Ｈ７０１,ｐＪＢ－Ｈ７０１不仅可纠正变种ＮＡ０３和ＮＡ１０Ｒ的胞外多糖缺陷表型,而且使两变种诱导宿主植物结瘤固氮能力恢复到野生型水平。     

质粒exoR‘恢复紫云英根瘤菌胞外多糖缺陷型变种有效结瘤能力

以ＰＭＮ２作为载体质粒,应用体内克隆技术,从紫云英根瘤菌胞外多糖缺陷型变种ＮＡ－１１中,分离到ｘｅｏＲ＇质粒,该杂合质粒带有Ｔｎ５及其插入位点两侧的根瘤菌中,不仅可纠正紫云英根瘤菌Ｅｘｏ＾－变种的胞外多糖合成缺陷,也能恢复该变种使宿主植物根部结瘤的能力。     

质粒exoR′恢复紫云英根瘤菌胞外多糖缺陷型变种有效结瘤能力

以ＰＭＮ２作为载体质粒,应用体内克隆技术,从紫云英根瘤菌胞外多糖缺陷型变种ＮＡ－１１中,分离到ｅｘｏＲ′质粒,该杂合质粒带有Ｔｎ５及其插入位点两侧的根瘤菌ＤＮＡ片段。ｅｘｏＲ′质粒能稳定地存在于紫云英根瘤菌中,不仅可纠正紫云英根瘤菌Ｅｘｏ－变种（Ｎｄｖ－）的胞外多糖合成缺陷,也能恢复该变种使宿生植物根部结瘤的能力。     

利用Tn5gusA5对大豆慢生根瘤菌lrp基因的诱变

通过对重组质粒ｐＧＸＮ３００中的 ２．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ片段测序分析发现,其上有一完整的ｌｒｐ基因和部分 ｐｕｔＡ基因,与 Ｋｉｎｇ ＮＤ等［１］报道的 Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ的ｌｒｐ基因ＤＮＡ序列有 ８８％同源性。利用 Ｔｎ５ ｇｕｓＡ５定位 诱变方法,对质粒ｐＧＸＮ３００进行插入诱变,得到２．３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ片段上有Ｔｎ５ｇｕｓＡ５插入位点的质粒ｐＧＸＮ３００－ Ｔ３８,将ｐＧＸＮ３００－Ｔ３８转移到大豆馒生根瘤苗（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＧＸ２０１中,得到的ＧＸ２０１转移接合子与不相容 质粒ｐＰＨ１ＪＩ发生同源双交换。通过抗性及ｇｕｓＡ活性检测,筛选到一ｌｒｐ基因突变株。Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析证 明这突变株的 Ｔｎ５ ｇｕｓＡ５插入确实是同源交换而不是转座产生,表明 Ｔｎ５ ｇｕｓＡ５ 诱变可以应用于大豆慢生根 瘤菌中的突变林筛选。     

铜绿假单胞菌PIC—N萘降解基因的研究

铜绿假单胞菌ＰＩＣ－Ｎ对萘、邻苯二甲酸、水杨酸等有较强的氧化能力。发现该菌株以萘为底物可诱导产生芳香烃分解酶系。菌株中存在一个５７．４ｋｂ的质粒,经限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ处理可产生７个片段,用限制性内切酶ＥｃｏＲ Ⅰ处理可产生８个片段。将以限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ部分酶切的片段克隆至大肠杆菌持ｐＭＦＹ４３上,获得２９个克隆株。通过对含有菌株ＰＩＣ－Ｎ质粒ＨｉｎｄⅢ片段的７个重组闰进行限制酶分析,绘出     

影响紫云英根瘤菌入侵和根瘤发育的exo基因的克隆及分析

紫云英根瘤菌菌株107的3个胞外多糖缺陷突变株NA－01、02、04不具备诱导宿主植物紫云英结瘤的能力。以NA-01突变位点的DNA片段为探针,从可互补这3个变种的exoR′－11质粒上亚克隆到2．6kb的DNA片段。互补试验表明,2．6kb的片段不仅可纠正突变株的胞外多糖缺陷表型,而且使变种恢复诱导宿主植物形成有效根瘤的能力。2．6kb片段经Tn5定位突变后丧失这种恢复能力,表明该片段带有对应于3个变种的野生型基因。     

丙型肝炎病毒北京株NS3基因的克隆及测序

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从北京株丙型肝炎病毒中扩增出ＮＳ３区基因片段,该片段经ｐＧＥＸ－Ｔ载体克隆到大肠杆菌ＤＨ５α菌株中．经自动序列分析仪测出ＮＳ３基因的７２８ｂｐ长的核酸序列．发现在该片段中第３１位核苷酸发生Ａ→Ｔ突变,产生一个终止突变．这表明,丙型肝炎病毒北京株存在一定的变异,产生缺陷型病毒,这类缺陷型病毒的出现可能是丙型肝炎病毒持续性感染的原因之一．     

铜绿假单胞菌PIC－N萘降解基因的研究

铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＩＣ－Ｎ对萘、邻苯二甲酸、水杨酸等有较强的氧化能力。发现该菌株以禁为底物可诱导产生芳香烃分解酶系。菌株中存在一个５７．４ｋｂ的质粒,经限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ处理可产生７个片段,用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ处理可产生８个片段。将以限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ部分酶切的片段克隆至大肠杆菌质粒ｐＭＦＹ４３上,获得２９个克隆株。通过对含有菌株ＰＩＣ－Ｎ质粒ＨｉｎｄⅢ片段的７个重组质粒进行限制酶分析,绘出了该质粒ＨｉｎｄⅢ内切酶７个切点的酶切图谱。     

紫云黄根瘤菌质粒功能研究

紫云英根瘤菌ＣＨ２０３含有３条质粒,用带蔗糖敏感基因Ｔｎ５－ｓａｃＢ进行菌株质粒消除和质粒缺失突变株筛选,获得一系列突变株。与野生型菌相比。质粒ｐＲＨａ的丢失导致菌株结无效根瘤,质粒ｐＲＨｂ的丢失使菌株失去共生能力。在ＴＹ培养基平板上菌落变得粗糙,失去了脂多糖。质粒ｐＲＨｃ的丢失显然失去其菌株的共生能力,同时使菌株抗酸性明显减弱。     

以转座子Tn5作弗氏中华根瘤菌的可识别生态学标记的研究──Tn5的水平转移及其对R．fredii Tn5突变株运动的影响

将一株弗氏中华根瘤菌（Ｒ．ｆｒｅｄｉｉ）ＱＢ１１３０的Ｔｎ５插入突变株ＯＮ－２用于生态学研究,以评估Ｔｎ５在自然环境中的水平转移以及各种水势下Ｔｎ５对突变株ＯＮ－２在土壤中运动的影响．试验表明,在自然潮湿的土壤中,Ｔｎ５本身的水平转移频率很低,且与Ｔｎ５插入相关的突变株卡那霉素抗性表型标记在非选择性平板上连续传４０代后仍然稳定．突变株ＯＮ－２与相对应的野生型菌株ＱＢ１１３０在各种相同水势的土壤中的运动无明显差异（Ｐ＝０．０１）,表明Ｔｎ５的插入不影响突变株的运动．因此,Ｔｎ５可作为研究Ｒ．ｆｒｅｄｉｉ基因工程菌大回应用的一个稳定有效的生态学标记．     

环状芽孢杆菌C—2几丁酶基因在大肠杆菌中的表达

对已克隆的环状芽孢杆菌Ｃ－２的几丁酶基因片段所作的亚克隆分析表明,该几丁酶基因位于１．７ｋｂ Ｐｓｔ Ｉ－Ｓｔｙ Ｉ片段 。ＣｈｉＩ基因在大肠杆菌ＪＭ１０７,ＤＨ５α,ＸＬ１－ｂｌｕｅ,ＴＧ－１等菌株中均能表达,但表达水平不同,其中ＪＭ１０７的表达活性最高,其胞外几丁酶活性与供体菌Ｃ－２菌株的胞外酶活性几乎相当。     

伪狂犬病毒闽A株基因文库的构建及物理图谱分析

本文报道以质粒ｐＢＲ３２２作载体,用鸟枪法克隆出了ＰＲＶ闽Ａ株除ＢａｍＨＩ－１,２外的所有酶切片段,构建了ＰＲＶ闽Ａ株基因文库,并以克隆出的ＢａｍＨＩ片段用光生物素标记作探针,应用分子杂交法确定了ＰＲＶ闽Ａ株绝大部分限制性内切酶位点的位置。