不同温度下恩诺沙星及其代谢物在斑点叉尾鲖各组织中的残留及消除规律比较

分别在18℃和28℃水温下, 以20 mg/(kg·d)鱼体质量对斑点叉尾鲙给药恩诺沙星, 连续灌胃7d。给药后在不同的时间点取样, 用高效液相色谱荧光检测器检测, 研究恩诺沙星及其主要代谢产物环丙沙星在斑点叉尾鲙体内(血液、肌肉、皮肤、肝脏和肾脏)的残留消除规律。结果表明, 恩诺沙星在不同组织、不同水温消除速率不同: 水温为18℃, 皮肤、肝脏、肾脏和肌肉中的消除曲线方程分别为C=1022.1e–0.034t、C=2601.3e–0.046t、C=2903.6e–0.072t和C=1186.5e–0.036t, 消除半衰期分别为31.79d、45.29d、16.15d和35.54d; 水温为28℃, 皮肤、肝脏、肾脏和肌肉中的消除曲线方程分别为C=8805.5e–0.04t、C=3154e–0.08t、C=4145.1e–0.1t和C=1302.1e–0.068t, 消除半衰期分别为18.33d、6.26d、12.44d和10.34d。恩诺沙星在斑点叉尾鲙体内可代谢为环丙沙星, 恩诺沙星在斑点叉尾鲙体内的代谢速度较慢, 代谢物环丙沙星在斑点叉尾鲙体内的消除速度比恩诺沙星快; 在18℃水温下, 斑点叉尾鲙肉中的恩诺沙星和环丙沙星完全消除需要150d以上; 在28℃水温下, 斑点叉尾鲙肉中的恩诺沙星和环丙沙星完全消除需要120d。在实验条件下, 建议水温为18℃和28℃时, 休药期分别为3240℃·日和4200℃·日。     

基于机制的生理药动- 药效学模型研究进展

生理药动- 药效学模型通过对生物学过程的描述,可预测体内药物的吸收、分布、代谢、排泄以及进一步的生理生化反应。这类模型是通过已知的生化/ 生理基础来构建,采用了一种“自下而上”的建模方法,并利用数学方法对生理过程及药物的作用机制作出准确的描述。其中药效学部分,根据预测目的和药物作用的复杂性,可进一步分为基于经验的和基于机制的效应模型,这两种模型均可与基于机制的生理药动学模型相连接,最终预测药物的体内处置和效应。基于机制的生理药动- 药效学模型的优势在于：可外推性、新的影响因素的可纳入性以及可用于未知领域的预测等。随着实验技术的不断革新,药物作用机制的逐渐明确,这类模型越来越多的被成功应用于药物研发及风险评估中。综述生理药动- 药效学模型的构建策略与分类以及在药物研发和风险评估中的应用研究。     

盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体内的药代动力学及残留消除规律

在水温(28±1)℃条件下, 以20 mg/kg剂量的盐酸氯苯胍口灌斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus), 采用高效液相色谱-串联质谱法研究盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体内的药代动力学和残留消除规律。结果显示, 在单次口灌给药后, 盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆中的药时曲线符合二室模型特征, 其药动学方程为C= 7.69e–0.02t+ 0.13e–0.01t–7.82e–0.27t。盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰血浆、肌肉、皮、鳃、肝脏和肾脏中的T_(peak)分别为10.03、15.79、11.10、2.61、12.89、7.87h; C_max分别为5.76 μg/mL、2.91、2.90、3.05、3.04、0.42 mg/kg, 消除半衰期分别为58.63、23.57、35.37、19.74、29.34、43.30h; 药-时曲线下面积AUC分别为326.74 (μg/mL)/h、157.58、183.72、95.09、174.82、29.85 (mg/kg)/h。在连续口灌给药5d后, 停药后盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰肠道中的浓度最高, 肌肉中浓度最低, 盐酸氯苯胍在体内各组织中的消除速度由高到低依次为血浆、鳃、脑、肌肉、皮肤、肝脏、肾脏、肠。若将10 μg/kg作为盐酸氯苯胍的最高残留限量, 在试验条件下, 建议盐酸氯苯胍在斑点叉尾鮰体内的休药期至少应为23d。     

强力霉素在斑点叉尾(鲴)体内药物动力学及残留消除规律研究

研究利用高效液相色谱法研究了强力霉素在斑点叉尾 (Ictalurus punctatus)体内的药物动力学与消除规律, 有助于制定合理用药方案和休药期, 为水产品质量安全提供理论依据。(1)单次口服剂量 20 mg/kg 强力霉素在斑点叉尾 体内的药时数据符合二室开放式模型。药-时曲线呈明显双峰现象: 第一次达峰时, 强力霉素在肾、血和肌肉中浓度迅速上升, 达峰时间 Tmax (1)出现在 30min, 强力霉素在肝脏中浓度上升缓慢, 出现在 1h; 肝、肾、血和肌肉第二次达峰的时间 Tmax (2)出现在 8h, 第二次达峰浓度 Cmax(2)大于第一次的浓度Cmax (1)。 药-时曲线下面积(AUC): 肾、肝、血和肌肉分别为 63.242、1282.077、142.379、62.348 μg·h /mL。消除半衰期[T1/2b]: 肾、肝、血和肌肉分别为 40.668、48.767、36.527、31.091h, 平均滞留时间(MRT): 肾、肝、血和肌肉分别为 46.585、56.989、48.859、42.428h; (2)连续口服剂量 20 mg/kg 的强力霉素 5d, 停药后强力霉素在斑点叉尾 肝脏中浓度最高, 肌肉+皮中浓度最低。在不同组织中强力霉素的消除速率不同(P<0.05), 药物消除速度由高到低依次为肌肉+皮、肾脏、肝脏。若以肝脏为靶组织, 最高残留限量 300 μg/kg,休药期不低于 30d; 若以可食组织肌肉+皮为靶组织, 最高残留限量 300 μg/kg, 休药期不低于 19d。     

不同水温和给药方式下磺胺甲(口恶)唑在草鱼体内的药动学研究

在18℃和28℃的不同水温条件下,分别采用口灌和腹腔注射的给药方式,给予草鱼100mg/kg体重单剂量的磺胺甲(口恶)唑(SMZ),以HPLC法测定草鱼血浆和肌肉中药物浓度,用MCPKP药代动力学软件处理药时数据,结果表明,18℃条件下,草鱼口灌SMZ的分布半衰期T1/2α、消除半衰期T1/2β、达峰时间Tp均显著长于28℃(P＜0.01),其峰浓度Cmax显著低于28℃下的值(P＜0.01);腹腔注射给药时,SMZ在鱼体血浆和肌肉中的吸收与分布较口服快,消除较口服也快.在水温18℃条件下,口灌SMZ在草鱼血浆中的药时数据符合带时滞的二室开放模型,腹腔注射的符合无时滞二室开放模型;水温28℃条件下,口灌SMZ在草鱼血浆中的药时数据符合可忽略时滞的二室开放模型.根据SMZ的药代动力学规律、最低有效血药浓度和抗菌药物应用的一般原则,制定了SMZ的用药方案:治疗温水性鱼类细菌性疾病,在水温18℃左右,口服或注射100mg/kg剂量的SMZ,以每天给药两次,3d一个疗程为宜;在水温28℃左右,以每天给药3-4次为宜.该项研究全面了解了在不同水温和不同给药方式下SMZ在鱼体内的药动学规律,为确定合理的临床用药方案以及无公害水产品中药物残留监测提供了可靠的理论依据.     

不同水温和给药方式下磺胺甲噁唑在草鱼体内的药动学研究

在 18℃和 2 8℃的不同水温条件下 ,分别采用口灌和腹腔注射的给药方式 ,给予草鱼 10 0mg/kg体重单剂量的磺胺甲唑 (SMZ) ,以HPLC法测定草鱼血浆和肌肉中药物浓度 ,用MCPKP药代动力学软件处理药时数据 ,结果表明 ,18℃条件下 ,草鱼口灌SMZ的分布半衰期T1/2α、消除半衰期T1/2 β、达峰时间Tp 均显著长于 2 8℃ (P <0 .0 1) ,其峰浓度Cmax显著低于 2 8℃下的值 (P <0 .0 1) ;腹腔注射给药时 ,SMZ在鱼体血浆和肌肉中的吸收与分布较口服快 ,消除较口服也快。在水温 18℃条件下 ,口灌SMZ在草鱼血浆中的药时数据符合带时滞的二室开放模型 ,腹腔注射的符合无时滞二室开放模型 ;水温 2 8℃条件下 ,口灌SMZ在草鱼血浆中的药时数据符合可忽略时滞的二室开放模型。根据SMZ的药代动力学规律、最低有效血药浓度和抗菌药物应用的一般原则 ,制定了SMZ的用药方案 :治疗温水性鱼类细菌性疾病 ,在水温 18℃左右 ,口服或注射 10 0mg/kg剂量的SMZ ,以每天给药两次 ,3d一个疗程为宜 ;在水温2 8℃左右 ,以每天给药 3— 4次为宜。该项研究全面了解了在不同水温和不同给药方式下SMZ在鱼体内的药动学规律 ,为确定合理的临床用药方案以及无公害水产品中药物残留监测提供了可靠的理论依据。     

喹乙醇在鲤体内的药物代谢动力学及组织浓度

采用高效液相色谱法测定了鲤血浆及组织中喹乙醇的浓度。该法采用C18色谱柱,流动相为甲醇-三蒸水(15：85),检测波长为372nm,样品用15％的三氯乙酸沉淀蛋白,离心取上清液进样。该法灵敏、简便、准确、喹乙醇在0．2—25．6μg／mL浓度范围内线性关系良好,检测限为0．04μg／g,平均回收率为85．93％-100．2％,不同浓度水平的日内和日间精密度测定结果均小于10％。以30mg／kg鱼体重的剂量口灌给药,通过对喹乙醇在鲤体内的血药浓度经时曲线过程分析,发现其符合-级吸收-室开放模型,主要动力学参数如下：消除相半衰期T1／2k5．876h,吸收相半衰期T1／2h1．466h,达峰时间Tp3．913h,达峰浓度Cmax30．25ug／／mL,血药浓度-时间曲线下面积AuC406．92mg／L．h;并对用药后组织药物浓度和单次、多次灌药后肌肉中喹乙醇的残留量及以原型排出体外的喹乙醇进行了测定,获得了单次灌药后鲤肌肉、肝脏、肾脏和多次灌药后鲤肌肉中喹乙醇的代谢规律,测得原型药物排出体外的量占总灌药量的6．9％。该项研究全面了解了喹乙醇在鱼体内的药动学特征,对确定合理的临床用药方案以及无公害水产品中药物残留监测提供了可靠的理论依据。     

盐酸氯苯胍在美国红鱼体内的药代动力学和残留消除规律研究

在水温(28±2)℃、盐度28条件下,盐酸氯苯胍(robenidine hydrochloride,ROBH)按30 mg/kg的剂量口灌实验鱼,用HPLC-MS/MS法研究盐酸氯苯胍在美国红鱼体内的药代动力学和残留消除规律。结果显示,单剂量口灌给药后,美国红鱼血浆中ROBH的药时数据符合一级吸收二室模型,药物在血浆中的达峰时间(tp)、血药浓度峰值(Cmax)、药时曲线下面积(AUC_(0-∞))和消除半衰期(t_(1/2β))分别为2.39 h、958.78μg/L、33 247.57μg/(L·h)和19.24 h;ROBH在肌肉、肝脏和肾脏的Cmax分别为156.72μg/kg、227.68μg/kg和553.44μg/kg,tp分别为2.0 h、1.5 h、2.0 h;AUC_(0-∞)分别4 664.04μg/(kg·h)、4 897.74μg/(kg·h)、17 228.19μg/(kg·h);t_(1/2β)分别为19.68 h、24.33 h和22.81 h。按30 mg/kg剂量连续5 d口灌给药后,美国红鱼肌肉、肝脏、肾脏中的药物消除半衰期(t1/2):24.46 h、35.39 h、39.60 h和33.94 h。若以10μg/kg为最高残留限量,肌肉作为食用靶组织,在本试验条件下,建议休药期不少于7 d。     

草鱼体内双氟沙星药代动力学研究

为研究双氟沙星（Difloxacin,DIF）在草鱼（Ctenopharynodon idellus）体内的药代动力学以及在各组织中的残留量,采用高效液相色谱法测定在15℃水温状态下单次给草鱼灌喂20 mg/kg剂量的双氟沙星后,得出双氟沙星在各组织以及血液中的药时曲线均都符合二室开放性模型,双氟沙星能够在草鱼体内快速吸收,并且血液及各组织中均有分布,双氟沙星在草鱼体内的药物动力学方程为C=5.056e-0.012t+19.041e-0.011t,其中双氟沙星在血液、肌肉、肝脏、肾脏中吸收半衰期（T_1/2α）分别为0.176h、0.562h、4.562h和1.477h,消除半衰期分别为（T_1/2β）69.492h、65.303h、218.412h和163.937h,总体消除率（CL）分别为0.495、11.181、10.789和7.102 L/（h·kg）,药时曲线下面积（AUC）分别为81.550、1277.55、807.470和1432.150 μg/（L·h）。根据相关规定肌肉中双氟沙星最大残留量300 μg/kg为标准,建议休药期26d以上。     

扶正口服液在家兔体内的代谢动力学研究

采用比色法测定口服单剂量扶正口服液后,家兔体内齐墩果酸的血药曲线,并据此研究扶正口服液中齐墩果酸在体内代谢动力学规律。结果表明,齐墩果酸在家兔体内的代谢符合－室药动学模型。并求出了该制剂的主要药动学参数。     

Effects of mammalian CYP3A inducers on CYP3A-related enzyme activities in grass carp (Ctenopharyngodon idellus): Possible implications for the establishment of a fish CYP3A induction model

Unexpected drug-drug interactions in fish are generally associated with the induction of CYP3A activity and may lead to the formation of drug residues and thus threaten the safety of fishery products. However, little information is available about CYP3A induction in fish. In the present study, we determined the in vivo and in vitro effects of typical mammalian CYP3A inducers (rifampicin, phenobarbital and dexamethasone) on CYP3A-related enzyme activities in a freshwater teleost, the grass carp (Ctenopharyngodon idellus). Our results showed that the response to rifampicin was similar for grass carp liver cell line (GCL), liver microsomes and the primary hepatocytes of grass carp, as indicated by the activity of aminopyrine N-demethylase (APND). When erythromycin N-demethylase (ERND) and 6beta-testosterone hydroxylase (6beta-TOH) were taken into consideration, the GCL displayed a greater capacity for conducting CYP3A metabolism and induction than the C. idellus kidney cell line (CIK). Using erythromycin and testosterone as substrates, we demonstrated that CYP3A catalysis exhibited non-Michaelis-Menten kinetics in GCL cells, and that V(max)/K(m) values were significantly increased due to rifampicin-treatment. Overall, this study may have implications for the use of GCL as a CYP3A induction model to identify physiological changes in fish as well as the similarities or differences between fish and mammals.     

草鱼肾脏和脾脏血细胞发育过程的观察

鱼类肾脏、脾脏是机体造血的主要器官。印迹涂片显示:草鱼肾脏和脾脏内血细胞的发育过程大致经历了三个阶段,即原始阶段、幼稚阶段、成熟阶段。本文着重描述了各阶段细胞的形态特征井对草鱼血细胞的发育及命名等问题作了初步的探讨。       

二龄草鱼脾脏、肝脏组织高表达甘露糖结合凝集素mRNA

Innate immunity is expected to be very important in fish. Mannose-bingding lectin (MBL) participates in the innate immune system as an activator of the complement system and as an opsonin after binding to certain carbohydrate structures on microorganisms. In this experiment, total mRNA was isolated from spleen, liver, gills, thymus, head kidney and kidney of adult and immature grass carp Ctenopharygodon idllus. The cDNA of MBL was obtained by RT-PCR using total mRNA from the spleen of carp as template. Such cDNA was labled with ^32p and used as probe for Northern analysis, and autoradiographic signals were quantified by densitometry analysis. The results showed that MBL was high expressed in the spleen and liver and low in gills, thymus, head kidney and kidney of adult grass carp, and MBL was much lower expressed in spleen and liver of immature grass carp than those of adult grass carp. The results might partially explain why immature grass carp are vulnerable to grass carp hemorrhage virus (GCHV) whereas adult grass carp are not.This suggested that MBL mav be an imoortant anti-GCHV factor [Acta Zoologica Sinica 50 (1): 137 - 140. 2004].     

草鱼CD81基因的克隆及功能分析

为研究白细胞表面分化抗原81(CD81)的功能, 对草鱼CD81进行了克隆, CD81全长共1376 bp, 其中5'非翻译区87 bp, 3'非翻译区581 bp, 开放阅读框为708 bp, 包括8个外显子, 7个内含子, 编码235个氨基酸。实验采用实时荧光定量PCR的方法检测了CD81在健康草鱼不同组织中的表达情况及草鱼出血病病毒(GCRV)攻毒前后的表达变化情况。结果显示草鱼CD81在所有被检测组织中均有表达, 在头肾中表达量最高。在GCRV攻毒前后草鱼鳃、脾、肝、肠及头肾5个组织中的CD81表达量均有明显变化。同时, 采用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪CD81的亚细胞表达部位, 激光共聚焦显微镜显示, 同人类一样, 草鱼CD81定位于细胞膜上。       

一株草鱼呼肠孤病毒弱毒株的分离、鉴定及免疫原性初步分析

从江西南昌患出血病草鱼体内分离出的草鱼病毒(暂命名为JX09-01)能使草鱼肾脏细胞(CIK)、草鱼肝细胞(L8824)、草鱼吻端成纤维细胞(PSF)产生明显的细胞病变效应(CPE)。感染CIK 细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量病毒聚集, 形态和排列方式与已报道的草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)相似。针对GCRV 873 株S6 基因设计的简并引物可以从病料组织和感染细胞中扩增出目的条带, 而针对GCRVHZ08 株S6 基因设计特异性引物未能扩增出目的条带。对JX09-01 株的S6 全基因进行序列分析表明, 其核苷酸序列同GCRV 873 株和HZ08 株的同源性分别是99.3%和30.4%, 推导出的氨基酸序列同源性分别是98.6%和30%, 说明草鱼病毒JX09-01 株为草鱼呼肠孤病毒。用JX09-01 株接种当年8-10 cm左右的草鱼, 没有明显的临床症状, 不能致草鱼死亡。用传代至15 代的CIK 细胞病毒液进行免疫保护试验, 结果显示其对强毒株的免疫保护率达到86.7%。实验结果初步显示, 新分离到的JX09-01 为草鱼呼肠孤病毒弱毒株, 可作为弱毒疫苗的候选毒株。       

草鱼感染GCRV后血液中淋巴细胞变化及BCL10表达分析

为了研究草鱼BCL10基因在草鱼出血病中的应答机制, 文章克隆了BCL10基因, 并利用生物信息学、荧光定量和血涂片等技术对其进行了分析。生物信息学结果显示, BCL10基因开放阅读框为738 bp, 编码245个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示, 感染病毒后草鱼体内BCL10表达量持续上调, 在肝胰腺和中肾中第4天达到峰值, 第7天表达量开始下调。血涂片显微镜观察发现了血液中淋巴细胞在感染病毒后第1到第4天下降, 第7天时上升。肾脏的组织病理学观察也发现中肾中肾小管上皮细胞第1到第7天逐渐空泡化, 脱落坏死。以上结果表明, BCL10基因参与了草鱼应对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)入侵的免疫应答。     

草鱼诱导型一氧化氮合酶cDNA和启动子的克隆及分析

应用PCR和RACE技术,以细菌脂多糖(LPS)刺激的草鱼头肾白细胞cDNA为模板,获得草鱼iNOS (Inducible nitric oxide synthase)全长cDNA序列.该序列共4286 bp,编码含1080个氨基酸残基的蛋白.氨基酸序列比对分析发现草鱼iNOS与金鱼iNOS a和b、斑马鱼iNOS 2b以及鲤鱼iNOS高度保守,序列一致性均大于80%;它们的血红素、四氢生物蝶呤、钙调蛋白、FMN、FAD和NADH等辅因子结合区域也十分保守.用NJ法对新获得的序列和其它脊椎动物NOS的编码序列进行进化分析证实它属于诱导型NOS.在此基础上,运用基因步移技术分离草鱼iNOS基因的启动子序列,共有1978 bp.生物信息学分析发现该序列含有包括GR、AP1、C/EBP、ER、YY1、IRF1和IL-6 REBP在内的多个转录因子的潜在结合位点.     

Molecular cloning and sequence analysis of stearoyl-CoA desaturase in milkfish, Chanos chanos

Stearoyl-CoA desaturase (EC 1.14.99.5) is a key enzyme in the biosynthesis of polyunsaturated fatty acids and the maintenance of the homeoviscous fluidity of biological membranes. The stearoyl-CoA desaturase cDNA in milkfish (Chanos chanos) was cloned by RT-PCR and RACE, and it was compared with the stearoyl-CoA desaturase in cold-tolerant teleosts, common carp and grass carp. Nucleotide sequence analysis revealed that the cDNA clone has a 972-bp open reading frame encoding 323 amino acid residues. Alignments of the deduced amino acid sequence showed that the milkfish stearoyl-CoA desaturase shares 79% and 75% identity with common carp and grass carp, and 63%–64% with other vertebrates such as sheep, hamsters, rats, mice, and humans. Like common carp and grass carp, the deduced amino acid sequence in milkfish well conserves three histidine cluster motifs (one HXXXXH and two HXXHH) that are essential for catalysis of stearoyl-CoA desaturase activity. However, RT-PCR analysis showed that stearoyl-CoA desaturase expression in milkfish is detected in the tissues of liver, muscle, kidney, brain, and gill, and more expression sites were found in milkfish than in common carp and grass carp. Phylogenic relationships among the deduced stearoyl-CoA desaturase amino acid sequence in milkfish and those in other vertebrates showed that the milkfish stearoyl-CoA desaturase amino acid sequence is phylogenetically closer to those of common carp and grass carp than to other higher vertebrates.     

草鱼免疫相关基因Prkrip1的克隆和表达分析

随着草鱼养殖规模的扩大, 草鱼的病毒性疾病极大地影响着草鱼的产量。开展鱼类病毒免疫反应相关功能基因的研究意义重大。研究首先通过同源克隆的方法从草鱼中克隆到了一段Prkrip1基因的EST序列, 进一步通过RACE、长片段PCR和Genome walking的方法获得了该基因的全长cDNA序列、基因组DNA序列和启动子区序列。氨基酸序列分析显示, Prkrip1含有3个核定位信号和一个双链RNA结合区, 并具有与PKR结合的保守N端区; 荧光报告基因的表达证实我们所克隆到的启动子区是有活性的, 可用于后续该基因的转录调控分析; Real-time PCR分析发现, Prkrip1 基因在草鱼的肝和血中表达量最高, GCRV感染后在大部分免疫组织中均上调表达, 说明该基因确实与病毒感染相关。研究结果为Prkrip1基因在硬骨鱼类的功能研究提供了线索, 也为鱼类天然免疫反应中调控PKR信号通路的系统研究提供了理论依据。