微生物发酵生产α-酮戊二酸研究进展

α-酮戊二酸是微生物三羧酸循环中重要的代谢中间产物,是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点,具有广泛的应用价值.文中从4个方面归纳了国内外关于α-酮戊二酸研究进展:能够过量积累α-酮戊二酸的原核和真核微生物的发现和筛选;硫胺素缺陷型和氮源饥饿引起的α-酮戊二酸过量积累的生理学特性;控制培养环境中的pH、溶氧和辅因子对生产α-酮戊二酸发酵过程控制与优化;调控辅因子再生和代谢途径改造高产菌株.最后,讨论了微生物法生产α-酮戊二酸存在的不足和今后研究的方向.     

营养条件对光滑球拟酵母积累α-酮戊二酸的影响

以光滑拟球酵母为研究模型,研究α-酮戊二酸的浓度情况。通过单因素实验得到α-酮戊二酸积累最佳浓度的各单因素条件为：葡萄糖浓度140g／L,NH4Cl浓度5g／L。在碳源（30g/L葡萄糖初始浓度）匮乏条件下加入丙酮酸30g／L,在此条件下丙酮酸转化为α－酮戊二酸的转化率最高达53．7％。以30g／L丙酮酸为唯一碳源时在7L发酵罐中光滑拟球酵母可生成浓度为10．7g/Lα-酮戊二酸,外源丙酮酸的转化率可达66．9％。这一结果表明,T．glabrata具有将丙酮酸转化为α-KG的能力。     

光滑球拟酵母中α-酮戊二酸脱氢酶系生理作用解析

[目的]研究α-酮戊二酸脱氢酶系在光滑球拟酵母碳代谢流、能量代谢和氨基酸代谢中的生理作用.[方法]通过敲除光滑球拟酵母中编码α-酮戊二酸脱氢酶系中E1酶的基因kgd1,构建α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失菌株T.glabrata kgd1::kan,并考察KGDH缺失引起TCA循环关键酶活性,碳代谢流量以及胞内氨基酸和能荷水平等方面的变化.[结果]光滑球拟酵母中α-酮戊二酸脱氢酶活性的缺失导致:(1)细胞启动乙醛酸途径,通过形成TCA-乙醛酸循环实现TCA循环的正常代谢;(2)胞内NADH/NAD+水平下降33.7%,ATP/ADP水平下降31.8%,而与NADH代谢相关的丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性分别提高58.1%、33.3%和32.5%;(3)胞内丙酮酸含量下降50.1%,而胞内琥珀酸、苹果酸和α-酮戊二酸含量则分别增加了172.7%、66.1%和41.1%;(4)丙酮酸族氨基酸含量下降29.3%,而胞内谷氨酸族氨基酸和天冬氨酸族氨基酸含量则提高了34.7%和26.8%.[结论]上述研究结果表明,α-酮戊二酸脱氢酶系在微生物细胞中心碳代谢、能量代谢和氨基酸代谢中发挥着重要作用.     

光滑球拟酵母中α-酮戊二酸脱氢酶系生理作用

摘要：【目的】研究α-酮戊二酸脱氢酶系在光滑球拟酵母碳代谢流、能量代谢和氨基酸代谢中的生理作用。【方法】通过敲除光滑球拟酵母中编码α-酮戊二酸脱氢酶系中E1酶的基因kgd1,构建α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失菌株T. glabrata kgd1::kan,并考察KGDH缺失引起TCA循环关键酶活性,碳代谢流量以及胞内氨基酸和能荷水平等方面的变化。【结果】光滑球拟酵母中α-酮戊二酸脱氢酶活性的缺失导致：(1)细胞启动乙醛酸途径,通过形成TCA-乙醛酸循环实现TCA循环的正常代谢;(2)胞内NADH/NAD+水平     

桥联黄素再生NAD+耦联L-谷氨酸脱氢酶高效产α-酮戊二酸

在L-谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3,L-GluDH)催化L-谷氨酸氧化脱氨过程中涉及昂贵的氧化型烟酰胺辅因子NAD+,因此需要构建其再生体系以降低成本.通过构建桥联黄素(F4)耦联L-谷氨酸脱氢酶催化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸(α-KG)的新型均相体系,桥联黄素能高效氧化天然还原型烟酰胺辅因子NADH至其氧化态N...     

靶向α-酮戊二酸脱氢酶增强纳米银的抗菌作用

【目的】纳米银(silver nanoparticles, AgNPs)的生物安全性一直受业界诟病,扩大纳米银的治疗窗将为治疗人和动物多耐药性细菌感染提供有效的备选药物。本研究拟用三羧酸循环的重要成员α-酮戊二酸(alpha-ketoglutaric acid, AKG)对纳米银进行表面修饰以提高其抗菌的生物安全性。【方法】芦丁在常温下合成纳米银,用全波长分光光度计、粒度仪及透射电镜进行表征。加1 mmol/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone, PVP)作为稳定剂(PVP-AgNPs),另加10 mmol/L AKG作为封端剂(PVP-AgNPs@AKG),比较2种纳米银的抗菌性及对人正常宫颈上皮细胞(human cervical epithelial cells, HCerEpic)的毒性作用,再分析2种纳米银对大肠杆菌(Escherichia coli) BW25113能量代谢、抗氧化应激和无氧呼吸相关基因表达等的影响。【结果】PVP-AgNPs@AKG对多株革兰阳性细菌和革兰阴性细菌的最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration, MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)均比PVP-AgNPs低50%或50%以上,而对HCerEpic细胞的毒性无显著差异。与PVP-AgNPs相比,PVP-AgNPs@AKG在MIC浓度下对E. coli α-酮戊二酸脱氢酶活性的抑制作用增强,AKG蓄积,ATP水平显著降低,同时活性氧(reactive oxygen species, ROS)的水平显著升高,soxS表达上调,但是,厌氧呼吸相关的arcA、fnr、fdnH基因表达上调的程度显著降低。【结论】AKG修饰纳米银能通过靶向α-酮戊二酸脱氢酶抑制细菌的能量代谢,使其对氧化损伤更敏感,从而获得更强的抗菌能力,是一种扩大纳米银治疗窗的有效手段。     

解脂耶氏酵母诱变育种及发酵产α-酮戊二酸条件优化

对具有发酵产α-酮戊二酸能力的解脂耶氏酵母(Yarrowia Lipolytica)ZY-4进行了紫外诱变和NTG诱变育种,筛选得到产量提高的突变株,并对突变株的发酵培养基进行了优化,结果表明,紫外诱变和NTG诱变后筛选到的突变株分别比原始出发菌株产量提高了67.8%和110%。优化后发酵培养基成分为甘油8%,氯化铵5.0 g/L,硫胺素1.0μg/L,磷酸二氢钾1.0 g/L,七水硫酸镁0.5 g/L,培养基优化后α-酮戊二酸产量比原始出发菌株提高了232.4%。     

Parkin与α-酮戊二酸载体蛋白(OGCP)的相互作用研究

Parkin基因是帕金森病的致病基因之一,Parkin蛋白作为泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)的一种E3酶,介导了多种底物的泛素化过程,而后者与帕金森病的发病机制有着密切的联系．α-酮戊二酸载体蛋白(2-oxoglutarate carrier protein,OGCP) 是一种线粒体内膜蛋白．采用激光共聚焦技术和免疫共沉淀技术证实,在HEK293细胞中Parkin蛋白与OGCP共定位,且二者之间存在相互作用关系;通过体内、外泛素化实验发现Parkin蛋白能介导OGCP的泛素化．提示OGCP可能是Parkin蛋白的泛素化底物蛋白,且Parkin蛋白能促进OGCP的泛素化．     

碳酸钙促进丙酮酸发酵过程中α-酮戊二酸的形成

在多重维生素营养缺陷型菌株光滑球拟酵母CCTCC M202019发酵生产丙酮酸的摇瓶和发酵罐实验中发现,CaCO₃的添加对发酵液中α-酮戊二酸（α-KG）的积累有重要影响。在维生素浓度不变且供氧充分的前提下,延迟CaCO₃添加时间可明显抑制α-KG的产生,并提高丙酮酸与α-KG的碳摩尔比(C_PYR/C_αKG);而增加培养基中的CaCO₃浓度会导致αKG积累的增加。用不同物质调节发酵液中pH的实验证实：在丙酮酸发酵过程中, Ca²⁺对αKG的积累起主要作用,CO₃^2-起辅助作用,两者对α-KG的积累具有协同效应。维持培养基中CaCO₃浓度不变,改变培养基中硫胺素的浓度,对αKG的积累,特别是对C_PYR/C_α-KG值没有影响;而增加培养基中生物素的浓度,则导致αKG的浓度不断上升且C_PYR/C_α-KG值不断下降。当有Ca2+存在时,胞内丙酮酸羧化酶的活性最高可提高40%,而丙酮酸脱氢酶系的活性没有明显变化。结果表明,丙酮酸发酵过程中α-KG的形成是由于CaCO₃促进了丙酮酸羧化反应,其中Ca²⁺可显著提高丙酮酸羧化酶的活性,而CO₃^2-则有可能作为丙酮酸羧化反应的底物。     

γ-氨基丁酸对鳜摄食和食欲的影响

为阐明γ-氨基丁酸(GABA)对鳜(Siniperca chuatsi)摄食和食欲的影响, 对鳜脑室注射生理盐水和不同剂量的GABA(50、125、500和2000 μg)。结果显示, 注射125 μg GABA组的鳜在2h内摄食量显著升高。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)结果显示, 注射125 μg GABA 0.5h后, 鳜鱼脑中AgRP和NPY mRNA表达量上调, CART和POMC mRNA表达量下调, 都和鳜摄食量增加相一致。相比于对照组, 注射GABA后Leptin-R的mRNA表达量在0.5h和2h都有显著下降。这些结果表明GABA可能通过leptin的信号通路来影响食欲, 进而影响摄食量。研究结果可以为GABA在水产饲料中的应用提供理论依据。     

α-酮戊二酸减轻脂多糖/D-半乳糖胺诱导的小鼠急性肝损伤

该文旨在探讨α-酮戊二酸对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及D-半乳糖胺(d-galac-tosamine,D-Ga1)诱导的急性肝损伤发生发展的影响及其可能机制.实验分组:正常对照组、AKG单独处理组、LPS/D-Ga1组、LPS/D-Ga1+AKG组.在雄性BALB/c小鼠中,经腹腔注射LPS...     

过程优化提高解脂亚洛酵母积累α-酮戊二酸

目前,应用解脂亚洛酵母发酵生产α-酮戊二酸由于产量和底物转化率低、生产周期长等问题,仍未大规模工业化生产。为了解决这些问题,以研究室诱变选育获得的1株高产α-酮戊二酸的解脂亚洛酵母Yarrowia lipolytica WSH-Z06 C3为出发菌株,考察了该菌株在50 L发酵罐中转速、碳酸钙浓度、溶氧以及补料方式(多节点补料、恒速补料)等因素对α-酮戊二酸积累的影响。结果表明,当转速为300 r/min时,α-酮戊二酸和丙酮酸的产量分别为32.4 g/L和19.66 g/L;碳酸钙质量浓度为20 g/L时,α-酮戊二酸的产量提高至38.55 g/L,丙酮酸降低至8.28 g/L;控制溶氧水平在50%时,α-酮戊二酸产量为42.39 g/L,此时丙酮酸为6.22 g/L。比较高初始甘油浓度和不同的补料发酵策略,发现恒速补料效果最好,发酵144 hα-酮戊二酸产量达到66.27 g/L,丙酮酸产量为20.82 g/L。通过上述发酵过程参数的优化,α-酮戊二酸的产量和底物的转化率比未优化前分别提高了67.3%和4.56%,为解脂亚洛酵母工业化生产α-酮戊二酸提供一定参考。     

TCA循环关键节点对L-谷氨酸合成的影响

谷氨酸是一种重要的氨基酸,其衍生出来的高值化产品具有广泛的应用,市场需求量巨大。文中通过对出发菌株谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum E01和谷氨酸高产菌C. glutamicum G01进行转录组测序与重测序分析,挑选中心代谢途径中转录水平和基因水平上存在差异的基因进行研究,以挖掘出对谷氨酸合成影响较大的基因进一步提高谷氨酸的产量。草酰乙酸节点和α-酮戊二酸节点在谷氨酸合成中扮演着重要角色,探索研究了草酰乙酸节点和α-酮戊二酸节点对谷氨酸生产的扰动影响。综合以上实验结果构建的整合菌株,5 L发酵罐发酵过程中其菌体生长速率较原始菌略有降低,但48h的谷氨酸产量高达(136.09±5.53)g/L,较原始菌的(93.53±4.52)g/L提高了45.5%;糖酸转化率提高至58.9%,较原始菌的45.2%提高了13.7%。可见,上述实验策略的应用在一定程度上提高了谷氨酸产量和糖酸转化率,为谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造提供了理论基础。     

α-酮戊二酸对氨氮胁迫下草鱼鳃Na+/K+-ATP酶活性及血液生化指标的影响

试验旨在研究饲粮添加α-酮戊二酸(α-ketoglutarate, α-KG)对氨氮胁迫下草鱼(Ctenopharyngodon idellus)鳃Na+/K+-ATP酶活性及血液生化指标的影响。选取初始体重为(24.79±0.11) g的健康草鱼, 随机分为3个处理组(对照组, 养于曝气后氨氮浓度为1.51 mg/L的自来水中并饲喂基础饲粮; 氨氮组, 养于氨氮浓度为18.37 mg/L的水中并饲喂基础饲粮; α-KG组, 养于氨氮浓度为18.37 mg/L的水中并饲喂添加0.75% α-KG的饲粮)。每处理组设3个重复, 每个重复30尾鱼, 养殖试验为期42d, 分别于第1、第14、第28和第42天采样。结果表明:在饲料中添加α-KG能够有效缓解氨氮胁迫导致的草鱼血浆氨含量(1d)、谷草转氨酶(Aspartate transaminase, AST)活性(14d)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)活性(28d)的显著升高和鳃Na+/K+-ATP酶活性(28d)、血浆谷丙转氨酶(Alanine aminotransaminase, ALT)(28d和42d)活性、血浆尿素(UREA)含量(28d)的显著降低, 显著增加氨氮胁迫下草鱼血浆球蛋白(Globulin, GLB)含量(28d)。即饲粮α-KG的适量添加能够有效缓解草鱼氨氮胁迫所致的血氨含量升高, 维持氨氮胁迫下草鱼鳃Na+/K+-ATP酶、血浆谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的活性和血浆球蛋白、尿素含量的稳定, 从而有利于草鱼缓解氨氮胁迫。     

摄食水平和食物种类对金鱼生长及氮、磷排泄的影响

本文报道了金鱼的生长率、氨排泄率及磷酸盐排泄率的两个实验的结果。实验A用牛肉作饵料,实验B用配合饲料作饵料。每一实验分6个摄食水平。特定生长率(SGR)与摄食率(R)的关系为:SGR=a十bln(R+1)。实验中两种食物对上式的系数无显著影响。氨排泄率NE与氮摄取率NI的关系为:NE=a+bNI。实验中两种食物对上式的‘b’值无显著影响,但两个实验得出的‘a’值有显著差异。磷酸盐排泄率(PE)与磷摄取率(PI)的关系为:PE=a+bPI。实验中两种食物对上式中的‘b’值无显著影响,但得出的‘a’值有显著差异。若不考虑食物种类的影响,而将两实验数据合并,氮、磷摄取率可分别解释氮、磷排泄率变异的98％和75.7％。     

体重和摄食水平对鳜和乌鳢身体的生化组成和能值的影响

本实验结果表明,野生鳜和乌鳢的干物质含量、蛋白质含量、脂肪含量和能值均随体重的增加而显著增加（Ｐ＜０．０５）,野生鳜灰分含量变随体重的增加而显著增加（Ｐ＜０．０５）,但野生乌鳢灰分含量与体重关系的回归方程则不显著（Ｐ＜０．０５）;实验鳜和乌鳢干物质含量、脂肪含量和能值均随摄食水平的增加而显著增加（Ｐ＜０．０５）,实验鳜蛋白含量和灰分含量与摄食水平关系的回归方程不显著（Ｐ＜０．０５）,实验乌鳢蛋白质     

丹参2 酮戊二酸依赖性双加氧酶基因克隆及表达分析

以商洛紫花丹参为材料,对其转录组序列SRA020132进行Blast分析,采用PCR技术克隆得到丹参2-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因Sm2-ODD1,GenBank登录号为JN935923。Sm2-ODD1基因全长1 365bp,包含3个外显子和2个内含子;cDNA全长1 189bp,读码框951bp,编码316个氨基酸残基;预测的编码蛋白具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶中结合2-酮戊二酸和亚铁离子的"H-T-D"、"H-X"和"R-Y-S"保守基序以及"果冻状"空间结构。表达分析显示,Sm2-ODD1在丹参各个器官都表达,但表达水平具有组织特异性,在根中表达量最高,在叶中表达量最低;该基因表达明显受到MeJA、GA3和ABA的诱导,可能参与了丹参萜类代谢下游途径。     

NaCl、Mn(Ⅱ)、L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸对地衣芽孢杆菌WBL-3合成新型土壤修复材料γ-PGA的影响

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)及其衍生物是一种新型土壤修复和改良材料,能吸附土壤中的重金属和放射性核物质等污染物,也可作为保水材料应用于干旱环境。NaCl、Mn(Ⅱ)、L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸四因素对Bacillus licheniformisWBL-3合成γ-PGA产量及分子量有重要影响。分别用L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸代替L-谷氨酸,Bacillus licheniformisWBL-3未产生γ-PGA。单因素试验表明:γ-PGA产量均随四因素浓度的增大呈现先增大后减小的趋势,γ-PGA产量分别在NaCl,Mn(Ⅱ)、L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸浓度为6%,100μmol.L-1,1.5 mmol.L-1和10 mmol.L-1时达到最大值35.79g.L-1,24.77 g.L-1,30.07 g.L-1和26.09 g.L-1;γ-PGA分子量随NaCl浓度的增大而增大,随α-酮戊二酸浓度的增大而减小,随Mn(Ⅱ)、L-谷氨酰胺浓度的增大而呈现先增大后减小的趋势。正交试验证明了单因素试验的结论,四因素间没有交互作用的影响,最优组合为NaCl:6%,α-酮戊二酸:10 mmol.L-1,Mn(Ⅱ):100μmol.L-1,L-谷氨酰胺:1.5 mmol.L-1,产量达到55.62 g.L-1。     

浑球红假单胞菌GOGAT缺失株中依赖Z—酮戊二酸的固氮酶诱导

2—酮戊二酸加于限量氮培养基中后,引起泽球红假单胞菌谷氨酸合成酶(GOGAT)缺失菌株(asm~-,Nif~-)固氮酶的诱导表达,诱导生成的固氮酶的活性随着培养时间的延长而下降。此时如果加入谷氨酸,固氮酶活性又重新出现,而谷氨酸通常是阻遏GOGAT缺失菌株固氮酶表达的。诱导出的固氮酶与野生菌株固氮酶有相同的调节方式,但前后两次出现的固氮酶活性在氨的敏感性上有差异。此外,在GOGAT缺失菌株内含有较高的谷氨酰胺库,同时谷氨酸胺合成酶(GS)的腺苷酸化状态也较野生型菌株高。     

11α-羟坎利酮的高特异性生物转化合成

坎利酮是合成心血管疾病药物Eplerenone的重要中间体,其关键的C11α-羟化反应可以由微生物转化完成。本实验室保藏的根霉(Rhizopus sp.SIPI-0602)可特异性地将坎利酮转化为化合物SIPI-11。通过测定与分析SIPI-11的UV、MS和NMR图谱数据,确定化合物SIPI-11为11α-羟坎利酮。摇瓶转化工艺研究表明,底物投料浓度不高于6g/L时,11α-羟坎利酮的转化率可达到90%以上。