鼠李糖乳杆菌D-乳酸脱氢酶基因ldhD的敲除

聚乳酸由可再生原料L-乳酸合成,是目前应用的最环保的生物塑料之一。鼠李糖乳杆菌JCM1553中的L-乳酸和D-乳酸,它们是由代谢途径中的L-乳酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶分别催化丙酮酸而生成。L-乳酸的光学纯度对于L-乳酸的应用至关重要。因此,为了获取光学纯的L-乳酸,需要敲除该鼠李糖乳杆菌编码D-乳酸脱氢酶的基因ldhD以阻断相关的D-乳酸代谢途径。本研究采用pK18mobsacB自杀质粒运用重叠延伸PCR和同源重组技术成功构建得到重组鼠李糖乳杆菌菌株JCM1553-△ldhD。构建的缺失突变体JCM1553-△ldhD菌株没有引入外源基因,完全符合食品、药品安全要求,发酵液中检测到的L-乳酸含量为99.92%,光学纯度达到99.84%,显著优于野生型菌株。     

L-乳酸生产菌种选育技术

随着聚乳酸作为生物可降解塑料的迅速发展,采用现代高新技术来选育L-乳酸纯度高、产量高、转化率高、能够利用木塘和适于发酵生产工艺要求的优良菌株,已成为国内外研究机构和企业关注的热点.本文对L-乳酸生产菌株的选育技术进展进行综述.     

高糖和氮源对鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)L-乳酸发酵的影响

鼠李糖乳杆菌经实验室耐高糖高酸选育,能够在高糖浓度下高效高产L-乳酸。以酵母粉为氮源和生长因子,葡萄糖初始浓度分别为120 g/L和146 g/L,摇瓶培养120h,L-乳酸产量分别为104g/L和117.5g/L,L-乳酸得率分别为86.7%和80.5%。高葡萄糖浓度对菌的生长和乳酸发酵有一定的抑制。增加接种量,在高糖浓度发酵条件下,可以缩短发酵时间,但对增加乳酸产量效果不明显。乳酸浓度对鼠李糖乳杆菌生长和产酸有显著的影响。初始乳酸浓度到达70g/L以上时,鼠李糖乳杆菌基本不生长和产酸,葡萄糖消耗也被抑制。酵母粉是鼠李糖乳杆菌的优良氮源,使用其它被测试的氮源菌体生长和产酸都有一定程度的下降。用廉价的黄豆粉并补充微量维生素液,替代培养基中的酵母粉,可以使产酸浓度和碳源得率得以基本维持。     

信息库

１．在气升式生物反应器中用米根霉重复分批培养生产Ｌ（＋）┐乳酸米根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ）以玉米淀粉为原料在气升式生物反应器中可以生产出旋光纯度高和生产成本低的Ｌ（＋）－乳酸（参见“工业微生物”,１９９８,２８（１）：信息库１）。但是在一般...     

L-乳酸调控乳酸产生菌产物光学纯度的分析

发酵初期在米根霉菌发酵培养基中添加L-乳酸可以调控发酵产物乳酸的光学纯度。随着L-乳酸添加量的增加,所产L-乳酸的光学纯度随之增加,当L-乳酸的添加量≥1.5g/L时,D-乳酸不再产生。同时,L-乳酸的产量、生物量、糖转化率也随之降低。该调控方法对乳酸菌调控产L-乳酸光学纯度影响不大,对大肠杆菌发酵调控产D-乳酸光学纯度没有效果。     

代谢工程大肠杆菌利用甘油高效合成L-乳酸

以甘油为碳源高效合成L-乳酸有助于推进油脂水解产业和生物可降解材料制造业的共同发展。为此,首先分别从凝结芽胞杆菌Bacillus coagulans CICIM B1821和大肠杆菌Escherichia coli CICIM B0013中克隆了L-乳酸脱氢酶基因BcoaLDH和D-乳酸脱氢酶 (LdhA) 的启动子片段PldhA。将两条DNA片段连接组成了表达盒PldhA-BcoaLDH。然后将上述表达盒通过同源重组删除FMN为辅酶的L-乳酸脱氢酶编码基因lldD的同时克隆入ldhA基因缺失菌株E. coli CICIM B0013-080C (ack-pta pps pflB dld poxB adhE frdA ldhA)的染色体上,获得了L-乳酸高产菌株E. coli CICIM B0013-090B (B0013-080C,lldD::PldhA-BcoaLDH)。考察了菌株CICIM B0013-090B不同培养温度下代谢利用甘油和合成L-乳酸的特征后,建立并优化了一种新型L-乳酸变温发酵工艺。在7 L发酵罐上,发酵27 h,积累L-乳酸132.4 g/L,产酸强度4.90 g/(L·h),甘油到L-乳酸的得率为93.7％,L-乳酸的光学纯度达到99.95％。     

木质纤维基L-乳酸生物制造的技术经济分析

L-乳酸因对人体安全无毒,应用领域广泛。为提高L-乳酸的产量、得率,降低其生产成本,选用制备L-乳酸的理想菌种米根霉,以低聚木糖生产废渣为底物,探究基于木质纤维原料生物转化L-乳酸的最佳工艺路线。采用纤维床生物反应器固定化米根霉进行同步糖化发酵,有利于解决低聚木糖工业加工中的大量废渣再利用问题,实现米根霉利用木质纤维原料低成本、高得率制备L-乳酸。在固定化米根霉发酵的基础上,从原料低聚木糖生产废渣到成品L-乳酸全工艺过程,利用Super Pro Designer进行评估核算,探讨其工业化可行性和经济效益,年产5.0万t L-乳酸的项目建设投资回收期为3.24年。     

pH对米根霉发酵厨余垃圾生产L-乳酸的影响

为了强化厨余垃圾发酵L-乳酸的产量和光学纯度,研究了pH对米根霉AS3.819发酵厨余垃圾生产乳酸及其光学特性的影响。结果表明,在中温条件下(34℃),米根霉生长的最适pH为7,最适发酵条件为8。用米根霉发酵非灭菌的厨余垃圾生产乳酸,发酵液中还原糖浓度低,且呈先升高,后下降到最低的趋势。pH调节到近中性和偏碱性(pH6、7、8)的各组还原糖浓度高于偏酸性组(pH 5和对照组)。控制pH为8时,总乳酸产生速率达1 g/(L·h),L-乳酸是主要的异构体形式,L-乳酸在总乳酸中的比例在整个发酵时间段内都保持在0.75以上,L-乳酸浓度最高达到59.8 g/L,L-乳酸光学纯度可达到0.99。控制pH为8时,可以同时获得高的乳酸产量和光学纯度。     

微生物发酵产光学纯度D-乳酸研究进展

D-乳酸作为一种重要的手性中间体和聚乳酸合成的原料,其生产已越来越受到人们的重视。然而,低光学纯度D-乳酸在很多领域的应用都受到限制。微生物发酵法能够生产高光学纯度的D-乳酸。除了乳酸生产的传统菌株-乳酸细菌,研究者们还通过基因工程的手段不断探索其它种属菌株利用更廉价的可再生资源高产光学纯度D-乳酸的可行性。介绍了D-乳酸的物化性质及其在工业生产、化学加工和聚乳酸合成中的应用,并详细综述了国内外发酵法生产光学纯度D-乳酸的最新研究进展,着重介绍了采用基因工程育种策略提高菌株的D-乳酸产量、转化率、生产强度以及光学纯度,降低副产物的合成,扩大底物利用范围的研究成果。所涉及的菌株包括:乳酸细菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌以及酵母等。这些研究表明,应用基因工程手段改造生产菌株的代谢途径是选育D-乳酸发酵生产菌株的发展趋势。最后还对D-乳酸发酵生产的前景进行了展望。     

利用五碳糖产高纯度L-乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建

[目的]本研究以已敲除多个产杂酸酶基因的大肠杆菌(Escherichia coli)乙醇工程菌SZ470(△frdBC △ldhA △ackA △focA-pflB △pdhR::pflBp6-pflBrbs-aceEF-lpd)为起始菌株,进一步敲除其乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)基因,同时插入带有自身启动子的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LLDH)基因,构建可利用五碳糖同型发酵L-乳酸重组大肠杆菌.[方法]利用λ噬菌体Red重组系统构建乙醇脱氢酶基因(adhE)缺失菌株Escherichia coli JH01,并克隆P.acidilactici的ldhL基因,利用染色体插入技术将其整合到JH01基因组,构建产L-乳酸大肠杆菌基因工程菌Escherichia coli JH12,利用无氧发酵15 L发酵罐测定重组菌株L-乳酸产量.[结果]工程菌JH12在15 L发酵罐中以6％的葡萄糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为1.46 g/(L·h),乳酸生产强度为1.14 g/(L·h),乳酸的产量达到41.13 g/L.发酵产物中未检测到琥珀酸、甲酸的生成,仅有少量乙酸生成,L-乳酸纯度达95.69％(L-乳酸在总发酵产物的比率).工程菌JH12以6％的木糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为0.88 g/(L·h),乳酸生产强度为0.60 g/(L·h),乳酸的产量达到34.73 g/L.发酵产物中杂酸少,乳酸的纯度高达98％.[结论]本研究通过基因敲除、染色体插入及无氧进化筛选获得一株产L-乳酸的大肠杆菌工程菌JH12,该菌株不需利用外源质粒,稳定性好,可利用五碳糖进行发酵,发酵产物中杂酸少,L-乳酸的纯度高.本研究为L-乳酸大肠杆菌工程菌的构建提供一定的技术支持,同时也为大肠杆菌L-乳酸的工业化生产提供了参考依据.     

耐氨米根霉发酵生产L-乳酸的研究

传统的L-乳酸发酵法生产以CaCO3为酸中和剂,在乳酸后提取中产生的大量石膏废渣不仅在过滤时造成较大的乳酸损失,而且由于废渣不易处理,对L-乳酸万吨级规模的生产将形成巨大的环保压力和废渣处理成本。为此,为了降低L-乳酸生产成本,该文采用氨水为酸中和剂,用筛选得到的一株米根霉RhizopusoryzaeJS-N02-02进行以氨水为中和剂的L-乳酸摇瓶、15L自动发酵罐的发酵试验。以玉米粉双酶水解糖为碳源,接种孢子浓度1×105个ml,以0.01%(NH4)2SO4为氮源,30℃,15L自动发酵罐连续5批发酵,平均总糖浓度为136.8gL,平均产酸达100.6gL,L-乳酸纯度达95.3%,糖酸转化率达71.6%。     

代谢工程改造大肠杆菌生产乳酸的研究进展

乳酸是自然界中最小的手性分子,广泛应用于食品、医药和化工等领域,同时也是合成生物可降解塑料——聚乳酸的前体。目前,化学合成法和微生物发酵法是生产乳酸的两种主要方法,而后者在底物的可再生性、产物光学纯度和环境友好等方面均具有潜在优势。自然界中许多微生物细胞都能合成和积累乳酸,如大肠杆菌、酿酒酵母和乳酸菌等。与乳酸菌、芽胞乳杆菌和谷氨酸棒状杆菌等乳酸生产菌株相比,大肠杆菌具有生长速度快、营养要求简单、易于高密度发酵、代谢网络清楚、遗传操作方法成熟和产物乳酸光学纯度高等优势。本文中,笔者介绍了乳酸的研究现状及其在工业生产领域中的作用,系统综述了国内外通过代谢工程改造大肠杆菌生产乳酸的研究进展,在此基础上展望了乳酸生产研究的发展方向,以期为其工业应用提供参考。     

重组大肠杆菌转化甘油合成聚3-羟基丙酸-co-乳酸

聚羟基脂肪酸酯作为性质优良的生物塑料,引起了广泛的关注。由于聚羟基脂肪酸合成酶PhaC特异性较强,难以通过生物合成方法获得含乳酸单体聚合物。为了实现乳酸的聚合,PhaC的筛选至关重要。以甘油为底物,通过引入Klebsiella pneumoniae的甘油脱水酶DhaB123及其激活因子GdrAB以及Salmonella typhimurium LT2的丙醛脱氢酶基因PduP,获得3-羟基丙酰辅酶A;通过引入Megasphaera elsdenii DSM 20460的丙酰辅酶A转移酶PCT,获得乳酰辅酶A;并对3种不同聚羟基脂肪酸合成酶的作用进行考察。在Pseudomonas putida的原始酶PhaC1或者PhaC2的作用下,不能实现乳酸的聚合;而在双位点突变(Ser325Thr和Gln481Lys)的PhaC1(STQK)存在条件下,重组菌可以利用甘油合成聚3-羟基丙酸-co-乳酸。经过对溶氧、有机氮源等发酵条件的优化,聚3-羟基丙酸-co-乳酸的产量可以达到0.22g/L,占细胞干重的3.2%,是含乳酸单体聚合物生物合成研究的一次有益尝试。     

乳杆菌Lactobacillus sp.lxp发酵高产L-乳酸研究

筛选得到一株乳杆菌Laetobaeillus sp．,进行发酵生产高浓度L-乳酸的研究。考察了种龄、接种量、温度和不同pH调节剂对乳酸发酵的影响。结果表明：最佳种子培养时间为15h;最佳接种量为15％;最适培养温度为42℃;与氨水和氢氧化钠相比,碳酸钙更适于作为发酵过程的pH调节刺;以葡萄糖为碳源,添加豆粕水解液和玉米浆作为辅料,2L罐培养120h,L-乳酸质量浓度可达202 g/L,糖转化率91．3％,L-乳酸占发酵液中总酸含量98％以上。     

ldhL-ldb0094基因敲除对保加利亚乳杆菌产L-乳酸的影响

以保加利亚乳杆菌Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CICC21101为出发菌株,利用PCR扩增L-乳酸脱氢酶(ldhL)基因上下游序列ldhL1、ldhL2,获得ldhL基因缺失且包含上下游序列的片段,连接到乳酸菌专用温敏性基因敲除质粒pGhost4,将构建好的敲除载体电转入保加利亚乳杆菌CICC21101,低温筛选。结果表明,成功获得敲除ldhL基因的敲除突变株,敲除后的工程菌D-乳酸产量由30. 5g/L降为4. 8g/L,L-乳酸的产量由25. 4g/L增至58. 3g/L,光学纯度由54. 56%增至90%。同时发现ldhL-ldb0094基因的敲除致使ldhL-ldb1020表达的上调,D-乳酸脱氢酶(ldbD)基因表达量没有变化,ldhL基因敲除株的成功构建将为进一步研究该基因在保加利亚乳杆菌中的功能及后续高光学活性D-乳酸工程菌构建奠定基础。     

副干酪乳杆菌的功能特性及其应用研究进展

副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)属于乳杆菌属,是一种革兰氏阳性细菌。它不仅具有抑菌和免疫调节性能,对人体有很好的益生作用,而且可以用于代谢合成重要的生物化学品,近几年引起了国内外的关注。本文对副干酪乳杆菌的菌株筛选鉴定、功能特性及其在微胶囊技术、L-乳酸生产、苯乳酸合成等方面的应用研究进展等进行了综述,同时对其研究发展方向进行了探讨。     

L-乳酸发酵的研究

本文报导了L-乳酸产生菌筛选、发酵条件以及发酵产物鉴定的结果。从56株根霉中筛选出10株产L-乳酸较高的菌株,其中根霉R47产L-乳酸最高,产酸稳定。发酵条件试验结果表明,该菌最适发酵培养基组成(％)：葡萄糖15,尿素0．2,KH 2PO40．02,MgSO4·7H2O0．025,ZnSO4·7H2 0 0．0044,CaCO3,6,7;pH6．7。在摇瓶培养条件下,35℃48小时,产L-乳酸达11．84 g／100 ml,对糖的重量转化率达78,9％。发酵液经离子交换等方法纯化,得到无色或微黄色透明糖浆状液体。经纸层析、比旋光度测定、紫外光谱和红外光谱分析证明确系L-乳酸。     

三相流化床中固定化米根霉萃取发酵生产L-乳酸

以TRPO／磺化煤油为萃取剂,在2L三相流床反应器中进行了固定化米根霉原位萃取和异位萃取发酵生产L-乳酸的实验,结果表明,发酵液中的pH值能被控制在3．5左右．产酸速率高达每小时．每1L固定化颗粒产生11gL-乳酸。提出了一个数学模型用以描述萃取发酵中L-乳酸的积累及在各相的分配情况。模型计算曲线与实验值符合良好。     

重组大肠杆菌利用废纸水解液发酵产L-乳酸

前期通过基因工程手段,构建了一株大肠杆菌工程菌E.coli WL204,该菌株可以有效利用木糖为底物发酵产L-乳酸。以废纸为发酵原料,研究该菌株利用木质纤维素发酵产乳酸的特性。原料以稀硫酸预处理后,经纤维素酶酶解,得到的水解液用Ca(OH)2脱毒后,接种E.coli WL204,在7L发酵罐中发酵72h,每100g废纸可以产生31g乳酸,糖酸转化率为79%。结果表明,E.coli WL204可以木质纤维素原料为底物发酵生产L-乳酸,具有一定的工业化开发潜力。     

L-乳酸通过新产品鉴定

上海益尔宝乳酸制品厂转让上海市工业微生物研究所科技攻关成果.开发生产出高品位L-乳酸.此项目列入市级和国家级星火计划及市科委新产品鉴定计划.8月6日由上海市科委组织,崇明县科委主持通过了L-乳酸新产品鉴定.L-乳酸对人体具有重要的生理功能,是体内肌肉活动的“高效燃