胰岛素及胰高血糖素对HepG2细胞载脂蛋白CⅢ受体功能的影响

为寻求一种可替代人肝细胞研究载脂蛋白（apolipoprotein, apo）CⅢ受体的生理模型,并探讨apoCⅢ受体的生理功能及其在内源性高甘油三酯血症发病机制中的作用,首先以¹²⁵I标记的人apoCⅢ为配体,利用放射性配体结合分析法观察了人肝癌细胞系HepG2细胞是否有apoCⅢ受体存在.结果证实HepG2细胞上存在高亲和力的、可饱和的、特异的apoCⅢ受体结合位点,其受体的亲和力(K_d)和apoCⅢ受体结合容量(B_max)分别为(9.53±1.03)×10^-9 mol/L和(3.28±0.31) μg/g.随后又分别研究了胰岛素及胰高血糖素对HepG2细胞apoCⅢ受体功能的影响,结果表明：胰岛素可使HepG2细胞apoCⅢ受体结合容量（B_max）显著增加,但对受体的亲和力（K_d）无影响;胰高血糖素可使HepG2细胞apoCⅢ受体亲和力显著下降（即K_d值升高）,对受体的结合容量无影响.提示人肝apoCⅢ受体的功能可能受胰岛素及胰高血糖素的不同调节.     

载脂蛋白CⅢ与高甘油三酯血症

载脂蛋白CⅢ(apolipoprotein CⅢ,apoCⅢ)能抑制脂蛋白脂酶的活性及肝脏对富含甘油三酯的脂蛋白(triglyceride-rich lipoproteins,TRLs)残体的摄取,在调节TRLs代谢中具有重要作用。自然发生的APOC3基因突变对人血浆apoCⅢ和甘油三酯浓度均有影响。小鼠过表达人apoCⅢ可产生严重高甘油三酯血症,而APOC3基因敲除小鼠则表现为明显的低甘油三酯血症。除遗传因素外,环境及内分泌因素也会对apoCⅢ的代谢产生影响,这使得以apoCⅢ代谢为靶点来优化脂代谢紊乱和心血管疾病的治疗(尤其在代谢综合征患者中)显得尤为重要。     

人表皮生长因子受体在大肠杆菌菌膜上功能性表达

为将人表皮生长因子(EGF)受体膜外第Ⅲ功能区(hEGF-RⅢ)表达于大肠杆菌菌膜上,重组构建了EGF-RⅢ表达载体,并转化获得大肠杆菌表达株.放射性受体分析发现¹²⁵I-EGF可与表达菌特异性结合,其特异性结合量随反应的时间和温度而变化,Scatchard分析显示表达菌表达单一亲和性受体,其解离常数为3.0×10^-11 mol/L,每个细菌约有738个结合位点.免疫电镜显示EGF-RⅢ多分布于细菌菌膜上.     

地塞米松对HepG2细胞分泌载脂蛋白的影响

以培养的人肝癌细胞系HepG2为研究对象,采用“冻干浓缩培养液载脂蛋白测定法”,考察了地塞米松对HepG2细胞载脂蛋白(apolipoprotein,apo)AⅠ、AⅡ、CⅢ、B100及E分泌的影响.结果表明：地塞米松对HepG2细胞apoAⅠ和apoE的分泌有促进作用,对apoAⅡ、apoB100和apoCⅢ的分泌有抑制作用,且这种作用随地塞米松浓度的增加而增强.当培养液中地塞米松的浓度为5.5×10^－5mol/L时,apoAⅠ和apoE的分泌分别增加36.6%和49.4%（P＜0.01）,apoAⅡ、apoB100和apoCⅢ的分泌分别减少38.9%、31.9%和29.8%（P＜0.01）.     

放射受体法测定表皮生长因子

介绍用大鼠肝细胞膜为材料 EGF 放射受体分析方法. ¹²⁵I-EGF 采用 Iodogen 方法,其标记率为50%左右, ¹²⁵I-EGF 对受体的结合率为20—30%.大鼠肝细胞膜 EGF放射受体法的灵敏度为 28pg/管,精密度为6.3%.应用此法测定了大鼠血清,颌下腺和唾液中的 EGF 的含量.     

Flk1+间充质干细胞减轻四氯化碳导致的肝纤维化的研究

许多慢性肝脏疾病都会发生肝纤维化,但是目前尚缺乏对肝纤维化切实有效的治疗手段。实验发现,Flk1(fetalliverkinase)阳性间充质干细胞(MSC)能够减轻四氯化碳(CCl₄ )所致小鼠肝纤维化。取雄性BALB c小鼠骨髓,分离培养Flk1⁺ MSC ,用CCl₄ 制作雌性小鼠肝纤维化模型,在CCl₄ 损伤后立即或1周后经尾静脉注射Flk1⁺ MSC ,2或5周后检测受体小鼠肝脏的纤维化程度和供体细胞的植入。结果发现,CCl₄ 损伤后立即注射Flk1⁺ MSC ,可以使肝脏损伤程度明显减轻,减少胶原沉积,使肝脏羟脯氨酸含量及血清纤维化指标显著下降;而损伤1周后注射细胞则无明显变化。免疫荧光、PCR和荧光原位杂交方法证实,在受体肝脏中有供体细胞植入,呈上皮细胞形态,并表达白蛋白,但是数量很少。因此,Flk1⁺ MSC具有潜在的植入肝组织的能力,并可能启动肝组织的内源性修复,减轻CCl₄ 导致的肝纤维化。     

猪apoC3基因的遗传变异分析

目的:探究猪apoC3基因多态性,为进一步探讨其对脂肪沉积的影响和表达调控等研究提供依据。方法:选取具有不同脂肪沉积特点的3个猪种(可乐猪、贵州白香猪和大约克猪)构建品种DNA池并进行测序,结合各SNP位点测序峰高比值估算等位基因频率,并利用在线软件对不同基因型的转录结合位点及mRNA二级结构进行预测。结果:在3个猪种的apoC3基因中共发现17个SNPs(2个位于5’侧翼区;1个位于外显子3中,为同义突变;1个位于3’非翻译区,其它13个分别位于3个不同内含子中),其中C813G变异增加了一个转录因子GATA-2结合位点,G2280A变异导致mRNA二级结构最小自由能增加0.4kkal/mol。结论:不同猪种间apoC3基因SNPs位点等位基因频率差异较大,而apoC3基因编码区相对保守。     

人成体肝细胞在Fah-/-Nod/Scid小鼠肝脏中的显著增殖

利用人肝细胞异种移植到受体鼠肝内建立人源化肝脏的嵌合体小鼠(人鼠嵌合肝)对药物代谢、乙型肝炎病毒等嗜肝性病毒及其疫苗的研究具有重要意义. 研究表明, 利用Fah^-/-Rag2^-/-Il2rg^-/-三基因剔除小鼠可获得人肝细胞在小鼠肝脏中的显著再殖, 但较高的死亡率及纯合子不能用于繁殖, 制约着该小鼠模型的规模化应用. 本研究结合延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因剔除(Fah^-/-)小鼠的肝脏再殖优势和Nod/Scid小鼠异种移植的特点, 将这两种小鼠进行杂交繁育建立Fah^-/-Nod/Scid小鼠品系, Fah^-/-Nod/Scid小鼠可以纯合保种并能正常繁殖. 采用提前停药的预处理方案, 结合FK506处理, 移植的人成体肝细胞能够实现在Fah^-/-Nod/Scid小鼠肝脏中的显著增殖, 肝脏再殖程度达到30%以上. 采用体重曲线、肝功能和人肝细胞功能蛋白表达等三方面指标评价嵌合肝脏中人肝细胞的功能, 结果表明再殖的肝细胞具有正常的人肝细胞功能. 这些结果表明, Fah^-/-Nod/Scid小鼠可以作为理想的可规模应用的人鼠嵌合肝模型, 该技术体系的改进简化了Fah^-/-小鼠作为人源化肝脏小鼠模型的实用性问题.     

肝靶向配体半乳糖基白蛋白和多聚谷氨酸

化学合成两类去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的人工配体——半乳糖基白蛋白(Gal_nHSA)和半乳糖基多聚-L-谷氨酸(Gal_nPLGA), 并以 ¹²⁵I标记的去唾液酸胎球蛋白(ASF)为标准配体,测定了合成配体抑制 ¹²⁵I-ASF与大鼠肝细胞膜ASGPR结合的IC₅₀值. 结果表明,Gal₁₂HSA、Gal₁₅HSA、Gal₂₆HSA、Gal₃₀HSA和Gal₃₄PLGA均能够有效地抑制 ¹²⁵I-ASF与ASGPR的结合,且前者与ASGPR的亲和力随半乳糖基化程度的增加而增加. 这些合成配体来源丰富、制备简单,适合于作为药物或基因肝靶向运送的导向配体.     

膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa单抗通过抑制HMGB1/TLR4 途径减轻ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化

观察膜糖蛋白(GP) Ⅱb/Ⅲa 单抗对小鼠动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)病变和HMGB1/TLR4途径基因表达变化的影响,以探讨膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受体拮抗剂对As进程的影响及其机制．30只5周龄雄性ApoE^-/-小鼠随机均分为3组：溶剂对照组(生理盐水50 μl,腹腔注射),IgG 对照组(50 μg,腹腔注射),GP Ⅱb/Ⅲa 单抗组(50 μg,腹腔注射)．实验ApoE^-/-小鼠均已高脂、高胆固醇饲料喂养,10周后处死动物．油红O染色观察主动脉窦As病变;活体荧光显微镜观察颈总动脉As病变处血小板黏附;Western blot 检测HMGB-1、TLR4与NF-κB蛋白的表达;免疫组化观察主动脉窦As病变部位MOMA-2 和VCAM-1的表达;ELISA法检测血浆中HMGB-1、IL-1β、TNF-α 与MCP-1的含量．研究结果表明：与对照组相比,GPⅡb/Ⅲa 单抗组ApoE^-/-小鼠As病变和血小板黏附显著减少(P < 0.05);且该组小鼠主动脉TLR4与NF-κB蛋白的表达明显降低;其血清中的HMGB-1、IL-1β、TNF-α 与MCP-1的水平也明显下降(P < 0.05)．此外,GP Ⅱb/Ⅲa 单抗治疗显著减少As病变处MOMA-2 和VCAM-1的表达(P < 0.05)．GP Ⅱb/Ⅲa 单抗减轻ApoE^-/-小鼠As病变可能与抑制HMGB1/TLR4途径介导的炎症有关．     

小鼠心室肌细胞内向整流钾电流的特性及其与早后去极化的关系

用全细胞膜片钳技术首次研究了成年小鼠单个心室肌细胞内向整流钾电流(I_k1)的整流特性,膜电导和反转电位对胞外钾离子浓度的敏感性及激活、失活动力学等性质。发现小鼠心室肌细胞I_k1最突出的特点就是其电压-电流(I～V)曲线在正于反转电位50mV的范围内无负斜率(negative slope)区,而是保持在一个很低的外向电流水平(59±39)pA。当用3mmol/L K^±和3mmol/L Cs^±灌流时,这一部分的I_k1减小为零,随后产生早后去极化(EAD)。结果提示:小鼠I_k1的这一特点与其EAD易发有关,I_k1受抑是本实验EAD发生的先决条件。     

鸡胚肝乳糖凝集素专一性的研究——SEM-ARG技术的应用

本文利用扫描电镜放射自显影(SEM-ARG)技术研究鸡胚肝凝集素的专一性。该凝集素经乳糖尿素液抽提和离心分离后,再用DE-52纤维素柱和蓝色葡聚糖柱进一步纯化。纯化后的鸡胚肝凝集素用 ¹²⁵Ⅰ标记。以标记的 ¹²⁵Ⅰ-凝集素为探针再标记来自不同组织的细胞。标记的细胞经过放射自显影,用扫描电镜对细胞表面凝集素受体的位点进行直接观察。实验结果表明鸡胚肝凝集素对细胞的凝集作用具有相对的专一性。     

绿脓杆菌外毒素A的结构、功能及其重组毒素

绿脓杆菌外毒素A有三个结构功能区.氨基端区(Ⅰ)通过关键位点Lys57结合靶细胞表面受体.中心区(Ⅱ)负责该毒素的跨膜转位功能,Arg276和Arg279是关键位点.在胞吞泡内此毒素于Arg279与Gly280间酶解成28 000和37 000两片段.羧基端区(Ⅲ)所在的37 000片段由其末端氨基酸序列REDLK介导到内质网再转位入胞浆通过Glu553位点结合NAD⁺使延伸因子-2受ADP-核糖基化而抑制细胞蛋白质合成导致细胞死亡.改造的毒素基因同识别蛋白基因融合成的重组毒素有应用前景.     

ALPL缺陷加速高脂诱导小鼠肝内脂肪沉积

摘要 目的：明确肝/骨/肾型碱性磷酸酶基因（liver/bone/kidney alkaline phosphatase,ALPL）在高脂诱导肝内脂肪沉积的作用。方法：利用野生型（WT）和ALPL敲除小鼠（ALPL^+/-）,给予高脂饮食8周诱导脂肪肝模型,检测小鼠肝内脂肪沉积和血清中葡糖糖、甘油三脂及胆固醇含量,并应用RT-PCR、Western blotting和免疫荧光染色检测肝组织中脂肪酸生成和转运相关基因表达变化。结果：ALPL^+/-组在正常饮食条件下较WT组肝内脂肪沉积无明显变化,而血清中葡萄糖和胆固醇含量增加;高脂条件下,敲除ALPL小鼠肝内脂肪沉积明显增加,且伴随血清中甘油三脂含量增加。RT-PCR和Western blotting结果显示,在高脂诱导下ALPL^+/-小鼠肝组织中关键脂肪酸生成基因ACC1、ACC2和 PPAR-γ,及脂肪酸生成基因LPL表达明显增加。此外,免疫荧光染色结果显示高脂诱导下敲除ALPL小鼠肝组织中的PPAR-γ阳性肝细胞明显增加。结论：ALPL敲除促进肝内脂肪酸生成和转运,加速高脂诱导小鼠肝内脂肪沉积,为阐明脂肪肝病变分子机制提供理论支持。     

大鼠肝细胞膜高密度脂蛋白受体的研究

以 ¹²⁵碘标记不含apoE的人HDL₃为配体,采用简便的聚乙二醇沉淀分离法,建立了纯化的大鼠肝细胞膜HDL受体分析法,并对膜HDL受体的性质进行了研究。     

蓖麻蚕rDNA转录起始区核酸酶S1的敏感位点的特征结构

曾报道,蓖麻蚕rRNA基因的非转录间隔区内有1个单链核酸酶S1的超敏感位点,它具有d(AT)₁₈的特征结构^[1] .蓖麻蚕经饥饿,再食后.发现在该S1超敏感位点的下游还存在1个敏感位点,而在饥饿的情况下,未能检测到染色质上的这个敏感位点^[2].新确定的这个可诱导的单链核酸酶的敏感位点,它是一个d(GT)₁₀…d(AT)₁₀的特殊结构,具有易解链的特征.这个新确定的核酸酶S1的敏感点结构可能直接参与了rDNA的转录和复制的调控.     

插入到细胞膜上的葡萄糖转运子4可不暴露其被光化学法标记的活性位点

胰岛素刺激骨胳肌产生磷脂酰肌醇3, 4, 5三磷酸(PI(3,4,5)P₃), 它是促进葡萄糖转运子4(GLUT4)与细胞膜融合的必要条件. 向肌肉细胞内导入PI(3,4,5)P₃可以模拟胰岛素刺激GLUT4与细胞膜融合的作用, 但不足以增加细胞摄取葡萄糖的量. 本研究目的是探讨PI(3,4,5)P₃与胰岛素作用不同的机制. 在骨骼肌细胞株(L6-GLUT4myc)中, 应用免疫反应方法检测细胞膜片上与特异性抗体反应的GLUT4的胞浆区羧基末端表位和胞外区myc表位的可用性; 使用不能渗透到细胞内的甘露糖-生物素衍生物Bio-LC-ATB-BMPA, 结合亲和光化学标记法检测GLUT4胞外区的活性位点. 相对于基础组, 100 nmol/L胰岛素和10 mmol/L PI(3,4,5)P₃分别使与myc结合的抗体量增加1.64倍和1.58倍. 胰岛素还使细胞膜上GLUT4的光化学标记量和细胞膜片上与羧基末端表位结合的抗体量分别增加了2.47倍和2.04倍, 而PI(3,4,5)P₃则无此作用. 在胰岛素作用下, 细胞膜片上与羧基末端表位结合的抗体量大于与myc表位结合的抗体量(分别为2.04和1.64倍). 结果表明: (i) 尽管PI(3,4,5)P₃能使GLUT4与细胞膜融合, 但不能使GLUT4胞外区的活性位点暴露; (ii) GLUT4胞外区活性位点的可用性与胞浆区羧基末端的可用性相关; (iii) 除了能刺激GLUT4与细胞膜融合, 胰岛素还使封闭GLUT4羧基末端的蛋白脱离. 推论胞浆内某种蛋白封闭羧基末端, 同样阻止甘露糖-生物素衍生物对GLUT4活性位点的标记, 并可能妨碍GLUT4转运葡萄糖.     

胸腺树突状细胞对胸腺细胞凋亡的促进作用

小鼠胸腺细胞在体外培养一定时间后自发出现凋亡,在与小鼠胸腺树突状细胞(MTSC4)共育后,其凋亡过程可被明显加速;与此相反,小鼠胸腺上皮细胞(MTECI)有抑制凋亡的作用.与MTSC4共育后的胸腺细胞中不仅CD4⁺CD8⁺双阳性细胞明显减小,而且CD4⁺CD8⁺单阳性细胞也减少.提示胸腺基质细胞可通过其对细胞凋亡的促进作用参与胸腺内的阴性选择,并提示阴性选择可能在胸腺髓质区仍在进行.     

Bmi1过表达通过促进增殖、抑制凋亡纠正活性维生素D缺乏引起的骨量降低

摘要 目的：探索B淋巴瘤Mo-MLV插入区1（B cell-specific MLV integration site-1, Bmi-1）过表达能否通过促进增殖、抑制凋亡改善1,25-二羟基维生素D (1,25-dihydroxy vitamin d,1,25(OH) ₂D)缺乏引起的小鼠骨质骨量丢失。方法：取8月龄Bmi-1 ^Tg 、Bmi1 ^Tg 1α(OH)ase^+/-与 1α(OH)ase^+/-小鼠以及同窝野生型（wild type, WT）小鼠椎骨组织,通过流式细胞术及TUNEL染色检测间充质干细胞周期变化及凋亡水平,通过PCNA染色及免疫组织化学染色检测小鼠椎骨组织中Bcl-2、Caspase-3等指标的变化,通过Western blot检测小鼠椎骨中Caspase-3、CDK4、CDK6、OPN、OCN等蛋白表达量的差异,通过ALP染色检查成骨细胞骨形成水平。结果：在骨髓间充质干细胞中过表达Bmi1可以通过促进增殖,抑制凋亡、增加成骨细胞骨形成来纠正1α(OH)ase^+/-小鼠的骨量降低。结论：Bmi1是1,25(OH) ₂D的关键下游靶点,在防止1,25(OH) ₂D缺乏引起的骨丢失方面起着至关重要的作用。     

拟南芥中PAP特异磷酸酶(AtAHL)的折叠识别与结构预测

通过现有的序列同源性比较、二级结构预测、三维结构预测和模拟方法,得到了拟南芥中PAP特异磷酸酶的三维结构.这是一种与酵母中的Hal2p蛋白质类似,并且N端为α＋β,C端为α/β结构域的多结构域蛋白质.分析预测所得结构,发现了Mg²⁺等金属离子的结合位点,推测了对Na⁺敏感的结构基础.这些结合位点与其生化功能相关.而且,通过结构与功能分析,讨论了蛋白质数据库(PDB)中同一个酶已有理论结构的不合理性.