使用固定于硝酸纤维膜上的抗原筛选单克隆抗体的两种方法

<正>近年来免疫化学和放射性免疫的许多工作已经涉及到固定于硝酸纤维膜上抗原的应用。Haukes等人的点一免疫结合试验用微量抗原结合硝酸纤维膜上为筛选单克隆抗体(McAb)提供了一个方案。我们发展了一种简化了的筛选体系,即把抗原点加在一张与96孔微量滴定板同样大小的硝酸纤维膜上,用一块制成单园孔的铝模板置于有抗原点的硝酸纤维膜上面,可加入极少量(2ul)的杂交瘤上清液亦可与大量(可达200ul)杂交     

用硝酸纤维素膜亲和法纯化抗体

介绍一种改进的纯化抗体方法。将抗原蛋白固定在硝酸纤维素膜上,然后对抗体进行亲和纯化,能快速有效获得高特异性抗体。     

神经元特异性烯醇酶和癌胚抗原胶体金免疫层析联合检测

目的:应用双抗夹心胶体金免疫层析方法,实现对神经元特异性烯醇化酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)两种肺癌肿瘤标志物的快速联合检测。方法:采用柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金颗粒,并分别对鼠抗NSE、CEA单克隆抗体进行标记,分别与之相配对的另一种单克隆抗体被喷在硝酸纤维素膜(NC膜)上,制成免疫层析检测试条。溶液中的抗原NSE、CEA与金标记抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上固定的抗体结合形成肉眼可见的红色线条。结果:该试纸条只与NSE、CEA有特异性反应,与CA125、CYFRA21-1、TPA等肺癌标志物无交叉反应。标准样品中两种抗原的检测灵敏度分别可达到5ng/mL和3ng/mL。结论:胶体金免疫层析技术检测NSE、CEA特异性强、灵敏度高、简便快速,不需特殊仪器设备,有广泛应用价值。     

青霉素结合蛋白2a单克隆抗体的研制和初步应用

目的研制青霉素结合蛋白2a(PBP2a)单克隆抗体(Mc Ab),为建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)免疫层析检测方法提供检测用抗体。方法以基因工程抗原r PBP2a免疫BALb/c小鼠,通过常规小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用免疫印迹技术(Western blotting)分析单克隆抗体特异性。选取敏感、特异的单克隆抗体进行金标记和硝酸纤维膜包被,建立胶体金免疫层析检测方法。结果共获得11株分泌抗r PBP2a的杂交瘤细胞,其中6株分泌的单克隆抗体能够与天然PBP2a呈阳性反应。用其中2株单克隆抗体建立的PBP2a胶体金免疫层析方法,可在5~20 min内完成检测。结论获得了特异性针对PBP2a蛋白的单克隆抗体,并初步建立了检测PBP2a蛋白的胶体金免疫层析检测方法,为临床快速、简便检测产生PBP2a的细菌提供了检测方法。     

艾滋病血清学诊断新方法——免疫斑点法的建立

运用基因重组技术在大肠杆菌生产出有诊断意义的人免疫缺损病毒(HIV)蛋白,将其初步提纯,再用快速蛋白液相层析技术进一步纯化,即可直接点样至硝酸纤维膜,用来检测HIV抗体。实验显示,这种免疫斑点法(Immunodot assay,IDA)的敏感性与间接免疫荧光法(IIF)相同,而特异性比它高,与蛋白印迹法(WB)相近。由于IDA试剂成本比IIF低,可用于HIV抗体检测的初筛。与IIF相比,IDA法具有假阳性率低、试剂稳定性高、操作简便和不需要昂贵的荧光显微镜等优点。因而是一种适合在基层应用的方法。     

应用斑点酶联免疫吸附试验对实验性临床病料的初步检测

先用实验室保存的口蹄疫病毒A和O两个血清型标准毒株分别制备出单克隆抗体(McAb)和多克隆抗体(PcAb),然后取经人工感染O型猪产生的水泡液或1:10稀释的水泡皮研磨浸出液,滴一滴(约2～4μl)至硝酸纤维素膜。硝酸和醋酸混合膜和醋酸纤维素膜的印圈中央,自然干燥,加封闭液作用30分钟,常规洗条;分组分别滴加ⅥcAb和PcAb,洗涤;加辣根过氧化物酶标记兔抗BALB/C鼠免疫球蛋白结合     

丁酸钠对人胃腺癌SGC-7901细胞的生物学效应

应用兔抗纤维粘(连)蛋白(FN)抗体和兔抗3t,5,环腺苷酸(cAMP)特异性抗体,并用羊抗兔IgG荧光抗体,在荧光显微镜下观察丁酸钠对人胃腺癌SGC一7901细胞系的纤维粘(连)蛋白(FN)和cAMP水平的变化。实验结果表明丁酸钠有增强SGC一7901细胞内纤维粘(连)蛋白(FN)和c.~MP水平的作用;应用电镜细胞化学和扫描电镜的技术方法,观察到人胃腺癌SGC一7901细胞在丁酸钠作用下膜表而(Na 一K )一ATP酶活性明显下降;微绒毛明显减退,膜表面较光滑。这可能说明丁酸钠通过抑制(Na~一K )一ATP酶活性,提高了细咆内cAMP水平,调控细胞的增殖和分化。     

一种简易SNP 检测方法的建立

目的:建立一种快速、简单的SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)检测方法。方法:设计带生物素标记的扩增引物对检测用具有单碱基差异的野生型和突变型靶序列分别进行扩增,然后通过紫外交联的方式将相应检测靶序列的探针固定在硝酸纤维素膜上,借助Taq酶完成膜上单引物延伸,从而对探针捕获的靶序列进行延伸固定在膜上,最后使用生物素-亲和素酶联显色(ABS-ELISA)反应肉眼观察结果。结果:阳性和阴性对照探针显示正常。野生型探针和突变型探针能够分别特异性结合靶序列,并通过生物素和亲和素显色系统放大为一种肉眼可判断结果的检测形式。结论:建立了一种基于硝酸纤维素膜载体上进行核酸扩增的SNP检测方法。     

神经元特异性烯醇酶和癌胚抗原胶体金免疫层析联合检测

目的：应用双抗夹心胶体金免疫层析方法,实现对神经元特异性烯醇化酶（NSE）和癌胚抗原（CEA）两种肺癌肿瘤标志物的快速联合检测。方法：采用柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金颗粒,并分别对鼠抗NSE、CEA单克隆抗体进行标记,分别与之相配对的另一种单克隆抗体被喷在硝酸纤维素膜（NC膜）上,制成免疫层析检测试条。溶液中的抗原NSE、CEA与金标记抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上固定的抗体结合形成肉眼可见的红色线条。结果：该试纸条只与NSE、CEA有特异性反应,与CA125、CYFRA21-1、TPA等肺癌标志物无交叉反应。标准样品中两种抗原的检测灵敏度分别可达到5ng/mL和3ng/mL。结论：胶体金免疫层析技术检测NSE、CEA特异性强、灵敏度高、简便快速,不需特殊仪器设备,有广泛应用价值。     

甲胎蛋白和癌胚抗原的胶体金免疫层析同步检测

目的:探讨建立一种同时快速检测甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)两种肿瘤标志物的方法.方法:用胶体金分别标记鼠抗AFP单克隆抗体和鼠抗CEA单克隆抗体,喷于胶金垫上.与之配对的抗体喷在硝酸纤维素膜(NC膜)上分别做检测线T2和T1,兔抗鼠二抗喷在NC膜上做质控线,利用免疫层析技术进行检测.结果:采用Frens方法制备的胶体金粒径在20nm,紫外可见吸收峰在521 nm处,金标抗体的最适pH在9.0,最适抗体量为200μl,胶体金标记2.4μg抗体.测试结果表明同时检测AFP和CEA的试纸条灵敏度分别为20 ng.mL-1和5 ng.mL-1,检测时间仅需10min,与PSA、CA125、CA15-3、Ferritin、Human Albumin等没有交叉反应,稳定性好.结论:应用胶体金免疫层析技术,实现了AFP和CEA的同步检测.     

单纯疱疹病毒2型3万道尔顿结构蛋白的纯化及其特性研究

用抗HSV-2型特异性单克隆抗体CH-A9与Sepharose 4B偶联制备免疫吸附柱,以亲和层析的方法,从HSV-2感染的BHK细胞膜上纯化了一种HSV-2特异的结构蛋白(VP30)。实验表明,该结构蛋白的主要特性有:第一,分子量为30,000道尔顿;第二,具有HSV-2型持异性;第三,可在小鼠体内诱发中和抗体。     

基于硫醇自组装的肌红蛋白单克隆抗体金膜固相载体的构建

为了在金膜固相载体上固定肌红蛋白单克隆抗体 (MbAb),通过在金膜上生长一层巯基酸和巯基醇的混合自组装分子膜 (SAMs),用原子力显微镜 (AFM) 和X射线光电子能谱仪 (XPS) 分析样品的性质,再以1-(3-二甲基氨基丙基) 3-乙基碳化二亚胺盐酸 (EDC·HCl) 作为催化剂,自组装膜和抗体的氨基发生偶联反应,将抗体固定在金膜表面,并进行肌红蛋白抗原 (MbAg) 的测定。结果显示,通过条件优化实验,发现50 mmol/L的巯基16酸和巯基11醇混合乙醇溶液,60 ℃处理金膜3 h后,再偶联     

一种点杂交膜预处理方法的建立及应用

旨在解决手工点样斑点杂交中样品点密度小、点样体积受限制和点样点不规整等问题,建立了一种新的点杂交膜预处理方法。首先根据预设点样点的大小、排列方式和密度,制作柱状凸起模具;其次将模具固定于杂交膜上,使模具凸起部位与膜紧密接触;再将熔化的石蜡涂布于膜上非模具接触部位,待石蜡凝固后移走模具,获得预处理杂交膜。以荧光染料IRDye800标记的抗体为样品进行直接点样检测,同时提取水稻、小麦和大豆的蛋白进行点杂交实验验证。结果显示,利用上述方法得到非点样部位具有疏水性的预处理NC膜和PVDF膜,其点样点位置、形状和大小固定,点样密度高。不同体积荧光染料标记抗体直接点样得到的荧光图像整齐规范,水稻、小麦和大豆蛋白与水稻看家蛋白抗体Anti-HSP杂交后均能检测到稳定信号。杂交膜经预处理后可最大限度实现点样点位置、大小和形状的统一,并能显著提高上样体积和点样密度。     

细胞工程

<正>抗核酸单克隆抗体可以为阐明核酸一蛋白质交互作用提供一种独特的模型。用SpZ/O骨髓瘤细胞与来自MRL/lpr的脾细胞或经过特异免疫的BALB/小鼠的脾细胞相融合,再经过两次克隆而选择出杂交瘤细胞系。已建立一种硝酸纤维滤膜测定法。将已经放射性标记的DNA再经超     

应用SELEX技术筛选人类血型IgG适体的实验研究

目的:建立Rh(D)血型的IgG类抗体适体的筛选方法,为后续合成适体并进行新生儿溶血病的防治研究奠定基础。方法:利用SELEX技术,构建含有52个随机序列的单链DNA文库,利用硝酸纤维素膜法筛选与IgG类抗体分子高亲和力结合的核酸分子,同时探索并优化将其扩增为双链DNA核酸库的PCR反应条件;通过膜结合实验检测核酸分子的富集效果并用凝胶阻滞实验初步测定所得核酸适体与Rh(D)血型IgG类抗体的亲和力。结果:随着筛选的进行,核酸分子的富集库向着与靶分子亲和性增强的方向进化,经过了11个循环,筛选出与Rh(D)血型IgG抗体结合力较强的核酸分子,与核酸结合的IgG分子在凝胶阻滞实验中显示出阻滞带。结论:初步建立了利用SELEX技术筛选人类Rh(D)血型IgG抗体适体的方法。     

SARS病毒快速检测膜研制

建立一种快速检测严重急性呼吸综合症冠状病毒(SARS-CoV)的方法。从SARS冠状病毒刺突蛋白基因中扩增出羧基端片段,克隆并表达。用经Ni-NTA树脂纯化的表达蛋白作为抗原包被硝酸纤维素膜,捕获感染SARS病人血清中的抗体。抗原抗体通过渗滤在膜上反应,5min肉眼即可观察到结果。通过比较不同试剂用量条件下的结果确定检测抗原的最佳浓度。通过本产品检测已经过ELISA验证的50份血清样品证明两种检测结果无显著性差异(P>0.05)。与ELISA相比,该检测方法特异性、灵敏性几乎相当,但具有简单、快速、成本低廉等ELISA所无法比拟的优点,适合于初步诊断和流行病学调查。     

单克隆抗体概述

本文简单回顾了单克隆抗体技术产生的背景及发展和逐步完善的过程。从生化角度阐明选择核酸代谢旁路酶缺陷型的骨髓瘤细胞株和正常免疫脾细胞作为两个母本细胞融合成杂交细胞的原因,因为只有这样的细胞才能在HAT培养液中无限生长,也就是单克隆技术能取得成功的基本原理。比较了单克隆抗体和常规方法得到抗体的优越性,前者不仅可以较大量地得到高度纯化的针对某特定抗原决定簇的抗体,并能获得在通常情况下不易得到的抗弱抗原抗体,又是一个纯化某些物质的新的途径。本文又简述了单克隆抗体的生产程序,讨论了可能产生的技术问题;指出了杂交瘤的不稳定性和单克隆抗体不可能具有全部免疫球蛋白的生物活性的原因,例如有些单克隆抗体不结合补体,无细胞毒作用,无血凝作用或不与金黄色葡萄球菌蛋白A结合等。最后提出了单克隆抗体技术的应用方面,在产生大量高特异性的纯净抗体和为研究免疫反应的调节方面都有宽广的前途。     

甲胎蛋白胶体金检测试剂的的研制

为建立一种快速,简易胶体金免疫层析法（GICA）用于检测血清中的甲胎蛋白（AFP）,将AFP单克隆抗体分别标记胶体金并包被硝酸纤维素膜,制成免疫检测层析试剂,血清中的AFP与金标记抗体结合,沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上的固相抗体结合可形成肉眼可见的紫红色线条,此检测试剂对本室自制AFP参比品进行了检测,灵敏度达20ng/ml;对甘肃省肿瘤医院的176份癌症患者血清进行了检测。结果与ELISA法相一致,本法检测AFP快速,简便,结果准确,具有推广价值。     

新型冠状病毒胶体金抗原快速检测试剂的研制及性能评价*

目的:建立新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)胶体金抗原快速检测试剂的制备方法,并对检测试剂的性能指标进行评价。方法:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,用鼠抗核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)单克隆抗体及二硝基苯酚-牛血清白蛋白(DNP-BSA)作为标记抗体,硝酸纤维素膜上分别包被鼠抗核衣壳蛋白单克隆抗体和兔抗DNP多抗作为检测线和质控线制备免疫胶体金试纸条;对试剂最低检出限、交叉反应性、加速稳定性及临床诊断特异性和灵敏度进行性能评价。结果:检测热灭活培养物的最低检出限为2.0×10² TCID₅₀/mL;测试16种常见呼吸道病原体高浓度样本均无交叉反应;试剂盒50℃加速破坏8周稳定。临床及健康人群鼻咽拭子样本测试,诊断灵敏度为96.67%(29/30),特异性为99.23%(129/130),总符合率为98.75%(158/160);一致性检验Kappa值为0.959 0,P<0.05。结论:SARS-CoV-2胶体金抗原快速检测试剂检测灵敏度和特异性高,检测速度快,操作便携,无需设备,肉眼观察,可作为现有核酸检测法的补充手段,用于新型冠状病毒的早期筛查。     

抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体——Ⅱ.抗体的鉴定

单克隆C17细胞所分泌的抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体,用固相放射免疫、放射性双扩散及硝酸纤维膜印迹实验,鉴定为阳性,能与此抗原特异地结合。经Protein A-SepharoseCL-4B分离提纯此抗体,再用兔抗鼠标准血清鉴定,其亚型为IgM。将此单克隆抗体偶联到Sepharose 4B上,将炭疽抗原过柱,然后把洗脱液进行电泳分析,证明C17分泌的抗体特异地针对炭疽保护性抗原中分子量为19,000道尔顿的组分。