雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫精子蛋白组份的比较研究

对雌核发育银鲫和两性融合彩鲫精子蛋白组份进行了比较分析。通过分级抽提得到精子的不同组份精浆、精头的膜、鞭毛和脱膜精头等,然后经不同的凝胶电泳系统,比较分析了银鲫精子和其两性亲缘种彩鲫精子相应组份可溶性蛋白成份的差异。研究表明,经分级抽提的银鲫精子和彩鲫精子的各个组份都含有其特定的蛋白谱带。精浆蛋白在两种鱼之间和两种鱼的不同个体之间都存在一定差异。精头膜、鞭毛和脱膜精头的可溶性蛋白在同种鱼不同个体间高度一致,但在两种鱼之间表现出差异。两种鱼精头膜的可溶性蛋白在SDS－PAGE电泳图谱上基本一致,而在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上则具有各自的特征性谱带。鞭毛可溶性蛋白的SDS－PAGE分析在雌核发育银鲫中揭示出一条特异的蛋白带。脱膜精头的可溶性蛋白在SDS－PAGE电泳图谱上差异明显,存在几条特征性蛋白带,并经Acid-Urea PAGE系统分析,证实这些特征性蛋白为碱性蛋白。这些发现为进一步鉴定雌核发育银鲫雄鱼精子的特异性蛋白和揭示其分子机制打下了基础。     

雌核发育进行银鲫遗传育种新进展

近年来,人工诱导雌核发育作为一种崭新的技术在鱼类遗传育种研究中正日益引起人们的普遍关注。银鲫作为天然雌核发育的代表,以其独特的生殖方式和重要的经济价值,在理论研究和生产实践中均具有重要意义,本文概要介绍了银鲫的生殖方式,天然群体中优良品系的选育、异源精子对银鲫子代的生物学效应及其在生产实践中的应用－异育银鲫的选育,以及结合染色体倍性操作技术培育四倍体复合鲫的研究近况及发展前景。     

银鲫雌核发育的细胞学观察

在受精卵内,精子核呈凝缩状态,不形成雄性原核,没有看到两性原核融合。在刚产出的成熟卵子中没有看到极体,直到受精后10分钟(在水温19°—21℃)才有唯一的一个极体排出。在同一尾银鲫产出的同批卵子中,绝大多数具有成熟分裂中期的卵核,并在精子入卵后继续进行发育(雌核发育),接着排出唯一的一个极体;授精7分钟的少数卵子具有三极纺锤体状的核。根据现在的观察,双凤水库的银鲫是以雌核发育方式繁殖的种群。       

雌核发育银鲫卵抑制异源精子原核化的作用模式初探

雌核发育银鲫卵能抑制异源精子原核化,其个体发育完全由雌核控制。本实验通过去核、卵质转移和去除卵膜等手段,初步揭示了银鲫卵抑制异源精子原核化的作用,提出了双重控制的假说,即银鲫卵对异源精子具有初级控制和次级控制功能。初级控制可能是由于在精子进入卵子深部的通道上存在着某种特殊的抑制物的缘故,而次级控制的产生则可能是因为银鲫卵质中缺少某种两性融合生殖鱼类卵质所具有的促精子核化物质。     

雌核发育银鲫卵抑制异源精子原核化的作用模式初探

雌核发育银鲫卵能抑制异源精子原核化,其个体发育完全由雌核控制。本实验通过去核、卵质转移和去除卵膜等手段,初步揭示了银鲫卵抑制异源精子原核化的作用,提出了双重控制的假说,即银鲫卵对异源精子具有初级控制和次级控制功能。初级控制可能是由于在精子进入卵子深部的通道上存在着某种特殊的抑制物的缘故,而次级控制的产生则可能是因为银鲫卵质中缺少某种两性融合生殖鱼类卵质所具有的促精子核化物质。     

天然雌核发育银鲫卵子控制异源精核发育的受精学机制

作者对两性融合生殖鱼和雌核发育银鲫脱膜卵受精的精核发育进行了观察,并采用鱼类卵子无细胞系对以上两类卵质提取物体外诱导经Ｔｒｉｔｏｎ—Ｘ１００处理的精子及其发育进行了初步研究,结果表明在两性融合生殖型脱膜鱼卵中精核通过解凝最终形成原核,而在雌核发育的银鲫脱膜卵子中部分精核体积虽有一定程度的增加,但始终没有观察到原核的发育;在体外诱导实验中,经Ｔｒｉｔｏｎ—Ｘ１００处理的精子在两类卵质提取物中充分发育,都出现了类似体内原核的状态。该现象提示在银鲫卵质中存在有促使精核形成原核的因子,但在正常受精状态下,由于银鲫卵质促使精核核膜解体的功能的异常,使覆盖精子头部的核膜不能象在两性融合生殖受精卵子中进行崩解,精核进一步的原核发育受到抑制。另外,建立体外诱导系统的重要意义,在于它为研究雌核发育调控的分子学机制提供了一条有效途径。     

雌核发育银鲫和两性融合发育鱼（红鲫和彩鲫）卵壳结构及其组成的比较研究

作者以两性融合发育鱼（红鲫、彩鲫）为对照,对雌核发育银鲫卵壳的表面结构及其可溶性蛋白的组成进行了研究：（１）雌核发育银鲫卵壳表面比较平滑,没有明显的嵴和沟;（２）雌核发育银鲫卵壳可溶性蛋白的含量略高于两性融合发育鱼（红鲫、彩鲫）,并且在ＩＩ区段存在一条分子量为１０万Ｄａｌｔｏｎ的特异蛋白区带。并对银鲫卵壳结构及组成的特殊性与银鲫卵初级控制作用间的关系进行了初步探讨。     

银鲫种内的遗传标记及其在选种中的应用

用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分析了银鲫和异育银鲫的血清蛋白和肝脏酯酶,发现这两种鱼的血清蛋白和肝脏酯酶各具有4种不同的表型。由同一母本银鲫繁殖的子代——银鲫或异育银鲫,具有与母本相同的表型,只是在异育银鲫的肝脏酯酶谱型中另有一些无规律的变化,显然这是异源精子的作用所致。此外,这4种不同表型的鱼具有不同的生长能力,其差距最大可达50％．这些结果表明,天然雌核发育的银鲫种内含有若干个不同的雌核发育系,这对于开展银鲫的选育研究具有重要的实践意义。     

雌核发育银鲫和两性融合发育鱼（红鲫和彩鲫）卵壳结构及其组成的比…

作者以两性融合发育鱼为对照,对雌核发育银鲫卵壳的表面结构及其可溶性蛋白的组成进行了研究：（１）雌核发育银鲫卵壳表面比较平滑,没有明显的嵴和沟;（２）雌核发育银鲫卵壳可溶性蛋白的含量略高于两性融合发育鱼,并且在Ⅱ区段存在一条分子量为１０Ｄａｌｔｏｎ的特异蛋白区带。并对银鲫卵壳结构及组成的特殊性和银鲫卵初级控制作用间的关系进行了初步探讨。     

银鲫不同雌核发育系的生物学特性比较研究

银鲫不同雌核发育系间,以D系银鲫体型最高,其相对体高平均为47％,A系为44.4％,C系为43.7％,B系为41.7％。在生长速度方面以D系生长最快,其次为A系,这两个系的银鲫在含肉量与肌肉蛋白质含量上均无明显差异,但D系银鲫对饵料的利用效率明显高于A系,因此生产上养殖以D系银鲫为母本,红鲤为父本人工繁殖而成的高体型异育银鲫,可提高经济效益10—20％。银鲫4个雌核发育系的卵巢发育进程不同,D系卵母细胞在2月份有个迅速发育期,因而最早进入成熟产卵期。A系成熟产卵期略晚,C系成熟产卵期较迟。银鲫染色体数目存在系间差异,D系染色体数目为162,A系和C系为156。     

人工转性异育银鲫精子在两性融合型和雌核发育型卵质中的发育特征及其应用意义

通过甲基睾丸素诱导产生的雄性雌核发育银鲫产生的精子,能与两性融合生殖的鲤鱼卵受精结合,并能正常地转化为雄性原核。但在卵裂开始后,可观察到诸如核物质丢失、多极分裂等异常现象。从而进一步证实了作者过去提出的染色体不相容假设。转性异育银鲫精核在雌核发育银鲫卵中能初步地转化为雄性原核,但其发育程度低于雌核。根据双重控制假设,作者初步认为,转性异育银鲫精子在进入雌核发育型卵的过程中没有受到初级控制的作用。这或许是因为转性雄鱼的雌性遗传基础导致精子的某种特异性因子缺失的缘故。由于雌核发育银鲫卵质中次级控制的存在,使得解凝的精核不能完全转化为雄性原核。     

两性型天然雌核发育彭泽鲫染色体组型的研究

彭泽鲫是一种两性型天然雌核发育群体。染色体组型分析结果表明：雌、雄鱼的染色体数目均为１６６。它们的核型组成是：３２条中部着丝点染色体、４０条亚中部着丝点染色体、１８条亚端部着丝点染色体和７６条端部着丝点染色体。臂数（ＮＦ）为２３８。本研究结果与其它雌核发育类型的鲫鱼有明显的差别。     

银鲫与彩鲫卵母细胞cDNA文库构建及周期蛋白A1的cDNA克隆

分别取行天然雌核发育繁殖的银鲫和两性生殖的彩鲫的卵母细胞为材料,提取总RNA,分离mRNA,进而反转录合成cDNA并定向插入λgtll Sfi-Not克隆载体,经体外包装构建了银鲫与彩鲫卵母细胞的表达型cDNA文库。测试结果表明库容量分别达到3.1×106(银鲫)和1.6×106(彩鲫)。进一步人工合成Cyclin A1保守引物,采用PCR扩增文库的方法,克隆了银鲫(1616bp)与彩鲫(1626bp)的Cyclin A1全长cDNA。序列分析结果表明:两种鱼编码区长度均为1173bp,起始于一个包含在脊椎动物起始密码子ANNATG基元内ATG的单一开放读码框,编码391个氨基酸;5'-端非编码区长度也同为70bp,3-'端非编码区长度略有不同,银鲫为373bp,而彩鲫则为383bp;二者3'-端均带有AATAAA的Poly(A)加尾信号以及24bp(银鲫)和27bp(彩鲫)的Poly(A)尾巴。比较银鲫、彩鲫和金鱼与人、爪蟾Cyclin A1氨基酸序列同源性的结果表明,Cyclin A1在人、爪蟾与鱼类之间具有较高同源性;而在银鲫、彩鲫和金鱼之间,Cyclin A1仅在周期蛋白框外存在5个氨基酸的差异,且这些差异均是由个别碱基的变异造成的。       

银鲫精子在两性融合生殖鱼类卵质中的受精特征

红鲤(♀)×银鲫(♂)的杂种胚胎均不能成活。受精细胞学研究结果表明,雌核发育银鲫的精核在两性融合生殖的鲤鱼卵质中能转化为雄性原核,并和雌性原核融合成合子核。但在卵裂开始后,可观察到某些异常现象,如染色体丢失,多极纺锤体形成,以及第二次卵裂时受精卵的两分裂球的非同步性分裂等。我们初步认为,雌核发育银鲫的染色体和两性融合生殖的鱼类染色体之间存在某种不相容性,表现为彼此间的互相排斥。出现这种现象可能和银鲫染色体组的雌核发育遗传背景有关。     

雌核发育和两性融合发育鱼卵调控精核受精发育的生化特性研究

两性融合生殖的鱼卵受精后,精核能疏松、解凝,形成雄性原核：雌核发育银鲫卵子受精后,精核发育受到抑制,无法形成原核。采用显微注射去膜精核以及细胞学和电镜观察的方法,本文对两类鱼卵受精后精核早期发育的生化性质进行了初步探讨,并着重研究了雌核发育银鲫卵子控制精核发育的生化特征。实验结果显示,两性融合生殖鱼类卵质中,一定量的Ｃａ２＋的存在,二硫键的还原作用对于精核的发育显然是必要的;而在雌核发育银鲫卵中,Ｃａ２＋的功能和二硫键的还原作用与精核发育受到抑制之间并无直接联系。银鲫卵质中似乎显示出异常的磷酸酶脂解活性,导致磷酸化过程无法进行,使精核解凝受到阻碍。另外,两性融合生殖的鱼卵重质层中具有大量诱导精核原核化的有关因子,而银鲫卵质中则缺少该因子（或活性极低）。银鲫卵质中还可能缺乏某些与雄性原核的核膜重组装有关的大分子物质。     

异精效应在雌核发育彭泽鲫胚胎发育中的同工酶证据

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术 ,对同源和异源精子激发雌核发育彭泽鲫子代胚胎发育过程中四种同工酶 (EST ,LDH ,MDH ,ME)的表达情况进行了比较研究。结果表明同源和异源精子激发的胚胎在MDH和LDH同工酶表达上存在明显差异。MDH同工酶的差异主要表现为 :在孵出期 ,异源精子激发的胚胎比同源精子激发的胚胎多出两条谱带MDH4’和MDH5’ ;LDH同工酶的差异表现为 :在原肠中期至肌肉收缩期的五个时期中 ,异源精子激发的胚胎比同源精子激发的胚胎多出 4条谱带 (LDH9’— 12’)。这种差异说明同源与异源精子对子代胚胎发育过程中同工酶表达的影响不同 ,可能属于“异精生物学效应”的一种表现形式     

雌核发育银鲫和两性融合发育红鲤卵母细胞成熟的细胞学比较研究

对雌核发育银鲫和两性融合发育红鲤的卵母细胞成熟过程,进行了详细的细胞学比较研究。在银鲫卵母细胞成熟过程中,绝大部分卵母细胞的核物质,在胚泡破裂(GVBD)后的第一次成熟分裂时期,出现明显的不同于红鲤卵母细胞核的行为,其染色体逐渐清晰地分为三群,这三群染色体的发育既彼此独立又相互联系,最终形成一首尾相接的三极纺锤体。随后,三极纺锤体扭转、重叠、合并成为一个正常的中期纺锤体。但极少数银鲫卵母细胞也出现了类似于红鲤卵母细胞的成熟单星光,并进而发育成两极纺锤体,形态类似红鲤第一次成熟分裂中期纺锤体。在银鲫上述两类卵母细胞的成熟过程中均未观察到“第一极体”外排的现象。由此,我们确认,银鲫卵是通过第一次成熟分裂异常,卵核染色体不减数来维持染色体倍性的;并且,根据上述特殊现象,我们对银鲫卵子第一次成熟分裂异常的机制进行了初步分析。