HIV假病毒用于p24抗原检测试剂研制的研究

为了解决在研制新型HIV检测试剂盒时遇到的p24蛋白阳性对照物保存不便、阳性对照物稳定性不高以及蛋白结构和聚集形式与天然HIV病毒的p24存在差异等问题,通过将改造的HIV-1骨架质粒pNL43 EGFP R-E-和包膜蛋白质粒pGX-C共转染293T细胞后分离细胞培养液,获得具有单轮感染活性的HIV-1假病毒。通过对此假病毒颗粒的天然衣壳蛋白p24和市售HIV检测试剂盒中的p24蛋白阳性对照物的阳性反应有效性和保存稳定性的检测,证明了HIV-1假病毒p24蛋白具有更易保存、更稳定、更接近天然病毒p24蛋白的优点,适宜作为HIV检测试剂盒阳性对照物。     

HIV-1感染诱导丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Citron kinase上调机制研究

HIV-1感染可以改变宿主细胞的表达谱,上调和病毒转录复制翻译包装所需的宿主蛋白,使宿主变成更加适应病毒复制繁殖的环境。研究表明丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Citron kinase(citK)可以促进HIV-1病毒的包装释放,所以我们在本文中进一步探讨了HIV-1感染对Citron kinase在自然生理状态下的表达是否有调节作用。我们用含有荧光素酶报告基因的HIV-1假病毒感染外周血单个核细胞(PBMC)和HEK293T细胞系,检测Citron kinase表达的上调情况。此外,将Citron kinase的上游启动子克隆入含荧光素酶报告基因的载体上,检测HIV假病毒感染对Citron kinase启动子的影响。结果显示:HIV-1可以显著提高PBMC细胞中Citron kinase的表达量,而Citron kinase为HIV-1复制包装所需。在原代CD4+T细胞中过表达Citron kinase,HIV-1的复制可以提高2倍以上。沉默Citron kinase的表达,HIV-1病毒产生量显著降低。在HEK293T细胞系中,HIV-1假病毒感染可以使Citron kinase的mRNA的水平提高2.5倍,蛋白表达量提高2.7倍。我们通过将Citron kinase的启动子克隆到含有荧光素酶报告系统的载体上,感染HIV-1假病毒,发现荧光素酶的活性增加。这提示着HIV-1感染通过转录水平上调Citron kinase的表达,从而为病毒创造复制繁殖更有利的宿主环境。     

以HIV-1为骨架的慢病毒载体在其假病毒的转录本中保留其内含子不被剪切

通过在FUGW中克隆入各外源基因表达盒,如红系特异表达人β珠蛋白(HBG),或山羊乳腺特异表达人血清白蛋白(pBLG-ALB)等,研究以HIV-1为骨架的慢病毒载体FUGW在其假病毒的转录本中内含子的剪切情况.将慢病毒载体制备成假病毒后抽提其病毒RNA,通过逆转录和PCR验证其内含子剪切保留情况;同时,在相对应的慢病毒假病毒介导的转基因小鼠中也进行类似的PCR验证.在制备假病毒的转录过程中,其外源基因所携带的內含子在病毒所包含的基因组RNA中被部分保护不被剪切,且优先保护5′端的内含子.此现象正好与野生型HIV-1的保护顺序相反.     

利用假病毒技术研究抗HIV-1药物的作用机制

采用假病毒系统对5种具有抗HIV-1活性的天然化合物的作用机制进行研究, 建立了一种可在普通实验室进行抗HIV-1作用机理研究的实验平台。通过构建假病毒系统, 利用定量PCR实验分析感染细胞内病毒生命周期早期的特异性DNA产物, 发现5种化合物可通过不同的作用机制在早期抑制HIV-1复制。部分化合物表现出新的作用机制, 如LC-1、LC-2可抑制HIV-1的入核。通过分析药物对2种不同的逆转录病毒(HIV-1和MLV)的感染性, 发现LC-1可特异地阻断HIV-1的复制, 而对MLV无影响。同时为了检测药物是否也会在病毒的生命周期晚期有作用,利用直接转染前病毒质粒的方式进行了验证。利用以上方法, 初步确定了这几种药物的作用靶点, 构建了一个有效的抗HIV-1药物作用机理的研究平台。     

Scirpusin A和scirpusin B体外抗人类免疫缺陷病毒1型的作用

Scirpusin A和scirpusin B是从药用植物中发现的2种天然茋类二聚体,具有一定的抗病毒效应。本研究利用人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜和水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜的HIV假病毒及实验室适应株HIV-1ⅢB,在体外评价2种药物的抗病毒效果并初步探讨其作用机制。研究发现,scirpusin A和scirpusin B不仅能在体外有效抑制HIV假病毒感染TZM-bl细胞(一种HIV-1易感细胞),还能抑制实验室适应株HIV-1ⅢB。Scirpusin B的作用优于scirpusin A。对实验室适应株HIV-1ⅢB,scirpusin B的半数抑制浓度(IC50)为1.33μmol/L,scirpusin A的IC50为4.77μmol/L。此外,scirpusin A和scirpusin B还能抑制VSV-G包膜假病毒,提示其作用可能与病毒在细胞内的复制过程相关。Scirpusin A在病毒进入细胞后仍可发挥抑制作用,但具体机制尚待深入研究。     

野生冬虫夏草水提物体外抗HIV-1病毒作用的初步研究

研究分析野生冬虫夏草的水溶浸提物抑制人免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)的效果及其抗病毒作用的靶点。研究分别选取新鲜虫体、子座、全草、干燥虫体和子座5种不同组分,获得水溶性提取物,采用CCK-8实验检测水提物的细胞毒性;假病毒单周期感染实验评价水提物的体外抗病毒活性;体外检测水提物对逆转录酶活性的影响,应用表面等离子共振(SPR)技术检测水提物与HIV-1Vif蛋白的相互作用。这5种虫草水提物均具有显著的体外抗HIV-1病毒活性,抑制HIV-1逆转录酶的活性,新鲜子座水提物与Vif蛋白有良好的体外结合力。本实验明确了野生冬虫夏草的体外抗病毒活性,其作用机制可能与抑制逆转录酶活性和体外Vif蛋白有关,研究将为抗HIV-1病毒药物的研发提供实验基础。     

中东呼吸综合征冠状病毒假病毒系统的建立及其在中和抗体检测中的应用

目的:为了避免中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染与中和试验中操作活病毒带来的生物安全隐患,构建只具有一次感染能力而无复制能力的MERS假病毒,建立MERS假病毒系统,并应用于中和抗体检测。方法:构建含有MERS-CoV S基因的重组质粒pcDNA3.1-MERS-S,与缺失Env基因、含有萤光素酶报告基因的HIV-1骨架质粒pNL4-3.Luc.RE共转染293T细胞,收获含有假病毒的上清;通过Western印迹、细胞感染实验和血清中和试验,确定是否包装出MERS假病毒,及是否能有效应用于细胞感染与中和试验。结果:MERS假病毒pMERS-S培养上清经Western印迹鉴定出相对分子质量为25×103的HIV-1 P24蛋白和相对分子质量为180×103的MERS-CoV S蛋白;与阴性对照假病毒pEnv-相比,pMERS-S能有效感染MERS-CoV敏感细胞系Huh-7,在感染细胞中产生荧光信号,感染细胞的假病毒量与产生的荧光信号呈明显的量效关系;在MERS假病毒中和试验中,pMERS-S能被MERS-CoV中和抗体中和而失去感染力,反映抗体对MERS-CoV的中和活性。结论:建立了不依赖于BSL-3高等级生物安全条件的MERS假病毒系统,并有效应用于中和抗体检测,为MERS-CoV疫苗、药物评价及病毒致病机制研究提供了良好的技术支撑手段。     

HIV-1膜抗原部分位点的改造对假病毒形成及感染能力的影响

研究HIV-1膜抗原部分位点的改造对假病毒形成及病毒感染能力的影响。本实验采用环形诱变和DpnΙ筛选的方法对env进行定点突变。用获得的克隆和骨架质粒pSG3△env共转染293FT细胞,收获假病毒后用TZM-bl细胞进行单周期感染试验,检测特定位点改造对功能性假病毒形成能力的影响。改造之前样品S12-42-1的免疫印记的实验结果显示弥散的条带,蛋白大小约160kD,但单周期感染试验中其S/CO(样品信号值与临界值的比值)小于1,即不能形成假病毒。将该样品第457位氨基酸由丙氨酸变成天冬氨酸后,用突变体S12-42M进行单周感染试验,其S/CO值为6.65,表示突变体能够形成假病毒。结果表明HIV-1膜抗原部分位点的改变影响假病毒的形成或假病毒感染细胞的能力。     

利用报告基因比较悬浮细胞与贴壁细胞对HIV-1假病毒感染效率的差异

【目的】研究用人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)-1假病毒感染带有β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)报告基因和HIV受体CD4+CCR5+的Tzmbl细胞,分析悬浮状态与贴壁状态对HIV-1假病毒感染Tzmbl细胞的影响,为进一步进行HIV生物学研究与中和抗体实验室评价提供实验基础。【方法】通过将pNL43 R-E-与编码HIV膜蛋白的质粒共转染293T细胞,收集上清,获得HIV假病毒。该假病毒感染悬浮的和贴壁的Tzmbl细胞后可表达β-gal报告蛋白,通过X-gal染色和仪器分析可测定表达β-gal报告基因的细胞数与细胞感染率。【结果】HIV假病毒感染悬浮细胞的效率高于其对贴壁的Tzmbl细胞感染的效率,且细胞的感染率的改变与病毒的型相关。【结论】该研究结果可为进一步利用具有单轮感染活性的HIV假病毒进行生物研究和中和抗体实验提供研究方法。     

重组HIV-1 gp120 AAV2/1在小鼠和恒河猴体内的免疫原性

本文旨在研究表达HIV-1中国流行株gp120基因的重组腺相关病毒疫苗在小鼠和恒河猴体内的免疫原性。用rAAV2/1-gp120免疫BALB/c小鼠和恒河猴,分别用ELISA和HIV-1假病毒中和试验检测免疫动物血清中HIV-1特异性IgG抗体水平和中和抗体水平,用ELISPOT方法和体内杀伤实验检测HIV-1特异性细胞免疫应答水平。结果显示在小鼠体内用rAAV2/1-gp120仅免疫一次就能诱导较高水平的IgG抗体,IgG抗体至少能持续21周,但没有检测到中和抗体。rAAV2/1-gp120在小鼠体内诱导微弱水平的HIV-1特异性细胞免疫应答。rAAV2/1-gp120在恒河猴体内诱导的HIV-1特异性细胞和抗体反应均很弱,且检测不到中和抗体。提示rAAV2/1载体在诱导抗体反应方面具有特殊优势,但若希望诱导HIV-1特异性中和抗体,则需要改造env基因以提高其免疫原性。     

整合HA蛋白的HIV假病毒展示禽流感病毒感染宿主细胞机制

通过将高致病性禽流感病毒HA蛋白整合到HIV颗粒,包装成表达HA蛋白的假病毒粒子（命名为HIV/H5-HA）,并对所包装的假病毒的生物学功能进行了研究.通过RT PCR获得了H5N1亚型禽流感病毒完整的血凝素基因(HA)并克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,通过与假病毒构建体系的2种质粒pCMV△8.2和pHR′-CMVLacZ共转染293T细胞,包装成假病毒颗粒.利用LacZ染色和HA假病毒颗粒感染MDCK等6种细胞株并对标记基因LacZ进行检测.结果表明,HIV/H5-HA与天然的禽流感病毒相似,具有广泛的细胞嗜性; Western 印迹和FACS检测结果,和HA假病毒颗粒的电镜照片确认了HA基因在假病毒颗粒表面得到了表达;HIV/H5-HA能够凝集鸡红细胞,并且pH值依赖性测定表明,HA假病毒需要低pH值才能实现正确的入侵宿主细胞.本研究结果显示：禽流感病毒H5N1亚型的HA基因得到了有效的包装,并且所包装的假病毒颗粒能够表达具有高度生物活性的HA蛋白.同时,假病毒模型的建立为进一步研究禽流感病毒与宿主之间的免疫应答提供了一种新的途径.     

树免疫细胞体外感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒的实验研究

至今可以感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的动物只有黑猩猩和长臂猿,这严重阻碍了HIV-1的疫苗研究和治疗研究。因此,寻找新的可以感染HIV-1的动物模型成为十分迫切的课题。已知树鼩对许多重要的医学病毒易感,为了探讨树鼩是否可以感染HIV-1,利用不同辅助受体的5种HIV-1病毒株,体外感染云南野生成年树鼩的淋巴细胞和单核/巨噬细胞;同时还用这些病毒感染人外周血淋巴细胞或单核细胞。然后用RT-PCR、PCR和流式细胞术分别进行检测。用RT-PCR方法未检测到感染上清中有病毒粒子的存在,用PCR法未能发现树鼩的这些免疫细胞中有前病毒DNA,用流式细胞术也未能在这些感染HIV-1的树鼩细胞的表面检测到特异抗原;而感染HIV-1的人免疫细胞均为阳性结果。实验结果表明树鼩的这些免疫细胞在体外未能感染上HIV-1,可能的原因是树鼩的这些免疫细胞的HIV-1受体(CD4)和辅助受体(CCR5或CXCR4)与人的免疫细胞差别较大。     

树qu免疫细胞体外感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒的实验研究

至今可以感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的动物只有黑猩猩和长臂猿，这严重阻碍了HIV-1的疫苗研究和治疗研究。因此，寻找新的可以感染HIV-1的动物模型成为十分迫切的课题。已知树qu对许多重要的医学病毒易感，为了探讨树qu是否可以感染HIV-1，利用不同辅助受体的5种HIV-1病毒株，体外感染云南野生成年树qu的淋巴细胞和单核/巨噬细胞；同时还用这些病毒感染人外周血淋巴细胞或单核细胞。然后用RT-PCR、PCR和流式细胞术分别进行检测。用RT-PCR方法未检测到感染上清中有病毒粒子的存在，用PCR法未能发现树qu的这些免疫细胞中有前病毒DNA，用流式细胞术也未能在这些感染HIV-1的树qu细胞的表面检测到特异抗原；而感染HIV-1的人免疫细胞均为阳性结果。实验结果表明树qu的这些免疫细胞在体外未能感染上HIV-1，可能的原因是树qu的这些免疫细胞的HIV-1受体(CD4)和辅助受体(CCR5或CXCR4)与人的免疫细胞差别较大。     

新型冠状病毒假病毒的制备及血浆中和抗体检测

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引发新型冠状病毒肺炎（COVID-19）全球大流行。由于SARS-CoV-2生物安全管理的要求,高效制备获得高滴度的新型冠状病毒假病毒对基于S蛋白研发疫苗、中和抗体、病毒入侵抑制剂药物以及人群血清学调查等十分重要。本研究基于慢病毒系统,对制备新型冠状病毒假病毒过程中的重要参数进行优化,用Western Blot检测假病毒S蛋白和p24蛋白的表达及假病毒包装情况,用荧光素酶报告系统检测假病毒感染入侵效率。利用制备好的假病毒对恢复期血浆的中和抗体水平进行检测。结果显示骨架质粒与野生型Spike质粒为2∶1比例,在转染后48h收集上清为SARS-CoV-2野生型假病毒包装的最佳条件。与野生型相比,恢复期血浆对四种突变株的中和抗体滴度均降低,对B.1.351株中和能力最弱,B.1.617.2株其次,重型患者恢复期血浆对野生型和突变株的中和抗体滴度高于轻型与普通型患者。本研究优化了新型冠状病毒假病毒包装的实验室条件,评估了COVID-19患者恢复期血浆对野生型及四种突变株的中和抗体水平,提示未来对突变株的免疫逃逸进一步加强监测的重要性。     

人乳头瘤病毒16型假病毒中和实验的建立和初步应用

探讨了应用多质粒磷酸钙共转染方法在293FT细胞中生产HPV16(human papillomavirus type 16)假病毒。蛋白印迹检测显示在转染后细胞的裂解上清中具有很好的L1蛋白活性,通过透射电镜可观察到形态与天然病毒粒子相似的假病毒颗粒。对293FT细胞的感染实验显示,该假病毒可有效将EGFP报告质粒导入靶细胞中进行表达,经测定其滴度约为2×107TU/mL。通过与4株HPV16对照单抗的中和实验证明该假病毒可有效应用于中和实验。应用该方法从18株抗HPV16L1的单克隆抗体中鉴定获得了2株中和单抗3D10、PD1。所建立的HPV16假病毒生产和中和实验方法具有快速高效、低成本和易于检测的优点,适于进行较大规模应用,为快速准确鉴定HPV16中和单抗和候选疫苗的免疫保护效果提供了有效手段。     

基于深圳男男同性性行为人群的HIV-1广谱中和抗体筛选分析

目的:筛选基于深圳本地男男同性性行为者(Men who have sex with men,MSM)人群队列中HIV-1流行毒株的广谱中和抗体(Broadly neutralizing antibodies,bn Abs),为下一步机制和应用研究奠定基础。方法:建立小型MSM队列,按计划分别定期随访、留样,测序分析人群中HIV-1病毒流行亚型。选取将骨架质粒与系列标准HIV-1 env质粒12款,分别共转染293细胞制备单次感染能力假病毒。建立TZM-bl细胞实验测定并计算中和活性(ID50Titers)技术平台,用于选定病毒亚型样品的筛选。最后取所获具有一定广谱中和抗性的代表性血样,通过抗体竞争实验初步分析其结合位点。结果:近年来,深圳MSM的HIV-1流行亚型分布中,CRF07_BC(43.4%)和CRF55_01B(15.4%)占比快速增长。选择来自该人群队列CRF07_BC感染者34人88份血样进行广谱中和抗性检测,筛选出具有一定广谱中和抗性的血样10份(ID50 Titer≧25),其中2例显示了较佳中和宽度,可作用于全部12种假病毒中的7种(58.3%)。初步分析其结合机制均非靶向gp120。结论:本研究成功建立小型MSM队列和TZM-bl检测分析技术并应用于实践,初步筛选结果提示部分具有中和活性的患者血清内存在bn Abs。     

SARS-CoV-2入胞活细胞示踪平台的建立

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）由于其高传染性已造成全球大流行。目前关于SARS-CoV-2依赖内吞途径进入细胞的研究偏向于药物抑制实验或固定样品的蛋白共定位实验,而对于其入胞时与细胞内吞结构相互作用的动力学机制研究较少。本研究首先基于慢病毒系统包装出可在生物安全二级实验室（BSL-2）进行操作的SARS-CoV-2假病毒,之后利用膜染料对假病毒的囊膜进行荧光标记,并进行鉴定。通过免疫荧光方法观察到假病毒与网格蛋白包被的内吞结构共定位,进一步在网格蛋白敲低的Caco-2细胞系上进行假病毒感染,检测到荧光素酶活性显著下降,这些结果确定了网格蛋白介导的内吞作用参与假病毒感染。最后基于单病毒示踪技术,通过共聚焦显微镜对假病毒入胞过程进行活细胞实时拍摄,选取两个具有代表性的假病毒粒子依赖网格途径入胞的典型视野,并对假病毒动力学进行分析。本研究成功建立了SARS-CoV-2假病毒入胞活细胞示踪平台,可应用于研究单个假病毒粒子入胞过程动力学机制。该平台对SARS-CoV-2入胞机制的研究具有重大意义。     

一种非洲猪瘟病毒假病毒细胞感染模型的建立及应用

目前国内外大多数针对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的研究须在生物安全三级实验室(biosafety level 3 laboratories, BSL-3 labs)中进行,因此针对该病毒的感染过程、中和抗体逃逸机制、药物研发等研究受到了一定限制。鉴于此,本研究选择ASFV包膜蛋白中与其进入细胞紧密相关的蛋白p12、CD2v、p30、p54和pE248R,构建表达这5种包膜蛋白的真核表达质粒,利用水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)假病毒包装体系,制备多种ASFV假病毒。以荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)检测假病毒感染水平;选择1个包膜蛋白为代表,使用蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测其在假病毒中的表达情况;采用芫花素检测其对所建立的ASFV假病毒(p30-pE248R-ASFV-PsV)的抑制活性。结果显示,VSV包装体系以及p30、pE248R包膜蛋白质粒的组合制备方法所包装出的假病毒具有较优的感染活性,适合用于建立细胞感染模型。ASFV的包膜蛋白pE248R被有效整合到VSV-ΔG rLuc颗粒中,并包装出ASFV假病毒。芫花素可浓度依赖性地抑制ASFV假病毒感染Vero细胞,其半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)为4.05±0.88 μmol/L。本研究通过建立基于ASFV假病毒的细胞感染模型,筛选获得了1种可感染已报道的一些ASFV敏感细胞的假病毒。该假病毒无复制性,可在生物安全级别较低的实验室中进行操作,并且带有海肾荧光素酶报告基因,有望用于ASFV入侵抑制剂的高通量筛选及中和活性的初步评价,为研发抗ASFV药物提供了一个安全、方便的研究模型。     

基于流式细胞技术SARS-CoV-2假病毒中和试验方法的建立

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)是新型冠状病毒肺炎感染（Coronavirus disease 2019, COVID-19）的致病病毒。面对此类高传播风险及高致病性病毒，常采用复制缺陷型假病毒替代活病毒用于疫苗及药物的抗病毒活性评估。本研究旨在建立了一种基于流式细胞技术（Flow cytometry, FCM）的高通量中和试验方法。使用HIV-1慢病毒骨架蛋白包装系统，将psPAX2、pLVXeGFP、SARS-CoV-2 S三质粒共转染HEK293T细胞，包装一种带增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein, eGFP）的假病毒。通过优化S蛋白密码子序列、采用S蛋白C-端氨基酸（Amino acids, AA）截短和包装时间的优化，确定了假病毒包装最适条件。包装假病毒的滴定采用293T-hACE2细胞作为感染靶细胞，经流式细胞仪测定eGFP荧光细胞比率即为感染假病毒细胞比率。采用包装的野生型（Wild type, WT...     

分子生物学方法在HIV-1病毒检测中的应用

人类免疫缺陷病毒（HIV）是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的病原体。根据血清学反应和核酸序列测定将HIV分为HIV-1和HIV-2两型,本研究就HIV-1基因的分子特征、HIV基因分型分类、HIV基因分型常用的方法、HIV-1病毒载量的分子生物学检测方法等方面进行讨论。