新型冠状病毒荧光定量PCR的Ct值与病毒分离的结果分析

为探究利用SARS-CoV-2的ORF1ab基因和N基因作为靶标进行荧光定量检测的Ct值与SARS-CoV-2病毒分离阳性率之间的关系。本研究对广州入境的新型冠状病毒肺炎输入病例临床样本进行荧光定量PCR检测和用Vero细胞进行病毒分离,统计病毒分离率与荧光定量PCR检测Ct值之间的关系,再通过logistics回归模型用Ct值来预测病毒分离率;同时对收集到的临床样本进行三代测序及进化树的构建。结果显示,在160例新型冠状病毒肺炎输入病例临床样本中,分离到74株新型冠状病毒,分离阳性率为46.25%,分离到包括20株Alpha、9株Beta、2株Delta等VOC毒株和2株Epsilon、1株Eta等VOI毒株,其他变异株42株;病例样本荧光定量PCR检测ORF1ab基因Ct值为16.12～39.00,N基因的Ct值为17.82～39.41;病毒分离率与样本荧光定量PCR检测的ORF1ab基因和N基因的Ct值均呈负相关,在Ct值>31时,分离率仅9.10%(6/66),而当Ct值<23.1时,病毒分离阳性率可超过95%,分离到新冠病毒的病例样本荧光定量PCR检测的ORF1a...     

浙江省SARS冠状病毒分离与系统进化树分析

从浙江省3例SARS患者中收集含漱液标本,经处理后接种Vero、RD、VeroE6和Hep-2细胞进行病毒分离,培养3d后在Vero和RD细胞中可观察到细胞病变.从细胞培养上清中提取病毒核酸,用SARS冠状病毒特异性引物进行RT-PCR,并经测序证实从3份临床样本中分离到2株SARS冠状病毒株.对其中1株病毒的基因组进行了全序列测定并作系统进化树分析显示浙江省SARS冠状病毒株与新加坡2774株和台湾TW1株最为接近.     

浙江省SARS冠状病毒分离与系统进化树分析

从浙江省3例SARS患者中收集含漱液标本,经处理后接种Vero、RD、VeroE6和Hep-2细胞进行病毒分离,培养3d后在Vero和RD细胞中可观察到细胞病变。从细胞培养上清中提取病毒核酸,用SARS冠状病毒特异性引物进行RT-PCR,并经测序证实从3份临床样本中分离到2株SARS冠状病毒株。对其中1株病毒的基因组进行了全序列测定并作系统进化树分析显示浙汀省SARS冠状病毒株与新加坡2774株和台湾TW1株最为接近。     

新型冠状病毒南非B.1.351变异株的分离与分子特征分析

2020年12月广州市第八人民医院收治了 1例南非输入性COVID-19病例,经检测为SARS-CoV-2核酸阳性的实验室确诊病例.本研究使用Vero-E6细胞,对该病例咽拭子样本进行病毒分离,逐日观察,咽拭子接种的细胞管3d开始出现细胞融合样细胞病变(Cytopathic effect,CPE),5d出现完全CPE后再进行第二代接种,2d出现病变,提取核酸进行鉴定,为SARS-CoV-2阳性.第2代复传的SARS-CoV-2病毒株TCID50测定结果为5.5log TCID50/0.1mL～5.8log TCID50/0.1mL.对分离毒株经采用三代测序成功获得全基因组序列,进化分析结果为与参考毒株Wuhan/Hu-1/2019相比共发生30个碱基的变异、18个氨基酸的突变和18个碱基的缺失,比对结果显示分离到的毒株为SARS-CoV-2南非B.1.351变异株.     

深圳市一株境外输入新型冠状病毒C.1.2变异株的分子特征分析

为了了解境外输入的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）变异株的分子特征,本研究对2021年6月深圳市一株从南非输入的SARS-CoV-2毒株进行了全基因组测序和序列分析。Illumina测序技术获得的SARS-CoV-2毒株基因组长度为29 567nt。根据"Pango lineages"分型法,本研究测定的毒株属于C.1.2系,该谱系属世界卫生组织定义的监测变异株（Variants Under Monitoring,VUM）成员之一。与参考株Wuhan-Hu-1(NC＿045512.2)比较,本研究C.1.2系毒株共出现了58个核苷酸变异位点,其中56个变异位点位于编码区。氨基酸变异位点共有33个,氨基酸变异位点分布于6个开放阅读框,变异数由多到少依次为：S蛋白区12个,ORFlab蛋白区9个,ORF3a蛋白区2个,M区2个,ORF8区2个,E区1个。本研究测定的SARS-CoV-2毒株属我国大陆首例境外输入的C.1.2变异株。开展境外输入的SARS-CoV-2毒株基于基因组测序的分子监测,对防控由境外输入的SARS-CoV-2变异株引起本地新型冠状病毒肺炎（COVID-19）暴发与...     

广东省首例新型冠状病毒的分离与鉴定

2020年1月,广东省陆续从湖北省武汉市输入多例疑似新冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的病例,经检测为SARS-CoV-2核酸阳性的实验室确诊病例。为进一步了解SARS-CoV-2毒力,满足药物研发和疫情防控等需求,并建立SARS-CoV-2分离方法为后续研究打下基础,本研究使用Vero-E6细胞,选择一例经Real-time RT-PCR鉴定为SARS-CoV-2阳性的肺泡灌洗液进行接种,逐日观察,肺泡灌洗液接种的细胞管4d出现疑似细胞病变(Cytopathic effect,CPE),再进行第二代接种2d出现病变,提取核酸进行鉴定,为SARS-CoV-2阳性。经二代测序成功获得全基因组序列,进化分析结果显示本次分离的毒株为SARS-CoV-2。     

丽水市早期新冠肺炎无症状感染者SARS-CoV-2全基因组序列分析

对1例新型冠状病毒肺炎疫情流行早期的无症状感染者临床标本进行SARS-CoV-2实验室鉴定和全基因组测定,在分子水平了解新型病毒的基因特点和变异情况,追溯病毒潜在来源.实时荧光定量PCR扩增丽水市庆元县首例确诊患者密切接触者的痰液标本SARS-CoV-2核酸,阳性RNA逆转录为cDNA构建文库后进行基于NGS的宏基因组深度测序,生物学软件分析处理数据.该密接无任何症状及体征,痰液标本SARS-CoV-2核酸阳性.测序数据包含有足够的病毒序列,组装成功后hCoV-19/Lishui/LS556/2020长29 887bp,G+C含量37.99％,在ORF1ab和N区域发现4个SNP,对应1个错义突变和3个同义突变.LS556与SARS-CoV-2参考序列核苷酸/氨基酸同源性在99.2％/97.4％以上,不同序列之间存在4～17个核苷酸差异,与蝙蝠病毒RaTG13核苷酸差异仅3.7％,存在1141个SNP,与穿山甲病毒Guangdong/1相似性90.9％.LS556属于β冠状病毒Lineage B谱系,与LS003和ZJU-06共享完全相同的病毒,与蝙蝠/穿山甲冠状病毒进化上最相关.结合流行病学、核酸诊断、病毒溯源判定其为无症状感染者.LS556组成和结构符合SARS-CoV-2典型的基因特征,为高覆盖率序列,在流行早期与其他SARS-CoV-2基因组具有高度的同一性,突变率保持在较低水平,多数导致氨基酸位点保守置换.     

新型冠状病毒上海株(nCoV-SH01)的分离和鉴定

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)疫情对人类生命健康构成极大威胁。病毒的分离是构建新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)细胞感染模型和动物感染模型的基础。本研究利用冠状病毒易感的Vero E6细胞,从1例上海感染者的咽拭子中分离到一株2019-nCoV,命名为nCoV-SH01。对该毒株全基因组采用一代Sanger和二代Illumina法测序,发现该毒株与GenBank MN908947的同源性＞99.99%。免疫荧光检测显示,该毒株与COVID-19康复者的血清呈阳性反应。当nCoV-SH01感染Vero E6细胞后,导致典型的合胞体病变,细胞病变效应明显且进展迅速,提示nCoV-SH01可用于进一步建立2019-nCoV的细胞感染和动物感染模型,为开展致病性研究以及抗病毒药物和疫苗研发奠定了基础。     

新型冠状病毒实验室检测方法研究进展

世界范围内流行的SARS-CoV-2已造成大批新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者,严重威胁着全人类生命健康.新型冠状病毒肺炎尚没有特效药,也没有疫苗,实验室确诊新型冠状病毒肺炎,隔离传染源,尽早治愈患者对整个疫情防控起着非常重要的作用.目前实验室检测方法有病毒分离培养、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术、CRISPR/Cas技术、测序技术、基因芯片和抗原抗体检测.本文就上述几种方法做一综述,为确诊COVID-19提供参考.     

喀什边境口岸陆运卡车及集装箱污染的新冠病毒基因特征分析

新疆维吾尔自治区喀什地区作为我国与中亚和欧洲的重要陆路货运口岸,来往货物运输频繁,引入新型冠状病毒(SARS-CoV-2)风险大,对我国新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情防控造成压力.2020年11月我国新疆维吾尔自治区喀什地区发生输入SARS-CoV-2导致的本土聚集性COVID-19疫情.为明确货物运输载体携带SARS-CoV-2的基因特征以及边境快速物流系统作为SARS-CoV-2传播载体的可能性,本研究对2020年11月6日-2020年11月10日期间在喀什边境口岸货运卡车及运输的集装箱采集的35份SARS-CoV-2核酸阳性样本进行SARS-CoV-2全基因组序列测定和比对分析.结果 显示,35份样本ORFlab基因Ct值的中位数(最小值～最大值)为37.64(28.91～39.81),N基因Ct值的中位数(最小值～最大值)为36.50(26.35～39.30),Reads数匹配率的中位数(最小值～最大值)为51.95％(0.86％～99.31％),病毒载量较低;35份样本中基因组覆盖度达到70％以上的共计18份.基于Pango命名法,18条SARS-CoV-2基因组序列分别属于B.1、B.1.1、B.1.9、B.1.1.220、B.1.153和B.1.465共6个不同的基因型,其中3个基因型(B.1、B.1.1和B.1.153)在喀什边境接壤或邻近的四个国家同期采集的病例样本中也有发现.核苷酸突变位点和系统进化树分析显示,同一个地点采集的样本病毒基因组相似程度高;18条序列中的4条与喀什COVID-19疫情毒株代表序列处在同一个进化分支;其中1条序列与喀什COVID-19疫情毒株基因组存在1个或2个核苷酸突变位点差异,高度同源.本研究证实喀什COVID-19疫情期间边境货运卡车和集装箱存在境外多种基因型病毒的污染,其中存在喀什COVID-19疫情毒株的祖父代病毒,高度提示边境快速物流系统卡车及集装箱作为载体携带SARS-CoV-2病毒入境造成了本土疫情,这些数据为我国边境口岸地区的新冠防控策略制定及后续疫情溯源提供了关键的参考依据.     

甘肃口岸输入性新型冠状病毒全基因组测序和基因特征分析

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）作为一种单链RNA病毒，可引起人类严重的呼吸道综合征。本研究对2020年3月至2021年1月甘肃口岸入境人员中经RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸阳性的8份样本进行全基因组测序，并用MEGA11软件以邻接法构建系统发育树，以揭示甘肃口岸输入性SARS-CoV-2基因组特征和遗传进化关系。全基因组测序获得8条长度为29 252bp～29 833bp的SARS-CoV-2基因组序列，基因组覆盖度97.82%～99.77%。与武汉参考株（GISAID号：EPI＿ISL＿402119）相比，共检测到64个错义突变，31个同义突变，3个移码突变和5个非编码等位基因。按照Pangolin分型法，8株输入性毒株属于B.1和B.4谱系。系统发育树分析显示来自伊朗的2例毒株聚集于同一进化支，其他6例毒株分布于不同的进化支中，与目前全球流行的关注变异株和武汉参考株均位于不同进化分支。值得注意的是，一株2020年10月份从俄罗斯输入的B.1.1.523谱系毒株出现时间早于文献报道的2021年3月份，说明该谱系可能在2020年10月或更早就已在俄罗斯流行。     

大连市一起由境外输入引起的本土新冠肺炎关联病例的病毒基因组特征分析

了解引起大连市本土新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）流行株的基因组特征和变异情况,追溯SARS-CoV-2来源。

选取2022年8月20日—9月14日97例由境外输入引起的COVID-19关联病例的样本。采用SARS-CoV-2全基因组靶向扩增结合高通量测序技术（Ion Torrent测序平台）进行全基因组测序。分析SARS-CoV-2的基因组特征、核苷酸和氨基酸突变位点和基因分型。构建进化树,结合病例的流行病学资料,溯源SARS-CoV-2流行株。

共获得97例SARS-CoV-2全基因组序列,基因组全长29 735～29 741 bp,平均测序深度1 457×～50 485×,测序覆盖率范围95.9%～100.0%。同NCBI数据库中的SARS-CoV-2参考基因组（NC_045512）序列相比,97例SARS-CoV-2全基因组序列共享75个核苷酸突变位点,22例在此基础上新增1～3个突变位点。75个共享突变位点类型包括：4个非编码区和7个基因编码区,其中基因编码区的70个突变位点,来自基因ORF1ab、S、ORF3a、E、M、ORF8、N。共享的氨基酸突变类型包括15个同义突变和51个非同义突变。97例SARS-CoV-2全基因组序列,Pangolin分型为BA.5.2.1.21 （BF.21进化分支）型,Nextstrain分型为22B型,GISAID分型为GRA型。经与大连SARS-CoV-2基因库的序列比对,与8月9日境外输入的编号20220809-1和20220809-2病例共享75个核苷酸突变位点,高度同源。进化分析结果显示,此次SARS-CoV-2流行株与同时期日本大阪SARS-CoV-2流行株共同处于BF.21进化分支上,与病例20220809-1和20220809-2流行病学调查中的来源国日本一致。

此次SARS-CoV-2流行株属于Omicron变异株（BF.21进化分支）,来源于日本。

     

安徽省境外输入新冠病毒Delta变异株的首次发现与鉴定

为鉴定此次安徽省境外输入新型冠状病毒的分子特征,本研究对两例病例进行了高通量测序和基因组序列分析。高通量测序获得两株病毒的基因组全长分别为29 858nt和29 858nt,利用NextStrain和2019新型冠状病毒信息库（https：//ngdc.cncb.ac.cn/ncov/）在线分析对两例毒株全基因组核苷酸和氨基酸变异位点进行分析。将全基因组序列上传到（https：//pangolin.cog-uk.io）和（https：//clades.nextstrain.org/）网站,通过在线网站分析结果显示,两株病毒均为B.1.617.2变异株（Delta）,NextStrain进化分析为21A。两株毒株分别发现了49和48个核苷酸突变位点,氨基酸的变异位点分别有35和34个,其中存在相同的7个同义突变。两株病毒主要在ORF7a基因上C27527T(P45L)的突变不同。这是安徽省首次发现境外输入的B.1.617.2变异株（Delta株）此变异株存在引发本地的流行和爆发的风险,需要严密持续的对境外输入病例进行流行病学调查和病毒基因分子特征分析。     

浙江地区鼬獾和犬源狂犬病病毒分离株全基因组测序与分析

测定浙江地区狂犬病病毒分离株(鼬獾和犬)全基因组序列,从分子水平对病毒进行遗传变异特征分析,了解狂犬病病毒在浙江的流行和变异情况以及目前浙江流行株的遗传学背景,以丰富中国狂犬病病毒街毒流行株的全基因组信息。脑内接种1~2日乳鼠分离狂犬病病毒,RT-PCR反应测定浙江地区狂犬病病毒分离株全基因组核苷酸序列,并进行编码蛋白和序列相似性比较及种系发生分析。测序获得狂犬病病毒浙江淳安鼬獾分离株F02、F04和松阳犬分离株D01、D02全基因组核苷酸序列信息:基因组全长11 923和11 925 nts,前导序列Leader长58nts,5个ORF为:NP(1 353 nts);PP(894 nts);MP(609 nts);GP(1 575 nts);LP(6 386 nts),N-P-M-G间隔序列长2、5、5 nts;G-L基因间的伪基因Ψ长423 nts;Trailer尾长70 nts。核酸BLAST及多重序列比对分析显示浙江地区4个狂犬病病毒分离株的全基因组序列的组成和结构符合弹状病毒科狂犬病病毒属的特征;中国毒株之间特别是浙江同种动物狂犬病病毒之间各个基因区域核苷酸与氨基酸序列相似性最高,浙江病毒全基因组序列编码蛋白氨基酸序列相似性高于核苷酸序列相似性,说明蛋白质编码基因的核苷酸变异大多属于同义突变;浙江病毒负链RNA基因组5个基因编码氨基酸的长度没有变异,5个编码蛋白仅表现较少的序列变化;浙江病毒与本研究选择的代表性引用街毒株或者来自街毒的减毒株的变异位点和变异类型相似,多重序列相似性的比较和种系发生分析显示所分离的狂犬病病毒浙江街毒株均属于基因1型,具有较独特的中国地域性特点,故本研究中的浙江地区分离株极有可能是自然界中固有的街毒株。     

龙岩市一起暴发性脑炎疫情分离的埃可病毒6型基因特征分析

对2010年福建省龙岩市长汀县埃可病毒6型(ECHO6)肠道病毒引起的暴发性脑炎,进行病原学分析,为该病的防控提供有价值的信息。对病例脑脊液标本进行荧光RT-PCR、病毒分离(RD细胞)、中和鉴定进行病原确认,再经PCR法对其中4株毒株进行VP1片段或全基因组核苷酸序列测定,用DNAStar软件中的MegAlign等软件进行同源性分析,Mega 4.0软件进行进化树分析。经病原学检测方法确认为ECHO6型肠道病毒,VP1片段核苷酸序列分析显示为C2亚型。全基因组序列共7 407个核苷酸,与其他ECHO病毒和CVB(Coxsackie virus B)病毒基因组构成相似,同源性为78.5%~87.3%。此次暴发性脑炎是由肠道病毒ECHO6C2亚型引起,病毒株全基因组序列长度与标准株(U16283)相近,同源性达80.4%。     

北京市朝阳区1例输入性SARS-CoV-2全基因组序列分析

北京市朝阳区在连续40d没有新增本土COVID-19确诊病例的情况下,出现了1例潜伏期超过14d的境外回国COVID-19确诊病例。为分析北京市朝阳区1例COVID-19患者是否为输入病例,进行了全基因组序列测定和遗传特性分析,本研究采用高通量测序技术配合Ion Torrent系列仪器和试剂对患者咽拭子中的SARS-CoV-2进行测序,同时应用对应插件或软件分析其全基因组同源性和变异情况。结果显示,该病例标本中测得1株SARS-CoV-2毒株,共29 876 bp,BLAST结果显示与其他国家和地区分离株的相似性高于与中国分离株的相似性。系统进化树中该毒株与2003年感染人的SARS冠状病毒和蝙蝠中分离的SARS冠状病毒明显不同,分处不同进化分支;该毒株与中国分离株分处不同的簇,而和美国分离株聚集在一簇。另外,突变分析显示存在3个改变氨基酸性质的非同义突变。本研究提示,该病例为美国输入的SARS-CoV-2感染病例,应注意境外输入性COVID-19的传播,并适当延长隔离观察期限;该毒株在患者的1例关联病例中发生了部分核苷酸突变,对SARS-CoV-2的致病力等的影响有待进一步研究。     

输入病毒导致的十起本土疫情首例病例新冠病毒基因特征分析

2020年4月中国阻断湖北省武汉市新冠肺炎疫情传播后,中国国内报道了多起由境外输入导致的本土聚集性新冠肺炎疫情。为分析引起聚集性疫情的输入性新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的基因组特征,本研究对2020年4-11月份十起输入相关本土疫情首例病例的SARS-CoV-2全基因组基因特征进行分析,系统阐述了相关SARS-CoV-2的全基因组和氨基酸变异特征。结果显示,与武汉参考株相比,十起本土聚集性疫情首例病例的SARS-CoV-2核苷酸突变中位数为10个(8个-26个),氨基酸突变的中位数为6个(4个-16个),且刺突(spike,S)蛋白只有D614G一个氨基酸发生突变。除分支位点外,10条SARS-CoV-2全基因组序列的65个核苷酸突变位点以及35个氨基酸突变仅出现1-2次,呈现随机性。全基因组分析表明,这十起本土疫情的首例病例基因组按照中国分型法可划分为4个型,按照Pangolin分型法可划分为7个型,与我国2020年1-3月份武汉流行的毒株属于不同基因型,不是本土SARS-CoV-2的持续传播。与2020年9-12月英国和南非变异株属于不同基因型,无相关性。本文系统分析了2020年由输入病毒导致的十起本土疫情首例病例的SARS-CoV-2核苷酸与氨基酸变异特征,为我国新冠防控策略的制定以及后续新冠疫情的溯源提供了参考依据。     

家养野猪源猪圆环病毒2型安徽株的分离鉴定及其全基因组序列分析

目的对安徽省临诊疑似PMW S家养野猪病例进行猪圆环病毒2型(PCV2)分离鉴定,并对分离株的全基因组进行克隆与序列分析。方法应用PK-15细胞进行PCV2的分离与增殖,根据PCR、IFA、电镜技术进行PCV2分离株的鉴定,克隆分离株的全基因组,并对序列进行分析。结果获得1株来自安徽家养野猪源PCV2分离株,命名为YZ0901。该毒株全基因组长为1 767 bp,属于PCV2b基因型。与GenBank已发表的国内外参考毒株的同源性介于93.9%~99.2%,与安徽分离毒株彼此之间的同源性介于93.4%~99.5%。结论安徽省家养野猪中存在PCV2感染,分离毒株与家猪源病毒差异不大,PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性,家养野猪源PCV2的基因型与当地PCV2流行株的基因型密切相关。     

SARS-CoV-2病毒以广泛存在且分化不同的动物源性ACE2为受体

正新型冠状病毒肺炎疫情对全球造成了史无前例的公共健康威胁和经济危机。尽管目前推测蝙蝠和穿山甲可能是导致新型冠状病毒肺炎的病原体SARS-CoV-2病毒的天然宿主,但其来源和为何突然暴发仍然是一个谜。但令人惊奇的是,与蝙蝠和穿山甲体内发现的SARS-CoV-2样冠状病毒不同,SARS-CoV-2病毒糖蛋白刺突(S)上有一个多元furin蛋白切割序列。SARS-CoV-2病毒利用人体内血管紧张素转换酶2(ACE2)作为受体侵染细胞。