一种同时纯化钙谓神经磷酸酶和钙调素的有效方法

本文报导了一种能同时纯化钙调神经磷酸酶和钙调素的有效方法。牛脑粗提液经DE-52纤维素层析分段洗脱:0.5mol/L NaCl缓冲液洗脱峰经phenyl-sepharose亲和柱和G75 sephadex制得电泳纯钙调素。0.18mol/L KCl缓冲液洗脱峰经Affigel-Blue层析,硫酸铵盐析,钙调素亲和层析,G-200 Sephadex凝胶过滤制得电泳纯钙调神经磷酸酶。     

植物钙调素结合蛋白研究进展

钙调素(CaM)作为最重要的一类Ca2 传感蛋白可以通过与其下游CaM结合蛋白(CaMBP)作用而调节细胞的生理功能.因此,对CaMBP的研究是揭示CaM作用机制的重要内容,是探明Ca2 -CaM信号转导系统的关键.该文从CaMBP和CaM的结合特性、植物CaMBP的分布以及植物CaMBP的生物学功能等方面综述了植物CaMBP的研究现状和最新进展.     

钙调素及钙调素相关蛋白在植物细胞中的研究进展

植物对一系列生物和非生物刺激所产生的反应都与细胞内Ca2+信号转导有关,而钙调素、钙调素相关蛋白则是Ca2+信号转导的下游靶蛋白。该文介绍了钙调素的结构及其在植物细胞中的分布,钙调素及钙调素相关蛋白在植物细胞中的表达等方面的最近研究进展。     

人钙调素在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究

利用基因重组技术,将经PCR扩增获得的人钙调素基因(hCaMcDNA)插入质粒pBV220,构建重组表达载体hCaM/pBV220,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆.阳性重组子在大肠杆菌DH5α中经温度诱导可高效表达CaM蛋白,经15%SDS-PAGE分析,可观察到一与CaM分子量相符(约17kD)的诱导表达条带,其表达量占菌体蛋白总量20%,并主要以可溶性形式表达.Westernblot结果证实,17kD的表达条带可与标准鼠抗人CaM单克隆抗体起特异反应.用Pheny1-SepharoseCL-4B疏水亲和层析法纯化重组菌超声上清表达产物,每1L菌液可获CaM纯品3～4mg.重组人CaM(rhCaM)与牛脑CaM的氨基酸组成基本一致.生物活性测定结果提示,rhCaM具有激活NAD激酶的活性,其激活程度与标准人脑CaM几乎一致.     

生物素标记钙调素用于植物钙调素结合蛋白的检测

用生物素标了己了花椰菜ＣａＭ。生物素标记的ＣａＭ具有与天然ＣａＭ相似的Ｃａ２＋依赖电泳特性,可激活ＣａＭ依赖性磷酸二酯酶,能够检测出５０ｎｇ的磷酸二酯酶。利用它建立了检测植物ＣａＭ结合蛋白的生物素－覆盖法（Ｂｉｏｔｉｎ－ｏｖｅｒｌａｙ）并证实酶标亲和素可与胡萝卜愈伤组织内６４ｋＤ蛋白质非特异结合,因此将此法运用于植物材料时必需设置酶标亲和素处理的对照。用生物素－覆盖法检测胡萝卜愈伤组织形成过程中的ＣａＭ结合蛋白时可检出２,４－Ｄ诱导的ＣａＭ结合蛋白。     

大熊猫子宫钙调素的分离纯化和性质的研究

以大熊猫子宫为材料分离纯化了钙调素(Calmodulin,CaM),经SDS-PAGE,PAGE和等电聚焦电泳鉴定,表现均一。分子量为18800道尔顿,等电点为3.6。该蛋白质分子的N-末端为封闭的。大熊猫子宫钙调素具有其它来源钙调素所特有的一些性质。对环核苷酸磷酸二酯酶有明显的激活作用,还发现对超氧化物歧化酶也有一定的激活作用。电泳行为受Ca~(2+)影响而出现特征性电泳改变,在含有Ca~(2+)的SDS凝胶电泳中,电泳速度比EGTA存在对略快,在PAGE中,有Ca~(2+)比无Ca~(2+)对电泳速度略慢。大熊猫子宫钙调素的氨基酸组成中,Phe/Tyr为8:2,可观察到钙调素特征性紫外吸收光谱。     

应用磷酸二酯酶定量测定植物钙调素

钙调素(Calmodulin,简称CaM)研究工作中一个重要手段是其定量测定。目前国内外CaM定量方法主要有3类:酶法(如PDE酶、NAD激酶等);免疫学方法(如放射免疫法等)和聚丙烯酰胺凝胶电泳法。其中环核苷酸磷酸二酯酶(Phosphodiesterase简称PDE酶)法因为可以测定活性态CaM,无需特殊设备或试剂,灵敏度虽低于放免法,但高于电泳法,是目前最为普遍应用的CaM定量方法。下面介绍我们在定量测定植物CaM中的做法与体会。     

粟酒裂殖酵母钙调素基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的分离纯化

用带有粟桌酒裂殖酵母钙调索基因的质粒PEC/PCA和质粒PSB6来转化大肠杆菌SB1,扩增培养后破碎离心,上清液经Phenyl-SepharoseCL－4B柱、DEAEcellulose-52柱、SephedesG－75柱分离,得到纯化的表达产物,此产物经SDS—PAGE电泳鉴定和对环核苷酸：酷酶（cyclicnucleotidephosphodiesterase,PDE）活性的激活鉴定,确定为酵母钙调素,且其分产量小于猪脑钙调素。     

植物的钙调素亚型

钙调素是一种高度保守的多功能Ca2 结合蛋白,在Ca2 信号转导途径中处于中心环节.近年来的研究表明,CaM亚型在植物中普遍存在,不同的CaM亚型与靶蛋白相互作用,它们的表达特性和生物学功能存在差异.该文介绍了植物 CaM亚型的研究现状和进展.     

叶绿体小分子RNA的分离纯化和鉴定

本文采用低速匀浆、过筛的方法从植物叶中分离得到了完整、纯净的叶绿体。将叶绿体与提取缓冲液、苯酚混合匀浆抽提叶绿体 RNA。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳与文献已发表的已知酵母5S RNA、菠菜叶绿体4.5S RNA 及小麦5S RNA、4.5S RNA 的电泳迁移距离进行比较,发现芹菜叶绿体中小分子 RNA(沉降系数为5S 左右的 RNA)中除含有5S RNA 和4S RNA 外,还含有两种4.5S RNA。而水杉和银杏叶绿体小分子 RNA 中只含有5S RNA 和4S RNA。     

家蚕丙氨酸转氨酶的纯化与鉴定

应用细胞匀浆,硫酸铵分段盐析,DEAE-纤维素柱层析和羟基磷灰石柱层析等方法,从家蚕后部丝腺中成功地分离制备了高纯度的丙氨酸转氨酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定,本法制备的丙氨酸转氨酶已达到均一的纯度。     

小麦黄化胚芽鞘的细胞壁钙调素和钙调素结合蛋白

小麦黄化胚芽鞘经苯基琼脂糖亲和层析提取和纯化,其细胞壁CaM在有钙和缺钙时SDS电泳呈现不同的迁移率;依赖Ca~(2 )与苯基疏水结合;在紫外吸收光谱上具有五个特征峰;对PDE的激活剂量反应曲线和从非活性状态向活性状态转变时所需的Ca~(2 )浓度均和胞内CaM相同,说明细胞壁CaM和胞内CaM具有相同的基本理化特性。采用CaM琼脂糖亲和层析,发现在小麦细胞壁中存在CaM结合蛋白,其中以分子量为40.7 kD的 CaM结合多肽为主。细胞壁CaM结合蛋白不具有过氧化物酶、ATP酶或酸性磷酸酯酶的活性。     

脊神经节感觉神经特异蛋白的分离纯化和鉴定

为进一步研究感觉神经特异蛋白２９ＫＤ的结构和功能,我们以兔脊神经节及背根纤维为材料,通过制备匀浆,离子交换层析ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ,高压液相凝胶过滤层析分离纯化了感觉神经特异蛋白２９ＫＤ,薄层扫描鉴定纯度为８０％以上,用蛋白质印迹法鉴定了该蛋白,并进行了该蛋白的稳定性观察。为该蛋白作为鉴定感觉神经元及其纤维的标志物,和研究感觉神经元的再生与功能打下了基础     

链霉亲和素纯化和鉴定方法的研究

对链霉亲和素进行纯化、鉴定,采用冷钝化的方法去除培养液中大部分杂蛋白,用亲和层析法从链霉菌L-183的培养液中纯化链霉亲和素（SA）,经试验,SA回收率为75％～85％。鉴定表明,自制SA的分子量为74．5kD,每分子SA可结合3．2个生物素分子,活性为11．2U／mg,pI为7．4。自制SA各项生物学性质与文献报道相符。     

银杏花粉微管蛋白的纯化及鉴定

采用丙酮粉抽提,ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００、ＭｏｎｏＱ柱层析,从银杏花粉中分离纯化出微管蛋白,其两个亚基的分子量分别为５４ｋＤ和５２ｋＤ纯化的微管蛋白可与鸡脑微管蛋白抗体发生免疫交叉反应。