酿酒酵母中a-synuclein蛋白聚集诱导的细胞毒性的研究

帕金森症(Parkinson’s Disease, PD)是当今最为广泛的神经退行性疾病之一。研究显示, a-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中有着非常重要的作用。以酿酒酵母为模式系统, 通过调控a-synuclein蛋白在胞内的表达量或改变其它一些可能影响a-synuclein聚集状态的因素, 对a-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中可能的细胞毒性机制进行了研究。结果表明, a-synuclein蛋白的高水平表达会明显增强该蛋白因聚集所诱导的细胞毒性, 而且这种细胞毒性与细胞代谢状态明显相关; 超表达酿酒酵母分子伴侣YDR533C可以明显缓解a-synuclein蛋白异源表达对酵母生长的抑制。上述结果表明, 蛋白折叠与折叠过程中的质量控制在a-synuclein蛋白聚集过程中有着非常重要的作用。     

酿酒酵母中α-synuclein蛋白聚集诱导的细胞毒性的研究

帕金森症(Parkinson's Disease,PD)是当今最为广泛的神经退行性疾病之一.研究显示,α-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中有着非常重要的作用.以酿酒酵母为模式系统,通过调控α-synuclein蛋白在胞内的表达量或改变其它一些可能影响α-synuclein聚集状态的因素,对α-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中可能的细胞毒性机制进行了研究.结果表明,α-synuclein蛋白的高水平表达会明显增强该蛋白因聚集所诱导的细胞毒性,而且这种细胞毒性与细胞代谢状态明显相关;超表达酿酒酵母分子伴侣YDR533C可以明显缓解α-synuclein蛋白异源表达对酵母生长的抑制.上述结果表明,蛋白折叠与折叠过程中的质量控制在α-synuclein蛋白聚集过程中有着非常重要的作用.     

α-Synuclein蛋白聚集状态与帕金森病形成

帕金森病是一种常见的老年神经退行性疾病,其致病机理复杂.其中α-synuclein基因是较早发现的与帕金森病相关的基因,其编码的α-synuclein蛋白是帕金森病神经元内出现的一种蛋白包涵体结构——路易体的主要组成成分.最近的研究结果显示,α-synuclein蛋白存在不同聚集状态间的转换,其中聚集过程中形成的寡聚体中间构象具有较强的细胞毒性,可能对帕金森病的发病过程有着重要作用;而且这种聚集状态的转换过程受到多种遗传学与细胞学因素的影响,从而在某种程度上反映了帕金森病发生形成的遗传学与细胞学机制.本文将对α-synuclein蛋白聚集状态转换特性及其在帕金森病发病过程中作用机制方面的研究进展作一综述．     

基于T-REx系统筛选TTC3可诱导表达的稳转细胞株

位于人类21号染色体唐氏综合征关键区(DSCR)的TTC3基因所表达的蛋白TTC3具有泛素连接酶的活性,其表达异常可能会影响其他蛋白的泛素化水平和降解速率,并可能与唐氏综合征表型发生相关。在前期研究中发现TTC3蛋白在细胞中过表达易形成聚集体。为了在细胞内观察TTC3蛋白的聚集过程,以及该过程对细胞的毒性影响,采用T-REx系统进行TTC3基因稳定转染细胞株的筛选,得到了能够通过四环素诱导蛋白稳定表达的细胞株,解决了瞬时转染的外源质粒进入真核细胞进行相关实验时,质粒丢失和TTC3快速过高表达聚集沉淀的研究难点,对后续研究TTC3蛋白的生理功能有重要意义。     

不同温度下酿酒酵母细胞分裂周期蛋白Cdc5在有丝分裂中的分子动力学研究

[目的] 探究不同温度下酿酒酵母细胞分裂周期蛋白Cdc5蛋白在有丝分裂中的分子动力学变化。[方法] 本研究以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为材料,采用活细胞成像的方法,探究Cdc5蛋白在不同温度下在酿酒酵母有丝分裂过程中的精细分子动力学变化;通过测量OD₅₉₅绘制生长曲线图,看其宏观的分裂情况是否与微观下Cdc5蛋白的分子动力学变化一致;利用流式细胞术检测细胞的细胞周期变化的情况。[结果] 在胞质分裂时,Cdc5蛋白从母细胞进入子细胞,并在芽颈处发生聚集。25℃条件下细胞中Cdc5蛋白在芽颈处的聚集时间长,37℃条件下Cdc5蛋白在芽颈处聚集时间短,两者间存在显著差异;但两个温度下,细胞中Cdc5蛋白的表达量没有显著性差异。同时,温度也会影响Cdc5蛋白在降解过程中的动力学行为,包括Cdc5蛋白在母细胞与子细胞中荧光强度峰值出现的次数和时间。生长曲线结果显示,酿酒酵母单一细胞分裂周期的变化影响了其宏观的细胞生长,且酵母分裂速度越快,子细胞长宽比越小;细胞周期结果表明,37℃下Cdc5蛋白的动力学变化与酿酒酵母细胞周期变化一致,酿酒酵母细胞周期从G₀/G₁期进入S期,亦加速了酿酒酵母的分裂。[结论] 本研究首次探究了不同温度下酿酒酵母有丝分裂中Cdc5蛋白的精细分子动力学及对应的酵母的宏观生长情况,结果表明温度会对Cdc5蛋白的动力学产生影响,且其精细分子动力学与酿酒酵母的分裂速度成正相关,该结果为进一步研究其在细胞有丝分裂中的功能提供了前期研究基础。     

MHF组蛋白折叠复合体组分编码基因MHF1过表达对重组酿酒酵母纤维素酶生产的影响

【背景】重组酿酒酵母可用于生产多种药用蛋白和工业酶等外源蛋白,但蛋白分泌水平低是限制其异源蛋白高效生产的重要因素。异源蛋白表达和分泌过程可能会对宿主细胞产生多种胁迫,因此,研究胁迫响应相关基因对重组酵母异源蛋白生产的影响具有重要意义。Mhf1p是MHF组蛋白折叠复合体的组分之一,与DNA损伤修复及维持基因组稳定性有关,但其对异源蛋白生产的作用尚不清楚。【目的】研究MHF1过表达对重组酿酒酵母蛋白生产的影响。【方法】在分泌表达纤维素酶的重组酿酒酵母菌株中利用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术整合过表达MHF1,分析其对产酶的影响,并探讨影响产酶的分子机理。【结果】与出发菌株相比,过表达MHF1菌株的外切纤维素酶CBH酶活性提高了38%。对过表达MHF1的CBH生产菌株中蛋白合成和分泌途径相关基因转录水平进行检测,发现与对照菌株相比,CBH1基因和与分泌相关的SEC22、ERV29等基因在不同时间点呈现不同程度显著上调。【结论】MHF1过表达可促进酿酒酵母异源外切纤维素酶的生产,并影响外源酶基因和分泌途径基因的表达,可能通过对多基因的协同表达影响促进产酶。     

星形胶质细胞在神经系统疾病中的作用

激活的星形胶质细胞会产生和释放的神经递质、神经营养因子和促炎因子等,对神经元既有保护作用,也有毒性作用,在阿尔茨海默病、帕金森症、癫痫、缺血性脑损伤等多种神经系统疾病的发生发展过程中有着重要作用。对近年来国内外有关星形胶质细胞参与神经系统疾病进程的最新研究进展作了综述,并对今后研究工作进行了展望。     

胰岛淀粉样多肽的研究进展

由蛋白错误折叠后聚集所产生的淀粉样蛋白沉积是导致老年痴呆症、疯牛病、2型糖尿病等多种疾病的重要因素。由胰岛淀粉样多肽(islet amyloid polypeptide,IAPP)所形成的淀粉样蛋白沉积,具有破坏胰岛β细胞膜结构、诱导β细胞凋亡和损伤β细胞功能的作用,被认为是2型糖尿病的重要致病原因之一。对IAPP的聚集性、聚集体的结构,以及其对β细胞的毒性作用研究,不但有助于明确2型糖尿病的发病机制,而且最新研究也表明抑制IAPP的聚集可有效减少β细胞的凋亡,提高胰岛移植的成功率。因此,IAPP已成为2型糖尿病治疗中一个具有良好前景的靶点。该文对IAPP研究的最新进展进行了简要介绍。     

内质网应激与抑郁症关系的研究进展

内质网（endoplasmic reticulum,ER）是细胞内负责蛋白质合成折叠、Ca2＋储存的主要场所,对应激极为敏感。其功能紊乱时出现错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集以及Ca2＋平衡紊乱的状态,称为内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）。ERS在细胞生理病理中发挥重要作用,但其具体作用机制目前尚未清楚。     

未折叠蛋白反应的信号转导

在内质网中,分泌性蛋白、跨膜蛋白和内质网驻留蛋白折叠成天然构象,经过修饰后,形成有活性的功能性蛋白质。如果蛋白质在内质网内的折叠受到抑制,造成未折叠蛋白聚集,将引起内质网应激。激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）,使蛋白质的生物合成减少,内质网的降解功能增强,从而降低内质网负担,维持细胞内的稳态。如果内质网应激持续存在,则可能诱发细胞凋亡。研究表明,未折叠蛋白反应能在多种肿瘤细胞中发生,并能促进肿瘤细胞的生长。本文对未折叠蛋白反应与肿瘤研究的最新进展进行综述。     

新城疫病毒F蛋白细胞融合活性位点中保守氨基酸基因突变分析

为了确定新城疫病毒融合蛋白(F)分子上活性位点中保守氨基酸在F蛋白的细胞融合作用,弄清F细胞融合的分子机理,采用基因定点突变法,创造一个酶切位点,用酶切反应初步筛选突变株,然后用DNA序列分析进一步确定,并于真核细胞内进行表达,Giemsa染色定性和指示基因法定量检测细胞融合功能,荧光强度分析(FACS)检测表达效率情况。结果表明,NDV F第117位苯丙氨酸(F)突变成亮氨酸(L)时对细胞融合作用没有显著影响。R112和K115同为保守序列,分别突变为G时,细胞融合活性只有原来的44%,下降了56%。细胞表面表达效率没有明显的改变。N147突变为K时,细胞融合活性明显下降,只有原来的15%,而细胞表面表达效率没有明显的改变。L154为保守序列,突变为K时,细胞融合活性消失,说明L154是一个非常关键的氨基酸,对维持F蛋白的细胞融合活性非常重要。细胞表面表达效率也有所下降(为原来的94%)。D462属于高度保守氨基酸,当突变为N时,细胞融合活性消失,但经细胞表面表达效率分析证明,此突变蛋白未表达于细胞表面,证明在细胞浆转运至细胞表面的过程中发生了问题。当突变为R和E时,细胞融合活性未发生改变,但细胞表面表达效率有所下降,分别为野毒株的63%和44%。说明NDV F分子上与HN相互作用的特异性区域中的某些保守氨基酸在细胞融合中发挥着重要作用,对F蛋白的折叠、加工、转运等,发挥着不同作用,从而影响F蛋白的细胞融合作用和/或在细胞表面的表达量。     

复制阻滞应激引发的ARTEMIS蛋白磷酸化调控CYCLIN E蛋白的稳定性

Artemis是1个具有多种生物学功能的磷酸化蛋白,它在基因毒性应激引发的细胞周期检测点调控中起重要作用,但其调控机制知之甚少.为了探讨UVC等DNA复制阻滞应激引发的Artemis磷酸化及蛋白表达水平对细胞周期蛋白 E的调控作用和调控机制.首先以Western印迹方法检测Artemis S516-645A突变细胞和Artemis表达降低细胞的细胞周期蛋白E的表达水平,发现ArtemisS516-645A突变细胞和多种Artemis siRNA转染细胞的细胞周期蛋白E表达水平均高于对照细胞.在此基础上,为分析细胞周期蛋白E表达受调控的分子机制,在稳定表达各种磷酸化状态Artemis的HEK-293细胞中导入外源性启动子转录驱动的细胞周期蛋白E表达质粒,发现表达Artemis S516-645A突变体的细胞中外源性的细胞周期蛋白E蛋白表达水平也高于野生型细胞.进一步的研究发现在Artemis蛋白表达降低的细胞中与泛素结合的细胞周期蛋白E减少而蛋白稳定性增加.本研究还发现Artemis蛋白对细胞周期蛋白E的调控过程是不依赖于p53和p21表达的.这些结果表明,Artemis S516-645A突变和Artemis表达降低都可以引起细胞周期蛋白E蛋白水平升高,该调控作用是在转录后水平发生的,可能是干扰了细胞周期蛋白E的泛素化介导的蛋白降解过程,并且该调控作用是独立于p53-p21信号通路的.     

β-淀粉样蛋白神经毒性及其防治策略

β-淀粉样蛋白（amyloid β-peptide,Aβ）的过量表达和异常聚集是引起阿尔茨海默病的重要原因之一。以β-淀粉样蛋白级联假说为线索,阐述分泌酶对Aβ生成的影响,不同聚合状态Aβ的神经毒性以及Aβ毒性作用机制,总结Aβ生成、聚合、清除过程中神经毒性的相应防治措施,对阿尔茨海默病中β-淀粉样蛋白神经毒性最新研究进展作一综述。     

ERS和microRNA间的相互作用与肿瘤

内质网是细胞蛋白质翻译后修饰和折叠的重要场所. 多种外界因素诸如热激、病毒感染和低氧等均可导致内质网功能受损,表现为细胞中未折叠或者发生错误折叠的蛋白质在内质网腔内大量聚集,这种聚集将会引发细胞产生应激反应,称为内质网应激. MicroRNAs 是一类内源性非编码 RNAs,通过调控基因的表达来发挥重要的功能. 越来越多的研究表明,内质网应激和microRNAs之间通过相互作用参与诸多重要的生理过程. 本文综述了内质网应激和microRNAs两者的相互作用与肿瘤发生发展的关系,以期对肿瘤发生发展的过程调控机制有更为深入的理解,为发展新的肿瘤治疗方案提供思路.     

CD9在口腔鳞状细胞癌中的表达水平及其临床意义

目的:口腔鳞状细胞癌是一类极易发生局部侵袭和淋巴结转移的恶性肿瘤,CD9蛋白在多种肿瘤的发生发展及侵袭转移过程中起到重要作用,本研究旨在分析CD9蛋白在口腔鳞状细胞癌中的表达水平及其临床意义。方法:收集我院诊断明确的口腔鳞癌肿瘤患者石蜡标本合计80例,通过免疫组化手段对CD9蛋白表达水平进行评价,并根据CD9蛋白的表达水平分组,分析患者的临床病理学特征与CD9蛋白的关系。结果:CD9在正常组织和癌旁组织正常表达,在肿瘤组织中表达率低,其表达水平和口腔鳞癌的分化程度,淋巴结转移及最终分期有相关性(P0.05)。结论:本研究结果揭示,CD9在口腔鳞状细胞癌的发生发展中起到重要作用,CD9蛋白水平的低表达或不表达可能预测着肿瘤具有更明显的恶性生物学行为,并可能成为口腔鳞状细胞癌预后的生物学指标及基因治疗的新靶点。     

自噬在帕金森病发病中的作用

自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的降解途径,主要起着调节性的作用以保护细胞免遭感染、癌症、神经变性、老化,以及心脏疾病等在内的各种病理性损伤,与细胞的存活、分化、发育和内环境稳态的维持密切相关.近来的研究表明,自噬在清除与神经变性疾病相关的错误折叠蛋白和易聚集蛋白方面起关键作用,尤其在帕金森病的发生、发展过程中发挥重要作用.     

Cln3缺失对酿酒酵母生长的影响

Cln3是酿酒酵母G1期周期蛋白中的一种,为了研究Cln3在细胞周期与形态发生中的作用,我们构建了酿酒酵母CLN3基因的缺失株,并对其表型进行了分析。结果显示,cln3缺失株对α信息素的敏感性增强,α信息素诱导的细胞周期停滞现象明显大于野生型菌株,这种增强作用不受Sgv1因子的影响。同时,与野生菌相比cln3缺失株的细胞形态也有明显变化,双倍体cln3缺失株细胞的顶端生长能力增强而单倍体细胞的侵入生长能力则受到抑制。结果表明,与酿酒酵母的另外两个G1期周期蛋白Cln1、Cln2不同,Cln3在形态发生中有其独特的功能与作用方式。     

内质网应激与心肌肥大

肌浆网是调控心肌细胞钙稳态、蛋白质合成和细胞凋亡的重要亚细胞器。内质网应激是指内质网理化环境改变和过负荷等因素导致未折叠/误折叠蛋白在内质网聚集和钙稳态失衡等内质网功能紊乱状态。适度的内质网应激有利于心肌细胞代偿,持续而严重的内质网应激则触发内质网应激相关细胞凋亡,造成肥大心肌由代偿转向衰竭,是影响心肌肥大发生、发展的重要因素。本文综述了内质网应激反应在心肌肥大发生、发展中的作用。     

不同传代次数的酿酒酵母细胞壁蛋白组学分析

【目的】探讨酿酒酵母衰老过程中细胞壁蛋白变化, 从蛋白水平上解释酿酒酵母衰老的原因。【方法】以酿酒酵母FFC2146为研究对象, 采用显微镜观察法比较了经2、10、15次连续传代酿酒酵母的细胞形态; 用计算细胞沉降速率的方法考查酵母凝絮性; 通过3,5-二硝基水杨酸法测定降糖速率来表征酵母代谢活力; 采用二硫苏糖醇溶解法结合苯酚萃取法抽提不同传代次数的酿酒酵母细胞壁蛋白; 并且通过双向电泳进行差异性分析。【结果】结果显示随着传代次数的增加酿酒细胞个体表面变得粗糙, 凝絮能力明显增强, 降糖能力明显减弱, 表明多次传代后的酵母体现出衰老现象。双向电泳结果共得到309个胞壁蛋白点, 其中11个蛋白质点存在明显差异。6个蛋白质点在第15代丰度小于第2代丰度2倍以上, 4个蛋白质点只在第15代酵母细胞壁中出现, 1个蛋白质点只在第2代酵母细胞壁中出现。【结论】酿酒酵母FFC2146经过15次连续传代培养后11个细胞壁蛋白丰度发生明显变化, 此11个细胞壁蛋白的表达水平与酿酒酵母衰老相关。     

非折叠蛋白质应答对人胚肾细胞293A迁移特性的影响

为了研究非折叠蛋白质应答对器官发生的影响,应用衣霉素诱导非折叠蛋白质应答并观察其对人胚肾细胞系293A迁移特性的影响。在实验中,应用划痕法对细胞迁移进行观察,并应用细胞黏附实验、荧光染色技术、扫描电镜技术及免疫印迹实验分别对细胞黏附特性、微管及微丝、细胞表面边缘的突起及小分子GTPase的表达水平进行研究。结果表明,非折叠蛋白质应答可以抑制细胞迁移,进一步的研究发现,非折叠蛋白质应答可以降低细胞的黏附能力、引起细胞骨架的重排、抑制伪足的形成并降低RhoA的表达水平。这提示,非折叠蛋白质应答可能通过抑制应激细胞的迁移为应激细胞的功能修复赢得了时间,在器官发生过程中发挥作用。