SAR与植物转基因沉默的消除

随着转基因技术在各上应用领域的深入和发展,转基因沉默现象已引起越来越多的关注。转基因沉默主要发生在转录或转录后水平,涉及核酸的三种相互作用,即：ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、ＲＮＡ－ＲＮＡ。这是植物基因表达调控的具体表现之一,也是外源基因插入后生物体的一种自我保护。ＳＡＲ协同转基因进行转化,可以消弱宿主ＤＮＡ对外源基因的不利影响。实验证明,在稳定整合的转基因植物中,ＳＡＲ提高了整体表达水平,并降     

基因沉默：获得性免疫的新途径

基因沉默 (ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ)首先发现于转基因植物。发生沉默的基因可以是外源性转移基因 ,也可以是入侵的病毒或宿主内源性基因。双链ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)作为启动因素或中间体为不同生物基因沉默所共有。通常 ,基因沉默发生在两种水平上 ,一是由于ＤＮＡ甲基化、异染色质化及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默 (ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉ ｌｅｎｃｉｎｇ ,ＴＧＳ) ,另一种是在基因转录后水平上通过对目标ＲＮＡ特异性降解而使基因失活的转录后基因沉默 (ｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅ…     

中国棉铃虫P450家族的CYP6B2基因与抗药性关系

运用ＲＴ－ＰＣＲ技术从棉铃虫五龄幼虫扩增到一个６２７ｂｐ的ＤＮＡ片段,测序表明这一片段为ＣＹＰ６Ｂ２基因的功能保守区,以这一片段为探针对棉铃虫除除虫菊酯抗性（Ｒ）及敏感（Ｓ）品系的总ＲＮＡ进行点杂交。ＲＮＡ点杂交表明未经氰戊菊酯诱导的情况下Ｒ品系的ＣＹＰ６Ｂ２基因的ｍＲＮＡ水平明显高于Ｓ品系,即为转录水平的调控,而经氰戊菊酯诱导后杂交表明Ｓ品系明显０被氰戊菊酯诱导,但Ｒ品系不被诱导。由此推测,棉铃     

HCV5＇端非编码区cDNA的体外转录

采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５＇端非编码区（５＇ＮＣＲ）３０２ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒,获得的重组体ｐＵＮ进行序列测定。将ｐＵＮ的目的基因亚克隆进体外转录载体ｐＳＰＯＲＴＩ多克隆位点的ＥｏｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点之间,所得重组体ｐＳＮ线性化后由Ｔ＿７ＲＮＡ多聚酶及ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶引导体外转录反应,产物经凝胶电泳及特异引物ＲＴ－ＰＣＲ,证实ＳＰ６引导的是正义ＲＮＡ,Ｔ７合成的是反义ＲＮＡ,其大小分别力４２９ｂｐ和３６２ｂｐ。并证实所得ＲＮＡ力ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ转录而来。获得的ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ和ＲＮＡ在常规逆转录和ＰＣＲ步骤中用于设立有效的模板对照,对消除假用性及评估试剂有重要意义。同时,ＨＣＶ５＇ＮＣＲ体外转录载体的构建可用于制各ＲＮＡ探针和反义ＲＮＡ,改进后还可作为定量ＰＣＲ的竞争性模板。     

应用RT-PCR检测基因的体外转录活性

体外转录分析已广泛应用于分子生物学领域．由于体外转录所产生的ＲＮＡ的量极少,需有灵敏的方法检测生成的ＲＮＡ．本研究发展了一种基于ＲＴ－ＰＣＲ技术鉴定体外转录产物的方法．将待研究基因的启动区与任何一段已知的含转录起始位点的编码序列相连,制备成体外转录的模板．体外转录后,用ＤＮａｓｅⅠ将ＤＮＡ模板完全降解;生成的ＲＮＡ经反转录合成ｃＤＮＡ;再以ｃＤＮＡ为模板,用相应的引物进行ＰＣＲ扩增,产物用琼脂糖凝胶电泳检测．该法灵敏度高,操作简便,无需同位素,且体外转录模板制备方便．还可结合其他技术,如Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析,能获得更高的灵敏度．     

植物转基因沉默与病毒抗性

对植物基因沉默的机制及其在植物抗病毒基因工程中的应用作了综述.植物转基因沉默是转基因植株中普遍发生的一种现象,引起植物转基因沉默的原因是多方面的,但主要涉及转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默.植物对病毒的抗性机制在某些方面与基因沉默有相似之处.     

GSTs同工酶基因在乳腺癌中的扩增与基因的表达

采用ＤＮＡ和ＲＮＡ的斑点杂交分析方法,对３２例乳腺癌和相应的癌旁正常组织中ＧＳＴ－π、ＧＳＴ－α和ＧＳＴ－μ基因的ＤＮＡ扩增和ＲＮＡ转录表达情况进行研究,发现ＧＳＴ－π在乳腺癌中存在基因扩增和明显的ｍＲＮＡ表达升高,ＧＳＴ－π基因表达调控主要在转录水平进行的;ＧＳＴ－α和ＧＳＴ－μ在乳腺癌中表达水平较低,但仍可见α和μ类ＧＳＴ同工酶ｍＲＮＡ转录在肿瘤和正常组织中发生了较大的变化。结合乳腺癌中雌激素受体（ＥＲ）表达情况还发现ＧＳＴ－π表达水平与ＥＲ的表达存在负相关性。     

利用嵌合RNA：DNA寡聚核苷酸进行核酸序列突变

动物中内源基因的单核苷酸突变可以引起多种单基因疾病。传统的基因疗法大多利用外源基因的导入 ,由于转基因的效率和外源基因表达上存在问题 ,这种基因疗法有一定的局限性。本文介绍的利用嵌合ＲＮＡ :ＤＮＡ寡聚核苷酸 (ＲＤＯ)在ＤＮＡ水平上对突变基因进行修复是一种新的基因疗法。这种基因疗法同样适用于植物 ,并且在植物功能基因组的理论研究中有重要作用。1　嵌合ＲＮＡ :ＤＮＡ寡聚核苷酸 (ＲＤＯ)的分子结构ＲＤＯ有一段五碱基长的ＤＮＡ序列 ,除了突变的位点以外 ,与靶基因互补。五碱基的ＤＮＡ序列两旁各有 1 0个 2’ -Ｏ -甲基…     

转基因植物转录后基因沉默的特点、机理及应用

自在转基因植物中发现转基因沉默现象以来 ,很多学者对该现象进行了广泛的研究 ,认为其作用机制有三种 :位置依赖性基因沉默、转录水平基因沉默、转录后水平基因沉默。目前主要集中于转录后水平基因沉默的研究 ,通过研究发现它具有广泛性、可传导性及特异性的特点 ,并对其机制提出了一些假说。最近 ,人们还发现转录后水平基因沉默与植物抗病毒能力有联系。本文对转基因植物转录后基因沉默的特点、机理及应用方面的进展作了综述     

转基因植物转录后基因沉默的特点、机理及应用

自在转基因植物中发现转基因沉默现象以来,很多学者对该现象进行了广泛的研究,认为其作用机制有三种：位置依赖性基因沉默、转录水平基因沉默、转录后水平基因沉默。目前主要集中于转录后水平基因沉默的研究,通过研究发现它具有广泛性、可传导性及特异性的特点,并对其机制提出了一些假说。最近,人们还发现转录后水平基因沉默与植物抗病毒能力有联系。本文对转基因植物转录后基因沉默的特点、机理及应用方面的进展作了综述。     

抗水稻条纹叶枯病毒核酶的设计,克隆及体外活性测定

为探索控制水稻条纹叶枯病毒（Ｒｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓ,ＲＳＶ）设计合成了特异切割该病毒ＲＮＡ保守区及编码病害特异性蛋白（ＤｉｓｅａｓｅＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｏｔｅｉｎ,ＤＳＰ）基因的核酶,核酶基因的长度均为４０个碱基,用化学合成方法合成其正链及与其３＇－末端互补的１５个碱基引物,用ＴａｇＤＮＡ多聚酶合成其互补链。双链ＤＮＡ直接插入克隆载体ＰＧＥＭ３ｚｆ（＋）的Ｓｍａｌ位点。序列测定表明,克隆得到的核酶序列与设计的核酶序列完全一致。经ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶体外转录得到核酶ＲＮＡ。当核酶ＲＮＡ与以同样方法转录得到的靶基因ＲＮＡ混合反应,可得到预期结果相同的切割片段,表明两种核酶在体外均具有特异性切割活性。     

蓖麻蚕rDNA基因核骨架结合区在酵母中的自主复制功能

蓖麻蚕核糖体ＲＮＡ基因（ｒＤＮＡ）５′－非转录间隔区有长约１ｋｂ的核骨架结合区ＳＡＲ（ｓｃａｆｏｌｄ－ａｓｓｏｃｉａｔ－ｅｄｒｅｇｉｏｎ）［１］。本文对该ＳＡＲ元件的酵母自主复制功能进一步研究,证明该ＳＡＲ５′端６８８ｂｐ含有１２个ＡＣＳ（ＡＲＳ的核心序列）同源序列,但无ＡＲＳ活性,而其３′端仅３个ＡＣＳ同源序列,但对酵母的转化率比全片段还高４０～５０倍。体外结合实验证明,蓖麻蚕ｒＲＮＡ基因的ＳＡＲ能专一地同酵母核骨架结合,提示ＡＲＳ的功能体现与核骨架结合紧密相关。ｒＲＮＡ基因ＳＡＲ与ＡＲＳ的功能在进化上可能是很保守的。在此基础上可进一步分析ＳＡＲ中与ＤＮＡ复制相关的正调及负调元件。     

利用脊髓灰质炎病毒5‘NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒（ＰＶ）ＲＮＡ聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体ｐＳＧ５质粒上,分别构建了４个表达ＲＮＡ聚合酶的质粒。体外转录实验证明,ｐＳＧ５－ＰＯＬ１．９９和ｐＳＧ５－ＰＯＬ２．０３质粒转染细胞的提取物促进了特异的ＲＮＡ转录,表明两质闰可表达ＲＮＡ聚合酶。将ＰＶ的５’ＮＣＲ序列插在载体ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１的ＣＭＶ启动子下游,构建了ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１－５’ＮＣＲ质粒;     

转录后基因沉默的机制及其应用

确定导致转录后基因沉默的原因,探索在转基因植物研究中避免基因沉默的对策。方法是将转基因沉默分为转录水平的沉默和转录后水平的沉默,分别对RNA阈值模型、异位配对和异常RNA模型、双连RNA模型等几种导致转录后基因沉默模型的分析。结果确定了转基因沉默抑制现象和转录后基因沉默的形成机制,以及转录后基因沉默理论和实践意义。提出了利用RNAi等技术进行基因功能鉴定和利用基因沉默进行病毒防治的策略。     

基因沉默

基因沉默 (ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。一方面 ,基因沉默是遗传修饰生物 (ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｏｒｇａｎｉｓｍｓ)实用化和商品化的巨大障碍 ,另一方面 ,基因沉默是植物抗病毒的一个本能反应 ,为用抗病毒基因植物工程育种提供了具有较大潜在实用价值的策略———ＲＮＡ介导的病毒抗性 (ＲＮＡ ｍｅｄｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ,ＲＭＶＲ) [1～ 3] 。基因沉默现象首先在转基因植物中发现 ,接着在线虫、真菌、昆虫、原生动物以及老鼠中陆续发现。大量的研究表…     

油菜素内酯促进绿豆上胚轴伸长与蛋白质和核酸合成的关系

用饲喂蛋白质和核酸合成的放射性前体［３ Ｈ］－Ｐｈｅ、［３ Ｈ］－尿嘧啶和［３ Ｈ］－胸腺嘧啶证实了油菜素内酯（ＢＲ）能促进绿豆上胚轴的生长和蛋白质、ＲＮＡ 及ＤＮＡ 的合成。用蛋白质和核酸合成抑制剂（ＣＨ、Ａｃｔ．Ｄ、５－Ｆｕ）进一步探讨它们对上胚轴伸长的抑制作用与蛋白质、ＲＮＡ、ＤＮＡ 和ｍ ＲＮＡ 合成之间的关系。证明了上胚轴的伸长依赖于蛋白质和核酸的合成,尤其是依赖于ｍ ＲＮＡ 的合成。说明ＢＲ是在转录水平上调节基因的表达,进而促进上胚轴的伸长     

植物转基因沉默及控制

植物基因工程的目的就是获取外源基因能够按照设计要求正常表达和稳定遗传的转基因植物。近几年来,广泛报道了转基因植物中存在转基因沉默现象。主要阐述了两种转基因沉默的机理即转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默,各种机理都涉及DNA DNA,DNA RNA,RNA RNA的相互作用。同时,还讨论一些控制转基因沉默现象的策略,特别是MAR在转基因植物中具有增强基因表达和减少株间差异的作用。     

花椰菜花叶病毒（CaMV）的表因表达调控

花椰菜花叶病毒是一种具有重要经济价值和生物学意义的植物双链ＤＮＡ病毒,它有７个开放阅读框（ＯＲＦ）,其中６个可各自编码一种蛋白产物。３５Ｓ启动子区域含有３个转录因子专一的结合位点;ＲＮＡ多腺苷化位点具有ＡＡＵＡＡＡ特征序列,它和其上游序列对３５Ｓ ＲＮＡ的加工和翻译有影响作用,下游ＯＲＦ Ｉ在转录激活因子存在时可被翻译。由此表明,ＣａＭＶ的表达调控表现在不同调控机制互作的基础之上。     

用5-Fu治疗MT/p210bcr-abl转基因小鼠的研究

以５－氟脲嘧啶（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ,５－Ｆｕ）腹腔注射治疗了１２只携有金属硫蛋白（Ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ,ＭＴ）启动子和增强子序列、ｂｃｒ－ａｂｌｃＤＮＡ（ｐ２１０）序列及ＳＶ４０剪切和Ｐｏｌｙ（Ａ）信号序列的转基因慢粒白血病（ｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉ－ａ,ＣＭＬ）ＭＴ／ｐ２１０ｂｃｒ－ａｂｌ小鼠,于治疗的第５ｄ及第１０ｄ从不同脏器提取总ＲＮＡ、ＤＮＡ及蛋白质,分别进行ＰＣＲ分析、ＲＴ－ＰＣＲ检测被转移基因的表达水平及免疫沉淀法分析ｐ２１０ｂｃｒ－ａｂｌ转基因产物的激酶活性．结果表明,被转移基因在脾脏和骨髓中表达水平较高,胸腺和肾脏中呈低水平表达．５－Ｆｕ活体治疗１０ｄ后,被转移基因的表达水平及其表达产物的激酶活性均被明显抑制     

人DAF基因在转基因小鼠中的遗传与表达

为研究人ＤＡＦ基因在小鼠体内遗传与表达的规律,从质粒ｐＳＦＦＶ－ＤＡＦ分离出一段包含人ＤＡＦ基因的ＤＮＡ片段。采用受精卵显微注射法建立转人ＤＡＦ基因小鼠。提取出生小鼠的染色体ＤＮＡ,经Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂交相结合确定首建转基因小鼠,并经Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ杂交研究人ＤＡＦ基因在转基因小鼠体内的遗传特征,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交确定其表达情况。小鼠受精卵经基因导入后,共生出２４只小鼠,其中４只被确定为首建转基因小鼠,整合率为１５％,在首建转基因小鼠两两交配生出的Ｆ１代小鼠中分别有７０％和７５％继续携带人ＤＡＦ基因。首建转基因小鼠中有１只小鼠在ＲＮＡ水平表达了人ＤＡＦ基因。可见,人ＤＡＦ基因整合入小鼠基因组中,并能够稳定遗传及表达。