牛催乳素cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达

从牛垂体中分离出总的mRNA,经逆转录酶及大肠杆菌DNA聚合酶合成双链cDNA,以pBR322作为克隆载体并用加G．C尾的方法进行重组,把重组质粒导人大肠杆菌中,建立了牛垂体mRNA的cDNA文库。用标记的人工合成的牛催乳索基因片段作为探针进行杂交,并从库中筛选到几个阳性克隆,经酶谱分析和DNA序列分析证明克隆中有一个含有全长的牛催乳素cDNA序列。将所获得的克隆进行“剪切”,加上启动子,然后导人大肠杆菌JM 103中并在IPTG诱导下表达。用SDS-PAGE检测,证明有表达产物存在,再通过酶标测定证明该表达产物具有与天然牛催乳素相似的免疫学活性。     

植物基因cDNA克隆新技术及进展

过去人们对植物基因的cDNA克隆主要集中在植物看家基因 (house keepinggene) ,而对植物发育调控基因 (developmentalregulatedgene)进行的cDNA克隆研究工作开展得比较少。随着近年来基因差异表达研究技术的飞速发展 ,已建立了好几种发育调控基因的cDNA克隆方法 ,如从较早的DD PCR到最近的cDNARDA、SSH和IPGI,着重论述了cDNARDA、SSH和IPGI的基本技术策略 ,并对三者之间进行了比较分析。     

Bax基因cDNA的分子克隆研究

细胞编程死亡（ｐｒｏｇｒａｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ）是细胞生理性死亡的一种主要形式。Ｂａｘ具有抑制细胞编程死亡的作用。本研究采用ＰＣＲ方法,从人肿瘤细胞ＨＬ—６０ｃＤＮＡ文库中扩增出若干个ｂａｘｃＤＮＡ片段,然后将它们分别与ＰＧＥＭ—Ｔ测序质粒载体连接,并转化到大肠杆菌ＪＭ１０９中去。用蓝／白法筛选重组菌落,经酶切分析及ＰＣＲ鉴定,获得了插入片段大小约为０．４ｋｂ及１．１ｋｂ的ＢａｘｃＤＮＡ重组质粒ＰＢａｘｌ和ｐＢａｘ２。这些片段的测序及表达工作正在进行之中。     

NOBOX基因的cDNA克隆及其特性分析

NOBOX(新生儿卵巢同源基因)是一个卵母细胞特异性表达的同源基因,在早期滤泡发生中起重要的作用。本研究结合电子克隆的方法,从猪卵母细胞中成功地克隆了NOBOX基因的全长cDNA序列(GenBank Accession No.FJ587509)。猪NOBOX基因的cDNA全长为1768 bp,包含1419 bp的开放阅读框。生物信息学分析表明NOBOX基因编码了472个氨基酸,分子量为51.08 kD,等电点为5.73。该蛋白定位于细胞核中,含有一个保守的结构域——cd00086。借助Clustalw软件,采用N-J算法构建了NOBOX蛋白的系统进化树,分析了不同物种间的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在母猪不同组织、细胞及4种孤雌激活胚胎的表达模式,结果表明该基因在母猪各组织中均有不同程度的表达,其中在心脏、肾脏和卵母细胞中表达水平较高,推测其可能在心脏、肾脏和卵母细胞中发挥着重要的作用;NOBOX基因在胚胎发育阶段的表达水平高于G-V期的卵母细胞,表明在胚胎发育阶段pNOBOX的表达增强。     

低温诱导的黄瓜ccr18基因的cDNA克隆及其表达特性分析

采用mRNA差异显示银染技术克隆得到在黄瓜（Cucumis sativus L.)冷敏型品种“津研4号”低温锻炼中特异表达基因的cDNA克隆（ccr18),其大小为639bp。在基因组中以单拷贝或低拷贝形式存在。Northern blot分析显示ccr18基因在12、24、48和72h低温处理的黄瓜中表达,在6h低温处理及对照中没有表达。这表明ccr18基因与黄瓜低温锻炼相关,序列同源性比较表明,它与拟南芥(Arabidopsis thaliana)染色体ⅢBAC库中的F14P3基因组序列具有88％的同源性。     

人Leptin基因的cDNA的克隆和表达

克隆人Leptin基因的cDNA并获取表达的Leptin蛋白,为进一步研究新的Leptin相关蛋白打下基础。以人基因组DNA为模板,用引物悬挂延伸PCR法,克隆与6个组氨酸（6×His）密码子相连的人Leptin基因的cDNA,并将其克隆到体外表达载体pIVEX23MCS上,通过体外快速翻译系统(Roche公司的RTS500环状模板试剂盒和RTS500 ProteoMaster仪器)在体外表达了带有6×His的Leptin融合蛋白。经SDSPAGE及Western blot方法鉴定,融合蛋白大小正确,有172个氨基酸,分子量为1946kD,具有特异的抗原性,且主要以可溶形式存在于反应液上清中。     

猪JARID1C基因的cDNA克隆、生物信息学及组织表达谱分析

JARID1C是高度保守的ARID蛋白家族的成员,该家族的蛋白参与并引起一系列生物学效应,如染色质重塑、细胞增殖与分裂、个体发育以及基因转录调控。JARID1C在人脑中表达丰富,对脑的发育和维持正常功能具有重要作用,突变可引起智力迟钝。本研究采用电子克隆（insilicocloning）的方法并结合5′末端快速扩增技术（RACE）,从猪卵巢中克隆到JARID1C的全长cDNA序列（GenBank登录号：EF139241）。猪JARID1C基因的cDNA全长5,908bp,包括4,551bp的开放阅读框（ORF）、522bp的5′非翻译区（5′UTR）和835bp的3′非翻译区（3′UTR）,polyA加尾信号序列AATAAA位于5,881bp和5,886bp之间。生物信息学分析揭示JARID1C蛋白含有1517个氨基酸残基,定位于细胞核中,该蛋白含有5个保守的结构域：JmjN结构域、ARID结构域、JmjC结构域、C5HC2锌指结构域和PHD锌指结构域。应用ClusterW程序分别对猪、狗、小鼠、大鼠、人和猿的JARID1C核苷酸序列和氨基酸序列进行多重序列比对,发现猪的JARID1C与其他哺乳动物具有很高的相似性。借助Mega3.1软件,采用N-J算法构建JARID1亚家族蛋白的系统进化树,揭示不同物种的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在不同组织的表达差异,结果表明该基因在各组织均不同程度地表达,其中在肺和骨骼肌表达水平最低,而在脑和性腺表达水平最高。     

野生大豆rbcS基因的克隆及结构分析

核酮糖１,５二磷酸羧化酶（Ｒｕｂｉｓｃｏ,Ｅ．Ｃ．４．１．１．３９）是光合碳代谢中的关键酶,也是植物中研究最为广泛深入的一种酶。高等植物的Ｒｕｂｉｓｃｏ大、小亚基分别由叶绿体和核基因组编码。迄今已有几十种光合生物的Ｒｕｂｉｓｃｏ大、小亚基的基因（ｒｂｃＬ、ｒｂｃＳ）结构得到阐明［１］。在高等植物中ｒｂｃＳ基因由多基因家族编码,结构较为复杂,但它同时又是一种相对保守的基因,且同一物种内各ｒｂｃＳ基因成员是协同进化的,因此ｒｂｃＳ基因适合于植物分子进化及系统分类的研究［２］。我国是栽培大豆（Ｇｌｙｃ…     

紫萍磷转运蛋白1;1 cDNA序列的克隆及表达模式

紫萍Spirodela polyrrhiza是一种在生物质资源开发利用和水体生物修复中广泛使用的漂浮植物.随着水体富营养化日益严重,紫萍在水面随处可见.有文献报道紫萍对水体中的氮和磷有良好的净化作用.为了深入研究紫萍对水体中无机磷的吸收和转运,以紫萍为材料提取RNA反转录为cDNA,以此为模板,扩增得到1条特异性片段,...     

Abscisic acid-induced changes in inositol metabolism in Spirodela polyrrhiza

 In response to abscisic acid (ABA), the duckweed Spirodela polyrrhiza (L.) activates a developmental pathway that culminates in the formation of dormant structures known as turions. Levels of the mRNA encoding d-myo-inositol-3-phosphate synthase (EC.5.5.1.4) which converts glucose-6-phosphate to inositol-3-phosphate, increase early in response to ABA. In order to understand the role of this enzyme in turion formation, we have investigated changes in inositol metabolism in ABA-treated plants. Here, we show that ABA-treatment leads to a 3-fold increase in free inositol, which peaks 2 d after treatment. This increase is followed by sequential increases in inositol phosphates and in accumulation of inositol hexakisphosphate (InsP₆), in particular. In addition, we observed an early increase in a novel inositol bisphosphate which is not directly on the pathway to InsP₆. In control plants, we observed synthesis and turnover of both inositol pentakisphosphate and InsP₆. Two compounds more polar than InsP₆ (diphosphoinositol polyphosphates) were present in both ABA-treated and control plants. Together, this suggests that the role of InsP₆ in plants may be more complex than simply that of a storage compound during dormancy. Received: 10 January 2000 / Accepted: 25 February 2000     

Heterogeneity of dormancy in the turions of Spirodela polyrrhiza

Spirodela polyrrhiza exhibits at least two different types ofdormancy in turions induced by nitrogen deficiency, i.e., Y(young)- and O (old)-type turions produced at early and latestages in the formation process, respectively. On the otherhand, turions induced by relatively low temperature are mainlythe Y type. O-type turions germinate rapidly under darkness with the additionof NO₃-. However, under semi-anaerobic and anaerobic conditionsthey germinate only when exposed to light in the presence ofNO₃-. Y-type turions germinate in air after a definite dormant periodonly under light and in the presence of NO₃-. The dormancy isbroken by light regardless of the presence of NO₃-, althoughthe germination phase requires both. This dormancy is also brokenwhen a definite period of darkness is given in the absence ofNO₃-, and the germination proceeds in the presence of NO₃- withor without light. Thus, an alternative process exists for theY type in which the dormancy is released by either light ordarkness. (Received October 3, 1978; )     

虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)Vasa基因的克隆与表达

Vasa基因是DEAD-box家族成员中的一种ATP依赖的RNA解旋酶编码基因,在生殖系分化过程中发挥重要作用。采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从虾夷马粪海胆精巢中克隆得到Vasa基因3′端cDNA序列。该3′末端cDNA长1057bp,与太平洋牡蛎、紫球海胆、非洲爪蟾、小鼠及虹鳟经同源进行比对,其中与紫球海胆的同源率最高达到95%,并确定其为DEAD-box家族的Vasa亚家族成员。利用实时定量RT-PCR检测Vasa mRNA在虾夷马粪海胆组织和胚胎发育期的表达情况,研究结果表明Vasa基因在生殖腺表达量最高,雌、雄个体生殖腺中转录水平上的表达差异明显,雄性高于雌性,差异显著(P<0.05),在肠、体腔液、肌肉、围口膜、管足中表达量低,其中体腔液表达量最低。胚胎发育期检测发现Vasa基因在16细胞期时表达量最高,16细胞期后表达量呈下降趋势,囊胚期表达量最低。试验结果为虾夷马粪海胆生殖系统起源、分化研究提供科学依据。对于虾夷马粪海胆生殖系分化途径来讲,Vasa可作为一种有利的研究工具,追溯其生殖系的起源和分化。     

Cloning and Structure Analysis of rbcS Gene from Wild Soybean

About 1 kb fragment of rbcS (ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase small subunit) gene in wild soybean (Glycine soja, Ji 50017) was amplified from total DNA by PCR assay. Sequence analysis of the fragment indicated that 1089 bp sequenced included the whole coding region for Rubisco small snbunit. The rbcS gene in wild soybean encoded a precursor composed of a transit peptide of 55 amino acids and a mature protein of 123 amino acids. There were two introns found in the rbcS gene as other dicotyledonous species previously sequenced. Comparison of DNA sequences showed high degree homology of rbcS genes between wild soybean and cultivated soybean (Glycine max var. wayne). Some changes of amino acids emerged from the diverse nucleotides did not affect the function of the small subunit. These results may contribute some basic data in molecular biology to study the origin and evolution of soybean.     

中华大蟾蜍Mest基因的cDNA克隆和表达分析

Mest基因是一种印记基因,在人、小鼠以及其他的哺乳动物和有花植物中都有研究报道。为了更好地研究该基因的功能和进化特点,利用RACE法获得了中华大蟾蜍Mest基因(BgMest)的cDNA全长序列(1 325 bp),它包含一个完整的ORF,可编码326个氨基酸的多肽(GenBank登陆号:ABQ10905)。多肽链中包含一个典型的α/β水解酶折叠结构域,其在氨基酸水平上与热带爪蟾和一些哺乳动物分别存在86%和70%～80%的相似性。进化树分析显示Mest基因为单系起源。RT-PCR显示,BgMest基因在精巢、卵巢、肝、肾、脑、胃和肺中都有表达,并且该基因在序列、表达模式以及蛋白产物的高级结构的高度保守性都说明它在两栖类生物中是保守的。但是在对哺乳动物以及一些脊椎动物的印记基因进行进化分析时,发现它们具有不同的起源。     

悬钩子属植物肌动蛋白基因片段的克隆与表达

目的:克隆悬钩子属植物肌动蛋白基因(actin),为研究该物种中其他基因的表达和调控提供内标基因.方法:利用一对特异性引物从黑莓、悬钩子杂种和树莓品种中克隆actin cDNA片段,对其进行序列分析和半定量RT-PCR表达分析.结果:从3个品种中均获得一条783 bp actin cDNA片段,编码260个氨基酸,3条actin片段与其他植物核苷酸序列的同源性都在82%以上,与其他植物氨基酸序列同源性也均在95%以上;树莓和悬钩子杂种品种的actin核苷酸和氨基酸序列同源性均达99%,系统进化分析也发现两者亲缘关系较近些;表达分析发现actin基因在各品种不同组织中均有一定的表达量.结论:首次克隆了悬钩子属植物肌动蛋白基因actin,将来自黑莓和树莓品种的序列登录在GenBank,登录号分别为HQ439556和HQ439557.     

水牛MyD88cDNA的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞总RNA中扩增出髓样分化因子88 (mydoid differentiation factor 88,MyD88) cDNA序列,PCR产物分离纯化后,与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析;构建pET28a-MyD88表达载体,并将其转化至E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、镍柱亲和层析纯化和Western blotting分析.结果显示,克隆到的水牛MyD88 cDNA全长为1 189 bp,含有1个891 bp的开放阅读框,编码296个氨基酸,理论等电点为5.65.经IPTG诱导表达后,得到一个带His·Tag的约39 kD的重组融合蛋白.用抗His单克隆抗体进行Western blotting,得到1条约39 kD特异性抗体结合带,表明水牛MyD88原核表达载体成功构建并表达.本研究为进一步开展水牛MyD88的结构功能分析奠定了基础.