丙型肝炎病毒Core与NS3基因的不同融合方式及其表达

丙型肝炎病毒(简称ＨＣＶ)是危害人类健康的传染性疾病,预防该病的传播主要借助于ＨＣＶ血清学诊断来筛选献血员和检测临床标本。从国内外已分离到的ＨＣＶ株得知,ＨＣＶ核心蛋白(Ｃｏｒｅ)和非结构蛋白ＮＳ3含有较强的优势抗原表位,其相应的抗体出现早,阳性率高,已成为目前第二、第三代ＨＣＶ免疫诊断试剂的重要成份[1,2]。通常Ｃｏｒｅ蛋白和ＮＳ3蛋白分别用基因工程方法表达,然后作为固定化抗原,检测人体内ＨＣＶ的抗体。我们对Ｃｏｒｅ和ＮＳ3的两种不同组合方式及其表达的研究,对于发展新的ＨＣＶ诊断试剂很有帮助,现将结果报道如下。1…     

寨卡病毒IgG抗体间接ELISA检测方法的初步建立

初步建立了寨卡病毒(Zika virus)IgG抗体的间接ELISA检测方法,为开发相应的血清学诊断试剂提供理论依据。选取寨卡病毒四种抗原,即E蛋白胞外区(Ectodomain)、NS1蛋白、C蛋白和rEⅢ蛋白进行重组表达和纯化,分别包被ELISA板并用间接法检测寨卡病人临床血清和正常人血清,确定每种检测抗原的检测敏感度和特异度。重组表达并纯化的四种寨卡病毒抗原浓度和纯度均达到检测要求。间接ELISA检测结果显示E蛋白胞外区和NS1蛋白的检测敏感度和特异度均达到较高水平,但C蛋白和rEⅢ蛋白的检测敏感度很低,不适合作为寨卡病毒的检测抗原。本研究初步评价了寨卡病毒四种抗原检测相应IgG抗体的敏感度和特异度,为研制血清学诊断试剂奠定了基础。     

融合表达DEC205单链抗体和NS3蛋白的HCV DNA疫苗的免疫原性研究

为研发新型HCV DNA疫苗并探讨优化其免疫原性的策略,我们分析靶向树突状细胞(Dendritic cells,DC)的分子对HCV DNA疫苗免疫原性的影响。我们基于抗小鼠DC细胞表面分子DEC205/CD205的单克隆抗体DEC205的单链分子,构建可单独表达DEC205单链抗体或者与HCV非结构蛋白NS3融合表达的DNA表达质粒,并构建单独表达HCV非结构蛋白NS3的DNA表达质粒;经瞬时转染法鉴定HCV NS3及其与DEC205单链抗体融合蛋白的表达;随后采用注射结合电转的方式免疫Balb/C小鼠并研究各疫苗的体液(NS3特异性IgG抗体)与细胞免疫(IFN-γELISPOT)效果。结果表明:DEC205单链抗体基因与HCV NS3编码基因的融合可显著增强NS3特异的免疫应答;采用皮内注射加卡钳电极电转的方式可以产生最强的NS3特异性抗体和T细胞免疫反应。因此,通过DEC205单链抗体与HCV DNA疫苗靶抗原融合可明显增强免疫应答效果。该策略为HCV及其他类似病原的新型DNA疫苗研制提供重要依据。     

表达丙型肝炎病毒NS3抗原的重组腺病毒构建及体外表达

为探索研制丙型肝炎疫苗的新途径,以期获得防治丙型肝炎的重组腺病毒减毒活疫苗,我们构建了表达丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus ,HCV)非结构蛋白3(non-structural protein 3,NS3)抗原的重组腺病毒RAd-NS3,并检测其在体外表达.应用PCR从真核表达质粒pRC/NS3中扩增编码HCV NS3 蛋白(329-935aa)的基因片段,定向克隆到重组腺病毒AdEasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带HCV NS3基因的重组腺病毒基因组质粒pAd-HCV NS3,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒RAd-NS3,利用它有效地感染人肝癌细胞株HepG2,经RT-PCR及免疫印迹等不同方法检测表明,被感染细胞能表达HCV NS3蛋白,为后续进行重组腺病毒在动物体内诱导抗HCV免疫应答能力的研究奠定了基础.     

表达丙型肝炎病毒(HCV)截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性与保护效果分析

为研发安全广谱有效的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)T细胞疫苗,本研究构建了表达HCV截短型非结构蛋白3(Nonstructural protein 3,NS3)与核心蛋白(core)融合抗原的重组腺病毒疫苗。体外免疫荧光及蛋白印迹实验表明该融合抗原可有效表达;小鼠免疫结果表明该重组腺病毒疫苗除了激发抗原特异的抗体反应外,还可激发较强的针对NS3抗原特异的T细胞免疫应答。该T细胞免疫应答主要表现为IFN-γ+与TNF-α+CD4+T细胞亚群。采用异型(JFH1,2a型)HCV重组痘病毒接种小鼠进行保护效果分析,与对照组相比,表达截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗2针免疫后可产生明显的交叉免疫保护。本研究为进一步研究HCV免疫保护机制及新型疫苗研制提供了参考。     

猪瘟病毒NS2-3抗原集中区基因的原核表达及鉴定

为获得猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV) NS2-3抗原集中区蛋白,并建立CSFV抗体快速检测方法.本研究以CSFV全长基因组质粒为模板,PCR扩增NS2-3抗原表位集中区,利用扩增片段和克隆载体,构建重组表达质粒,命名为pET32a-NS2-3-1.重组表达质粒转化Rosetta (DE3)细胞,利用IPTG诱导表达, SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定重组表达产物.结果表明,重组质粒pET32a-NS2-3-1在28℃诱导5 h得到高效表达,重组蛋白能够与兔抗CSFV阳性血清发生反应.获得CSFV NS2-3抗原集中区蛋白,并且获得的重组蛋白具有抗原性,能够作为CSFV抗体检测的抗原.     

截短的HCV NS3蛋白的表达、纯化及应用

目的:为了发展新一代HCV检测试剂盒,使包被的NS3蛋白能提高其检测的精确度与准确度.方法:通过生物信息学方法选定目标蛋白为HCV1263a.a～1583a.a,应用PCR方法克隆出编码此部分NS3蛋白的DNA序列,连接到表达载体pQE30构建重组子pQNS3,转化工程菌株JM109后诱导表达,表达产物通过Western-blot实验证实,用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱纯化,采用ELISA方法检测纯化的蛋白在免疫检测中的应用.结果:工程菌株在IPIG诱导下表达出N端含6个组氨酸的NS3融合蛋白,分子量约为36kDa,利用纯化的目标蛋白对40份HCV抗体阳性参考品,蛋白检测的符合率为77.5%(31/40);对40份阴性参考品,检测符合率为97.5%(39/40).结论:表达的NS3融合蛋白,具有很好的应用价值,可以应用于新一代HCV检测试剂盒以及对NS3蛋白功能的研究.     

表达丙型肝炎病毒NS3抗原的重组腺病毒构建及体外表达

为探索研制丙型肝炎疫苗的新途径,以期获得防治丙型肝炎的重组腺病毒减毒活疫苗,我们构建了表达丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus ,HCV)非结构蛋白3(non structural protein 3,NS3)抗原的重组腺病毒RAd NS3,并检测其在体外表达。应用PCR从真核表达质粒pRC/NS3 中扩增编码HCV NS3 蛋白(329-935aa)的基因片段,定向克隆到重组腺病毒AdEasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带HCV NS3基因的重组腺病毒基因组质粒pAd HCV NS3,转染293 细胞,成功包装出重组腺病毒RAd NS3,利用它有效地感染人肝癌细胞株HepG2,经RT PCR及免疫印迹等不同方法检测表明,被感染细胞能表达HCVNS3蛋白,为后续进行重组腺病毒在动物体内诱导抗HCV免疫应答能力的研究奠定了基础。     

HCV全长基因真核表达载体的构建及其细胞内表达

本实验成功构建了HCV全长基因的真核表达载体pCI-HCVFL,转染HepG2细胞后经免疫荧光和免疫组化法分别检测到结构基因区(C)和非结构基因区(NS3)病毒蛋白的表达,该栽体可用于建立HCV转基因细胞模型以及进一步开展有关HCV复制与表达的深入研究.     

HCV核心蛋白诱导Cos-7细胞凋亡

将丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(Core)基因的全长序列插入到真核表达载体pCDNA3 CMV启动子下游,构建真核表达载体pCDNA3-Core,用脂质体LipoVecTM转染Cos-7细胞系进行瞬时表达;DNA转染24h后用免疫斑点试验检测在细胞中表达的Core蛋白;转染72h后用Hoechst染色和DNA Ladder检测Cos-7细胞的凋亡情况;荧光染色观察到了细胞凋亡核碎裂,琼脂糖凝胶电泳也呈现出180-200bp整数倍的梯形带,呈现典型的细胞凋亡特征.这些结果表明HCV Core蛋白的表达能引起Cos-7细胞凋亡,Core蛋白的这种功能可能在HCV的持续感染过程中起着一定的作用.     

编码区和非编码区SSR标记对水稻类群的比较研究

设计14对水稻编码区SSR引物和选取已公布的非编码区SSR引物12对、编码区SSR引物3对,采用SSR技术,对29个标记在60个水稻材料中的多态性进行分析。结果表明,编码区SSR标记平均检测到3.59个多态性位点,多态信息量PIC(polymorphism information conten)在0.032～P0.853之间,平均值为0.447;非编码区SSR标记平均检测到3.92个多态性位点,PIC在0.063～P0.795之间,平均值为0.521。聚类分析显示,非编码区SSR标记能更加精确地区分来自不同地区的水稻类群,编码区SSR标记也具有良好的多态性,同样可以用于分析水稻的亲缘关系。     

Mayr on the Polynesian Region

[Borders and Subdivisions of the Polynesian Region, as based on our Knowledge of the Distribution of Birds, pp. 191–195. The Origin and History of the Bird fauna of Polynesia, pp. 197–216. By Ernst Mayr. Proc. Sixth Pacific Science Congress, held at Berkeley, Wis., in July and August 1939, vol. iv.]     

The Greater Cape Floristic Region

Aim The Cape Floristic Region (CFR) (Cape Floristic Kingdom) is currently narrowly delimited to include only the relatively mesic Cape fold mountains and adjacent intermontane valleys and coastal plains. We evaluate the floristic support for expanding the delimitation to include the whole winter‐rainfall area (arid and mesic climates) into a Greater CFR. Location Southern Africa, particularly the south‐western tip. Methods The initial divisive hierarchical classification analysis twinspan used the presence/absence of vascular plant genera to obtain major floristic groupings in southern Africa. For the more detailed analyses, we scored the flora as present/absent within a set of centres, among which the floristic relationships were investigated (agglomerative methods, upgma and minimum spanning trees). These analyses were conducted with species, genera and families separately. The centres were grouped into five regions. The species richness and endemism was calculated for the centres, regions and combination of regions. The dominant floristic components of each region were sought by calculating the percentage contribution of each family to the flora. Results The divisive method showed that the winter‐rainfall areas are floristically distinct from the rest of southern Africa. The species‐ and generic‐level analyses revealed five regions: CFR, Karoo Region, Hantam‐Tanqua‐Roggeveld Region, Namaqualand Region and Namib‐Desert Region. The CFR has the highest endemism and richness. However, the combination of the CFR, the Hantam‐Tanqua‐Roggeveld Region and the Namaqualand Region results in a higher total endemism. Combined, these three regions almost match the region delimited by the twinspan analysis, and together constitute the Greater CFR. Main conclusions The CFR constitutes a valid floristic region. This is evident from the endemism and the distinctive composition of the flora. However, the total endemism is higher for the whole winter‐rainfall area, and this supports the recognition of the larger unit. If floristic regions are to be delimited only on endemism, then the Greater CFR is to be preferred. If floristic regions are delimited on the composition of their floras at family level, then the support for such a grouping is weaker.     

Pluripotenzerscheinungen in der Region der Rachendachhypophyse

Ohne ZusammenfassungAnm. Die Arbeit wurde durch die Bereitstellung von Mitteln der Notgemeinschaft Deutscher Wissenschaft gefördert.