韭菜细胞溶质超氧化物歧化酶的纯化和性质

经硫酸按沉淀、SephadexG－200凝胶过滤和DEAE－Sephacel层析3个步骤,将韭菜细胞溶质SOD纯化到均一程度。从500g叶片中得到2·4mm酶,酶比活力达13000U／mm蛋白。鉴定该酶是Cu·Zn—SOD。测得酶分子量约为30900道尔顿,亚基分子量约为15900道尔顿,N一末端氨基酸为丙氨酸。该酶在紫外与可见光区吸收峰分别在260urn和680urn。实验表明该酶热稳定性良好。     

近江牡蛎铜锌超氧化物歧化酶的纯化及部分性质研究

经６５℃加热,硫酸铵分级沉淀,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤和ＤＥ－５２柱层析,从近江牡蛎（ＯｓｔｒｅａｒｉｖｕｌａｒｉｓＧｏｕｌｄ）软体部分提纯了铜锌超氧化物歧化酶（Ｃｕ,Ｚｎ－ＳＯＤ）．对其理化性质鉴定表明,用此法纯化的酶纯度均一．该酶系由两个相同亚基组成的二聚体,分子量２７．９ｋＤ．该酶的紫外吸收峰在２７２．５ｎｍ,红外光谱表现出其氨基酸组成特征,与猪血ＳＯＤ存在差异．该酶在不同的升温速率下及经不同浓度的Ｈ２Ｏ２处理后的稳定性与猪血ＳＯＤ不同．其氨基酸组成与不同来源的同类酶存在差异．     

狗肝铜锌超氧化物歧化酶的纯化

本文采用加热、硫酸铵分级沉淀和柱层析的方法,从狗肝中提纯了铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD),并对其理化性质进行了鉴定。结果表明酶的纯度均一。与文献报道的不同来源的同类酶相同,狗肝Cu·Zn-SOD系由两个相同亚基组成的二聚体,每分子晦蛋白合有两个铜和两个锌原子。分子量33.6kD,N-末端氨基酸为丙氨酸。     

铜离子螯合亲和层析纯化人铜锌超氧化物歧化酶

用铜离子螯合亲和层析对人红细胞铜锌超氧化物歧化酶进行了纯化．3次实验的结果表明,此项层析具有重复使用率高和蛋白结合量大的显著优点．提纯的人铜锌超氧化物歧化酶的比活性为3037U每毫克蛋白,并经活性染色和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳证实其纯度均一．纯化中,探索了用紫外260nm与280nm的A比值判断酶纯度的简便方法．     

何首乌叶铜锌超氧物歧化酶纯化及性质

何首乌（ＰｏｌｙｇｏｎｕｍｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍＴｈｕｎｂ．）叶Ｃｕ·ＺｎＳＯＤ经硫酸铵盐析、离子交换柱层析及葡聚糖凝胶过滤等步骤,被分离成两组ＳＯＤ同工酶（ＳＯＤ１,ＳＯＤ２）,它们被纯化到均一程度。ＳＯＤ１分子量为３２．４ｋＤ,亚基分子量为１６．２ｋＤ,最适ｐＨ值为５０,在６０℃和６５℃时的半衰期分别为１４ｍｉｎ和８ｍｉｎ;ＳＯＤ２分子量为３０５ｋＤ,亚基分子量为１５９ｋＤ,最适ｐＨ值为６０,在６０℃和６５℃时半衰期分别为３２ｍｉｎ和１６ｍｉｎ,它由２７４个氨基酸残基组成,不含Ｃｙｓ、Ｔｙｒ和Ｔｒｙ。ＳＯＤ１和ＳＯＤ２每ｍｏｌ酶都含有２ｍｏｌＣｕ和２ｍｏｌＺｎ,它们在紫外区最大吸收波长均为２７５ｎｍ。     

金属螯合亲和层析纯化和复性重组人铜锌超氧化物歧化酶

将重组人铜锌超氧化物歧化酶（rhCu,ZnSOD）包含体（经纯化后纯度达80％以上）以稀释法或透析法初步复性后,分别再经金属螯合亲和层析（MCAC）纯化。结果透析复性样品和稀释复性样品经MCAC纯化后的rhSOD比活是各自上柱前样品比活的2.2倍和5.3倍,蛋白回收率分别为64％和25％,同时两者活性回收率皆大于130％。表明目标蛋白rhSOD在经过MCAC纯化的同时又获得进一步复性。SDS-PAGE显示rhSOD为19kD的单一条带,纯度大于95％,比活达到5000 u/mg左右,同时NBT生物活性染色鉴定显示出很强的超氧化物歧化酶活性。表明MCAC对于复性不完全的rhCu,ZnSOD而言是一种纯化和使其进一步复性的简便省时且有效的方法。该方法为以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化和复性提供了新思路。     

苏云金杆菌超氧化物歧化酶的纯化和性质研究

苏云金杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）９１６５超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）,经硫酸铵分级沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＦ－１００凝胶过滤及非变性凝胶电泳（ＰＡＧＥ）三步纯化,纯酶比活力为４３８８ｕ／ｍｇ,属Ｍｎ－ＳＯＤ,分子量为４７．９ｋｕ,由二个亚基组成,含１９种氨基酸。     

羊血铜锌超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)的分离纯化

目的:对羊血进行提取SOD。方法:采用有机溶剂去除血红蛋白、热变性、丙酮沉淀、DEAE-32离子交换柱层析的方法,对羊红细胞Cu,Zn-SOD进行分离纯化。利用非变性凝胶电泳NBT活性染色鉴定SOD,SDS-PAGE测定分子量。结果:表明1 000ml羊血中得到SOD干粉1 257mg,总活力为79 453U,比活力为3 871.4U/mg。活性染色结果证明羊血SOD有2条带,表明已达到电泳纯。SDS-PAGE测得SOD亚基分子量分别为16.71kDa、15.97kDa。H2O2对羊血CuZn-SOD活性有抑制作用,通过紫外光谱扫描,羊血SOD在231nm处有最大吸收峰。     

金属螫合亲和层析纯化和复性重组人铜锌超氧化物歧化酶

将重组人铜锌超氧化物歧化酶（rhCu,Zn-SOD）包含体（经纯化后纯度达80％以上）以稀释法或透析法初步复性后,分别再经金属螯合亲和层析（MCAC）纯化。结果透析复性样品和稀释复性样品经MCAC纯化后的rhSOD比活是各自上柱前样品比活的2．2倍和5．3倍,蛋白回收率分别为64％和25％,同时两者活性回收率皆大于130％。表明目标蛋白rhSOD在经过MCAC纯化的同时又获得进一步复性。SDS-PAGE显示rhSOD为19kD的单一条带,纯度大于95％,比活达到5000u／mg左右,同时NBT生物活性染色鉴定显示出很强的超氧化物歧化酶活性。表明MCAC对于复性不完全的rhCu,Zn-SOD而言是一种纯化和使其进一步复性的简便省时且有效的方法。该方法为以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化和复性提供了新思路。     

猕猴桃果实细胞中超氧化物歧化酶的纯化及性质研究

本文采用硫酸铵盐析、Sephadex G-100、DEAE-纤维索层析,首次从猕猴桃果实细胞中提纯了超氧化物歧化酶。并从不同角度鉴定了酶制备物的纯度,认为它达到均一程度,酶比活力为每毫克蛋白质1340单位;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳为一条带,氨基酸末端为丙氨酸;酶亚基含氨基酸16种,大约由157种氨基酸残基组成;紫外可见光区最大吸收峰分别为270nm和676nm,同时,用金属Co和Zn对CuZn—SOD中金属离子进行了取代研究。     

铜锌超氧化物歧化酶的重组研究——Ⅰ.铜锌的去除和重组

在制备去Cu、Zn的酶蛋白方法上作了改进并提出新的制备途径,在此基础上对牛红细胞铜锌超氧化物歧化酶进行金属辅基去除和重组研究。通过对酶活性、吸收光谱、圆二色谱和电子自旋共振波谱变化的观察,比较系统地探究了天然酶(Holo-SOD),去Cu、Zn后的酶蛋白(Apo-SOD)和加入Cu~(2+)、Zn~(2+)重组后的酶(Reco-SOD)的性质,以及Cu和Zn对酶活性及功能方面的作用,其主要结果有以下几点:1.用改进法制备去除Cu、Zn的酶蛋白样品可以避免EDTA-Cu~(2+)络合物的污染,残存酶活力仅为天然酶的0.4%,在pH3.8～4.2条件下,加入Cu~(2+)、Zn~(2+)重组后,不仅酶活性可以恢复到98%,而且其UV、CD和ESR图谱均可以恢复到天然酶的状态。2.Cu为酶催化活性所必需。当过量的Zn~(2+)先加入酶蛋白中,然后再补加Cu~(2+),重组酶的活力恢复有所下降。而Zn~(2+)和Cu~(2+)单独加到酶蛋白中去时,Zn~(2+)对酶蛋白的UV图谱没有影响,Cu~(2+)则引起UV吸收大幅度上升。3.同时去除Cu、Zn后的酶蛋白(E_2E_2-SOD)比单独只去Cu后的酶蛋白(E_2Zn_2-SOD)的重组恢复更加困难。     

北京鸭红细胞铜锌超氧化物歧化酶电荷异构体的分离和某些性质

等电聚焦表明,北京鸭红细胞铜锌超氧化物歧化酶由等电点分别为５．０,５．３,５．９,６．１和６．５的五个主要的活性组分（电荷异构体）构成,利用分析型聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳进行电荷异构体的制备级分离,采用三氯乙酸沉淀法快速确定蛋白条带的位置,电渗洗脱法回收蛋白,获得其中两个电荷异构体,对比研究结果表明电荷异构体的活性,氨基酸组成,二级结构等性质无明显差异。     

北京鸭红细胞铜锌超氧化物歧化酶电荷异构体的分离和某些性质

等电聚焦表明,北京鸭红细胞铜锌超氧化物歧化酶由等电点分别为５．０,５．３,５．９,６．１和６．５的五个主要的活性组分（电荷异构体）构成,利用分析型聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电流泳进行电荷异构体的制备级分离,采用三氯酸沉淀法快速确定蛋白条带的位置,电渗洗脱法回收蛋白,获得其中两个电荷异构体,对比研究结果表明电荷异构体的活性,在酸组成,二级结构等性质无明显差异。     

人铜锌超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的融合表达与纯化

目的:在大肠杆菌中表达并纯化人铜锌超氧化物歧化酶(HuSOD1)。方法:合成HuSOD1编码基因,PCR扩增后连入pMAL-p5x质粒构建融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,IPTG诱导表达,NBT法测定HuSOD1酶活,利用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱纯化MBP-HuSOD1融合蛋白,经因子Ⅹa酶切及分子筛柱层析纯化HuSOD1蛋白。结果:构建了pMAL-p5x-HuSOD1表达载体,在大肠杆菌中实现了高表达,目的蛋白占全菌蛋白的30%,其中可溶性表达占63%,具有超氧化物歧化酶活性;通过亲和层析纯化得到纯度大于95%的融合蛋白MBP-HuSOD1,经因子Ⅹa酶切后纯化得到纯度约90%的HuSOD1蛋白。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得有活性的MBP-HuSOD1,经进一步酶切、纯化后得到HuSOD1。     

韭菜叶绿体超氧化物歧化酶纯化及性质研究

经硫酸铵沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００凝胶过滤和ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ层析３个步骤将韭菜叶绿体ＳＯＤ纯化到均一程度。鉴定该酶是Ｃｕ．Ｚｎ－ＳＯＤ,测得其分子量约３２０００Ｄ,亚基分子量约为１６２００Ｄ,Ｎ－末端氨基酸为Ａｌａ。该酶在紫外与可见光区的吸收峰分别在２６５ｎｍ和６７５ｎｍ。实验表明该酶热稳定性良好。     

血清锰和铜锌超氧化物歧化酶活力测定

超氧化物歧化酶(SOD)是催化超氧自由基歧化反应的一类金属酶。人体内存在Mn-SOD和Cu,Zn-SOD。目前测定SOD活力方法有化学比色法和化学发光法等。化学发光法测定Cu,Zn-SOD灵敏度最高,但应用于Mn-SOD活力测定,灵敏度很低,且需昂贵试剂和仪器。比色法灵敏度低,尚不能准确测定血清SOD活力。我们采用核黄素光照产生的超氧自由基与羟胺反应,建立了测定SOD活力新方法。该法灵敏度高,重复性好,能检测血清Mn-SOD和Cu,Zn-SOD活力,现将方法报告如下。