华北大黑鳃金龟幼虫血细胞的超微结构观察

应用光学和电子显微镜技术检查了华北大黑鳃金龟3龄幼虫血淋巴内的血细胞,识别出5种类型的血细胞(原血胞、浆血胞、颗粒血胞、珠血胞和凝血胞)并对每一种血细胞的超微结构特点进行描述。     

华北大黑鳃金龟幼虫对3种寄主植物根系分泌物的趋性反应

华北大黑鳃金龟幼虫是我国北方地区为害植物根系的重要土壤害虫,探索寄主根系分泌物对其引诱作用,可以为开发大黑鳃金龟幼虫引诱剂等绿色防控提供理论基础.以纯净空气作为对照,利用“Y”型嗅觉仪分别测定了3龄幼虫对花生、大豆、玉米根系的趋性反应.以正己烷为对照,采用GC-MS分析鉴定3种根系分泌物的成分,观测试虫对其主要成分的嗅觉反应.结果表明: 华北大黑鳃金龟幼虫对花生、大豆和玉米根系都具有显著的趋向性.通过GC-MS分析鉴定发现,根系分泌物主要成分在3种植物中均有20种及以上,而且在不同植物之间除丙三醇、十二醇和乙苯3种共有组分之外,其余组分存在明显差异.分泌物的趋性反应结果显示,供试幼虫对分泌物同一组分不同浓度的趋性反应程度明显不同.在浓度为40和80 μg·mL^-1时,2-丁烯酸、甲基丁二酸、肉豆蔻酸、乙酸和邻苯二甲酸等的引诱虫数显著多于对照;在浓度为100、200 μg·mL^-1时,化合物十四烷和十六烷等的引诱虫数显著多于对照.在浓度为300、500 μg·mL^-1时,供试幼虫对对二甲苯、邻二甲苯和棕榈酸甘油酯等有显著的趋向性反应.可见,植物根系分泌物的主要成分对华北大黑鳃金龟幼虫具有显著的引诱作用.     

东北与华北大黑鳃金龟分类地位的研究（鞘翅目：鳃角金龟科）

采用RAPD技术和杂交方法对东北大黑鳃金龟（Holotrichia diomphalia Bates1888)和华北大黑鳃金龟（H.oblita(Faldermann1935)的分类地位进行了研究。作者应用40条引物,采用UPDGA法对华北大黑的南京和文登种群。东北大黑的沈阳种群。以及其外群矮臀鳃金龟（H.ernesti Reitter)进行了RAPD分析。所建立的系统发育树显示,东北大黑具有与华北大黑两个地理种群相同的分类地位。同时,作者对两种金龟甲进行了正反交的杂交试验。试验共得到21头正交F1代成虫,3头反交F1代成虫,F1代生活正常,采用东北大黑与F1代回交的方法研究F1代的可育性,2001年6月10日的检查结果显示,四个处理均得到大量回交杂种一龄幼虫和少量二龄幼虫,F1代的雌雄虫均具有正常的生殖力。以上结果表明;两种金龟的次异名。为无效名。     

华北大黑鳃金龟对桃树挥发物的电生理反应

【目的】华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita是一种分布范围广,寄主种类多的农业害虫。本研究鉴定了桃树顶空挥发物中对华北大黑鳃金龟雌虫具有触角电生理活性的化合物,并探索桃树挥发物活性成分的剂量对华北大黑鳃金龟雌、雄虫触角电生理反应的影响。【方法】采用顶空吸附法收集桃树枝叶挥发物,用气相色谱 触角电位联用技术(GC-EAD)和气相色谱 质谱联用技术(GC-MS)鉴定有电生理活性的桃树挥发物成分,最后用触角电位(electroantennograph, EAG)技术测试这些挥发物在0.01,0.1, 1, 10和100 μg剂量下引起的华北大黑鳃金龟雌、雄成虫EAG反应。【结果】桃树挥发物中能引起华北大黑鳃金龟雌成虫触角电生理反应的成分有7种,包括Z-β-罗勒烯、顺-3-己烯乙酸酯、顺-3-己烯醇、壬醛、水杨酸甲酯以及2种未知化合物。所测试的对华北大黑鳃金龟雌成虫触角具有电生理活性的5种桃树挥发物成分在各剂量下都能引起雌、雄成虫明显的EAG反应。雌、雄虫对同种物质的EAG反应随着剂量的增加而有增大的趋势,并且雌虫的EAG反应显著高于雄虫。【结论】桃树挥发物中,罗勒烯、顺-3-己烯乙酸酯、顺-3-己烯醇、壬醛、水杨酸甲酯均能引起华北大黑鳃金龟雌、雄成虫的剂量依赖性的触角电生理反应,而且存在显著的性别差异。可利用这些化合物开展行为反应和田间诱集试验,进一步验证其对华北大黑鳃金龟的引诱活性。     

酵母双杂交筛选华北大黑鳃金龟触角均一化cDNA文库

昆虫错综复杂的嗅觉系统在昆虫寻找寄主、 交配、 产卵以及逃避行为中起到了至关重要的作用。因此, 对昆虫嗅觉感受机理的研究将有助于揭开昆虫感受和识别环境中的气味物质并引起相关行为反应的秘密。为了更多地了解华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita Faldermann 嗅觉相关蛋白互作机制, 本实验利用DUALhunter Starter Kits酵母双杂交筛选试剂盒, 构建了华北大黑鳃金龟气味结合蛋白OBP2诱饵载体, 筛选了华北大黑鳃金龟触角酵母双杂交系统均一化的cDNA文库。通过β-半乳糖苷酶活性检测以及GenBank中Blast比对分析, 以OBP2为诱饵鉴定出6个阳性互作物。我们推测其中的一种较强的阳性互作物凝固酶原可能是华北大黑鳃金龟在嗅觉识别过程中的相关蛋白。     

华北大黑鳃金龟引诱剂配方筛选及引诱效果评价

【目的】筛选可有效引诱华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita成虫的引诱剂配方用于生态防控。【方法】选取5种植物挥发物、2种华北大黑鳃金龟聚集信息素和1种性信息素,根据各化合物单体最佳引诱浓度进行两两混配,得到植物挥发物+聚集信息素、植物挥发物+性信息素和聚集信息素+性信息素共17种二元引诱剂配方。通过触角电位(EAG)反应和趋性行为反应逐步筛选出引诱效果较好的配方。将所筛选配方与其单一组分通过趋性行为反应进行引诱效果比较,并通过室内笼罩诱捕检验配方对华北大黑鳃金龟成虫的引诱效果。【结果】通过EAG反应及趋性行为反应从17种二元引诱剂配方中逐步筛选出了对华北大黑鳃金龟成虫具有较强引诱作用的3种配方,即顺-3-己烯基乙酸酯+顺-9-十八烯乙酸酯,1-己醇+顺-9-十八烯乙酸酯和邻苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯,它们引起的华北大黑鳃金龟雌虫EAG反应相对值分别为5 981%, 5 796%和5 722%,引起的雄虫EAG反应相对值分别为3 983%, 4 712%和3 809%。趋性行为反应试验中,引起华北大黑鳃金龟成虫选择反应率最高的为配方邻苯二甲酸二丁酯+甘氨酸甲酯,成虫选择反应...     

华北大黑鳃金龟中肠丝氨酸蛋白酶cDNA克隆、 序列分析及表达

丝氨酸蛋白酶是昆虫体内一类重要的消化酶, 为了了解该类酶的分子特性及功能, 本研究利用粉纹夜蛾Trichoplusia ni围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠cDNA表达文库, 首次得到编码华北大黑鳃金龟丝氨酸蛋白酶cDNA序列, 命名为HoSP1（GenBank登录号为FJ573146）。序列分析表明, 该基因长902 bp, 开放阅读框（ORF）长783 bp, 编码260个氨基酸, 推测分子量和pI值分别为26.7 kDa和4.19, 不含有N-糖基化位点, 但在Thr₁₅₇处有一个O-糖基化位点, 含有6个保守的半胱氨酸残基, 组成3对二硫键, 对于维持蛋白质的三级结构起着重要的作用。通过与几种丝氨酸蛋白酶的比对发现, 该酶具有组氨酸（His）、 天冬氨酸（Asp）、 丝氨酸（Ser）催化中心, 与褐新西兰肋翅鳃金龟Costelytra zealandica的14种丝氨酸蛋白酶有明显的相似性, 其中与CzSP3的序列一致性最高, 为52.47%。把该基因与pET21b载体重组后, 进行体外表达, 以BTEE为底物, 测得该酶的活力为0.0378 μmol/mg·min。HoSP1基因的克隆及体外表达为进一步研究该酶在华北大黑鳃金龟体内的表达及功能提供了依据。     

重要地下害虫东北大黑鳃金龟研究进展

东北大黑鳃金龟Holotrichia diomphalia是我国东北地区重要的蛴螬类地下害虫,主要危害麦类、玉米、豆类等大田作物,以及薯类、花生等经济作物。华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita和江南大黑鳃金龟Holotrichia gebleri是华北及江南地区的主要蛴螬类害虫。近年来,传统分类学、杂交实验以及分子生物学的研究都证明,3种鳃金龟是同一个物种的不同地理种群,这些研究成果使东北大黑鳃金龟从一个区域性害虫转变成为分布范围从东北到长江流域的广布害虫。本文综合介绍了东北大黑鳃金龟(包括华北大黑鳃金龟、江南大黑鳃金龟)近二十年来的研究成果,包括分类学、发生规律、防治措施,以及生理生化及分子生物学等,并对东北大黑鳃金龟的综合治理研究进行了展望。     

Bioassays on selection and feeding responses of Holotrichia oblita adults to different plant species

Bioassays on selection and feeding responses of Holotrichia oblita adults to different plant species were conducted both in laboratory and under field conditions. The selection response bioassay showed that the adults were significantly attracted to Ricinus communis. In paired tests of the field cages, more than 60% adults were attracted to R. communis plants, while only 35.55%, 34.45%, 33.35%, and 26.65% were attracted to plants of Glycine max, Arachis hypogaea, Ipomoea batatas, and Gossypium hirsutum, respectively. In the laboratory, the selection response percentage of the adults to R. communis leaves reached up to 93% in the presence of other host plant leaves and still arrived at 70% in the absence of other host plant leaves. Feeding deterrence bioassay showed that the adults preferred to I. batatas leaves with 229.90 ± 4.25 mg leaf consumption and 41.30 ± 5.19 mg faeces excretion after 12 h, followed by the leaves of G. hirsutum and A. hypogaea. The adult did not prefer leaves of R. communi with only 7.10 ± 0.23 mg leaf consumption and corresponding 4.00 ± 0.84 mg fecal excretion. In summary, all experimental results suggested that the attraction of H. oblita adults to R. communi is not triggered for feeding.     

华北大黑鳃金龟两种围食膜蛋白cDNA的分子克隆与序列分析

本文以华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠为材料,依据Stratagene公司文库构建试剂盒方法,构建其中肠cDNA表达文库,该文库滴度为1.9×106 pfu/mL,重组率为99.97%。依据现代免疫学原理,利用棉铃虫Helicoverpa armigera围食膜蛋白多克隆抗体筛选文库,得到两个编码华北大黑鳃金龟围食膜蛋白的cDNA克隆Ho-Peritrophin1与Ho-Peritrophin2,其cDNA长分别为2 385 bp和1 633 bp,在PolyA末端上游各有3个多聚腺苷酸信号序列AATAAA,最长开放阅读框(ORF)分别编码729个和477个氨基酸,与粉纹夜蛾Trichoplusia ni CBP2(chitin binding protein 2)的相似性最高,分别为21.9%和19.1%。结构域分析表明,Ho-Peritrophin1与Ho-Peritrophin2分别具有9个和6个几丁质结合功能域,只含有较少的O-糖基化位点,不含有类粘蛋白结构域。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对两种蛋白的作用位点主要位于几丁质结合功能域(chitin binding domain, CBD)内部,而因受几丁质结合功能域保护,这两种蛋白能够抵抗这些蛋白酶的降解。与正常CBD比较,这两种蛋白C端的CBD只含有4个Cys,只在第1与第3、第4与第5个Cys之间形成两对二硫键,缺少由第2与第6个Cys形成的二硫键。推测其N端还应包括信号肽序列和几丁质结合功能域的未知序列。     

Laboratory evaluation of entomopathogenic fungi against the white grubs,Holotrichia oblita and Anomala corpulenta (Coleoptera: Scarabaeidae) from the field of peanut,Arachis hypogaea

We evaluated the pathogenicity of nine isolates of entomopathogenic fungi, including six isolates of Metarhizium anisopliae, one of Beauveria bassiana, and two of Beauveria brongniartii, against eggs and various larval instars of two scarab-beetle species, Holotrichia oblita and Anomala corpulenta, under laboratory conditions. The fungal isolates differed in pathogenicity. Generally, the isolates were more pathogenic to A. corpulenta than to H. oblita. Some of the isolates prevented egg hatching and caused larval death. Isolates M2-2 and Br5-8 caused 39 and 27% egg mortality, respectively, and produced 23 and 24% viewable fungal-infection rates in H. oblita. Three isolates had no significant effect on egg hatchability. Three isolates (Br5-8, Br232818, and M200614) caused about 40% mortality in H. oblita first instars. In A. corpulenta, all isolates except M200614 caused more than 60% egg mortality, and M2-2, Br232818 and Br5-8 caused egg-infection rates greater than 50%. M2-2 caused 47% infection and 100% mortality in first-instar larvae of A. corpulenta, while Br5-8 and Br232818 yielded over 80% mortality of the larvae. The three most virulent isolates, M2-2, Br232818 and Br5-8, were selected for further bioassays against second- and third-instar larvae. In addition, seven graduated concentrations of a Br5-8 conidial suspension were assayed against H. oblita second instars. Larval mortality was positively correlated with fungal dosage, and the LC₅₀ was 4.49×10⁶ conidia/mL. These three virulent isolates may be used to prevent H. oblita and A. corpulenta larval infestations in field crops.     

昆虫病原线虫Heterorhabditis beicherriana LF品系与Bt HBF-18菌株混用对华北大黑鳃金龟幼虫的防治效果

【目的】明确昆虫病原线虫 Heterorhabditis beicherriana LF品系(LF)与苏云金芽孢杆菌 Bacillus thuringiensis HBF-18菌株(Bt HBF-18)混用后对华北大黑鳃金龟 Holotrichia oblita 幼虫的致病力的协同增效作用,为该害虫的防治提供新的技术措施。【方法】在室内测定了LF在不同使用剂量、不同环境温度及不同土壤湿度条件下对华北大黑鳃金龟7-10日龄幼虫的致病力;通过室内生测测定了Bt HBF-18对LF存活的影响,以及Bt HBF-18与LF两者混用后对7-10日龄华北大黑鳃金龟幼虫的防治效果;同时通过室外盆栽试验测定了两者混用对华北大黑鳃金龟幼虫的防治效果。【结果】华北大黑鳃金龟幼虫死亡率随LF施用剂量和处理时间的增加而升高,其中,侵染期线虫(infective juveniles, IJs)800 IJs/100 μL及以上剂量处理7 d后幼虫死亡率达到了100%;25℃为该线虫侵染的最适宜环境温度;适宜土壤湿度范围为14%~20%,湿度过低或过高都会显著影响其侵染效率。室内生测结果表明, Bt HBF-18处理9 d对华北大黑鳃金龟幼虫的致死中浓度(LC 50 )为 1.44× 10^8 CFU/g土,此浓度对LF的存活基本没有影响。另外,室内生测和室外盆栽试验结果均表明,将LF与Bt HBF-18混用能显著提高对华北大黑鳃金龟幼虫的防治效果,混用后具有不同程度的加成或协同增效作用。室内生测试验中LC 50 Bt+200 IJs/100 μL LF混用处理3 d后,较单独LF和Bt HBF-18处理幼虫死亡率分别提高了约43.07%和36.05%,具有显著的协同增效作用;室外盆栽试验中1/2 LC 50 Bt+1 000 IJs/mL LF, LC 50 Bt+1 000 IJs/mL LF和1/2 LC 50 Bt+1 500 IJs/mL LF均具有协同增效作用,其中1/2 LC 50 Bt+1 500 IJs/mL LF增效作用最佳,较单独LF和Bt HBF-18处理幼虫死亡率分别提高了约38.89%和80.55%。【结论】将昆虫病原线虫LF与Bt HBF-18混用对华北大黑鳃金龟幼虫的防治具有加成或协同增效作用。     

嗜菌异小杆线虫侵染后暗黑鳃金龟和大黑鳃金龟幼虫脂肪体和中肠组织超微结构观察

【目的】探究昆虫病原线虫嗜菌异小杆线虫沧州品系 Heterorhabditis bacteriophora strain Cangzhou侵染对蛴螬脂肪体和中肠的影响,进一步明确其对蛴螬的致病机理。【方法】采用透射电镜技术,观察暗黑鳃金龟 Hololtrichia oblita (Faldermann)和大黑鳃金龟 H. parallela Motschulsky 2龄幼虫被嗜菌异小杆线虫沧州品系侵染后其脂肪体和中肠组织的病理变化。【结果】血腔注射感染期病原线虫嗜菌异小杆线虫沧州品系悬浮液24和48 h后,观察发现暗黑鳃金龟和大黑鳃金龟2龄幼虫脂肪体和中肠的组织结构均按时序逐渐发生变化,起初表现为脂肪球变形或变小,颜色变浅,脂肪体细胞和中肠细胞内质网、线粒体肿胀,中肠微绒毛变形脱落等现象,48 h后包裹脂肪球的膜结构破裂,脂肪体细胞和中肠细胞线粒体破裂,内质网数量减少,中肠微绒毛大量脱落,同时核内染色质大量解离,核膜破裂。【结论】经昆虫病原线虫嗜菌异小杆线虫沧州品系处理后,暗黑鳃金龟和大黑鳃金龟两种金龟甲2龄幼虫脂肪体和中肠细胞均出现明显的病理变化过程,这是嗜菌异小杆线虫高效致死蛴螬的原因之一。本研究可为昆虫病原线虫作为一种生物防治手段在蛴螬的综合防治中更好地发挥作用提供理论依据。     

温度和土壤含水量对青冈栎种子萌发的影响

运用直播法,研究应用人工气候箱控制温度和土壤含水量对野生青冈栎种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明:在12h光照条件下,青冈栎种子在变温为10℃/15℃时,萌发率很低,仅为(12±12.29)%;变温为30℃/35℃时,萌发率达最大,为(81±13.7)%。土壤含水量为30%～40%时,萌发率为(79±15.9)%;土壤含水量为90%～100%时,萌发率为(56.67±19.36)%。青冈栎种子萌发呈现出迅速萌发和推迟萌发的特点;温度对青冈栎幼苗的苗高、叶长和叶宽影响显著,对幼苗的地径、叶片数量影响不显著。恒温下,不同梯度土壤含水量处理对幼苗的苗高、地径、叶长、宽影响不显著。